猪miR-204组织表达及重要靶基因筛选

基于Illumina Hiseq 4000高通量测序技术筛选得到仔猪感染C型产气荚膜梭菌耐受和易感组中显著上调表达的miR-204。为研究miR-204在各组织中的表达,进一步筛选miR-204参与调控仔猪C型产气荚膜梭菌感染的关键靶基因,采用实时荧光定量PCR方法检测了miR-204在7日龄仔猪各组织中的表达,利用MEGA7.0软件对其成熟体序列保守性进行分析,运用TargetScan、miRDB、PicTar软件进行靶基因预测,并用DAVID软件对靶基因进行Gene Ontology和KEGG Pathway通路富集分析,进一步采用qRT-PCR方法对筛选得到的关键靶基因在猪肠上皮细胞(IPEC-J2)中进行靶向关系验证。结果表明,miR-204在7日龄仔猪肾脏、肝脏、胸腺、淋巴、十二指肠和回肠组织中均高度表达,其成熟体序列在脊椎动物间高度保守。3种软件预测到的共同靶基因有114个,这些靶基因显著(P 0.05)富集在15个GO功能和13个信号通路。结合前期得到的抗性基因,筛选到4个关键靶基因NR3C1、SIRT1、BCL2L2和DLG5,转染miR-204 mimics后,靶基因SIRT1、BCL2L2和DLG5极显著(P 0.01)下调表达。miR-204是参与调控仔猪抵抗C型产气荚膜梭菌感染的重要因子,SIRT1、BCL2L2和DLG5可能是miR-204的关键靶基因,其功能还需进一步验证。     

猪miR-192/-215的组织表达谱及其关键靶基因分析

【目的】在前期通过Illumina Solexa高通量测序技术并结合荧光定量验证筛选出断奶仔猪E.coli F18菌株感染下表达量极显著上调的microRNAs-miR-192和miR-215的基础上,为了解miR-192和miR-215的组织表达情况,进一步筛选确定miR-192和miR-215靶向调控E.coli F18菌株感染的关键靶基因,为探讨miR-192和miR-215调控断奶仔猪E.coli F18感染的分子调控机制奠定基础。【方法】试验采用Real-time PCR方法检测miR-192和miR-215在35日龄梅山仔猪各个组织中的分布情况,同时利用MEGA 5.0分析了其保守性,TargetScan预测miR-192和miR-215的靶基因,并对靶基因分别进行Gene Ontology和Pathway通路的富集分析,进一步利用DAVID对靶基因蛋白进行功能分类,最后将预测的靶基因与课题组前期筛选出的断奶仔猪E.coli F18感染抗性相关的调控基因取交集。【结果】miR-192和miR-215在35日龄梅山仔猪十二指肠和空肠中均高度表达,二者成熟序列在脊椎动物中高度保守。miR-192和miR-215对应的靶基因相同,具有156个靶基因,只在轴突导向通路（axon guidance pathway）显著富集（P-value < 0.05）以及25个GO功能中显著富集（P-value < 0.05）。靶基因蛋白按功能分为12类,其中信号转导功能的磷蛋白（phosphoprotein）和DNA结合蛋白（dna-binding）占主要部分。靶基因与前期筛选的E.coli F18感染抗性相关的调控基因（GEO登录号：GSE26854）取交集,发现DLG5、ALCAM、FRMD4B、MIPOL1和ZFHX3 等5个基因为miR-192和miR-215的重要靶基因,其中DLG5为维持小肠上皮细胞结构完整性的重要因子。【结论】miR-192与miR-215是参与维持断奶仔猪肠道正常功能与抗F18大肠杆菌感染的重要因子,DLG5可能是miR-192和miR-215靶向调控E.coli F18菌株感染中关键的靶基因,今后需要进一步验证其能否作为梅山猪抗F18大肠杆菌的有效遗传标记。     

京海黄鸡柔嫩艾美尔球虫感染对脾脏和盲肠IL-6、IL-8、CCLi2基因表达量的影响及其相关性

白介素6(IL-6)、白介素8(IL-8)和CC趋化因子配体2(CCLi2)3种细胞因子在炎症反应以及机体免疫方面发挥重要作用。为了揭示球虫感染对脾脏和盲肠中IL-6、IL-8和CCLi2的表达量的影响,以京海黄鸡(Gallus gallus)为试验材料,设球虫感染组和非感染的对照组,利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测了脾脏与盲肠组织中IL-6、IL-8和CCLi2的mRNA的相对表达量,比较同一组织感染组与对照组间3个基因表达量的差异,同时分析同一处理组的同一组织内、不同组织间3个基因表达量的相关性。研究结果表明:感染组脾脏组织IL-6、IL-8和CCLi2三个基因的表达量均显著高于对照组(P<0.05),其中IL-6基因达极显著水平(P<0.01);感染组盲肠组织中IL-6、IL-8和CCLi2的表达量均极显著地高于对照组(P<0.01)。相关性分析结果表明,感染组脾脏组织中IL-6、IL-8和CCLi2的表达量之间均存在极显著的正相关(P<0.01);在感染组盲肠组织中IL-8、CCLi2与IL-6基因的表达量存在极显著的正相关(P<0.01),但IL-8与CCLi2基因表达量相关不显著(P>0.05);在对照组脾脏组织中,IL-6、IL-8与CCLi2间存在极显著的正相关(P<0.01),其他基因间相关均不显著(P>0.05);对照组盲肠组织中IL-6、IL-8和CCLi2之间均存在极显著的正相关(P<0.01);此外,无论感染组还是对照组,脾脏和盲肠组织间3个基因的表达量相关性均不显著(P>0.05)。以上结果表明,IL-6、IL-8和CCLi2可能在京海黄鸡球虫感染过程中发挥重要作用,研究结果对进一步探讨这3个基因在球虫病抗病育种中的作用提供了依据,对京海黄鸡球虫病抗病育种具有重要意义。     

烟台黑猪SLA-DQB基因外显子2多态性及其与仔猪腹泻的关联分析

采用PCR-RFLP方法对烟台黑猪DQB基因外显子2的多态性进行研究,并对该位点与仔猪腹泻的关联进行了分析。结果表明,在烟台黑猪DQB基因外显子2上共检测出4种等位基因(A、B、C、D),7种RFLP带型(AA、BB、CC、AB、AC、BC、AD),该位点具有较丰富的多态性。卡方适合性检验显示,烟台黑猪的DQB基因外显子2没有达到Hardy-Weinberg平衡(P<0.05)。最小二乘法分析结果表明,烟台黑猪的性别和DQB外显子2的基因型均对仔猪腹泻无显著影响(P>0.05),而性别与基因型的互作效应对仔猪腹泻具有极显著的影响(P<0.01),在公猪群体中,AD基因型仔猪腹泻评分高于AA基因型个体(P<0.05),在母猪群体中BB、AC、BC、CC基因型仔猪腹泻评分高于其他基因型仔猪(P<0.05)。     

视黄醇对仔猪睾丸支持细胞体外生物学特性的影响

支持细胞是构成曲细精管上皮的重要组成细胞,视黄醇及其衍生物是雄性动物睾丸发育和精子发生中所必须的物质,支持细胞是睾丸内视黄醇及其衍生物作用的靶细胞。本研究以3~5周龄仔猪睾丸支持细胞为材料,通过分析视黄醇对体外支持细胞活力、增殖和凋亡相关基因表达、相关细胞因子转录及合成的影响,评价视黄醇对支持细胞体外生物学特性的影响。结果显示,与对照组相比,视黄醇添加浓度达到5.000、0.125 μmol·L^-1时,显著抑制培养24 h和72 h的细胞活性(P<0.05);添加1.250 μmol·L^-1视黄醇组和对照组相比,增殖相关基因PCNA、BCL-2和C-MYC显著下调(P<0.05),凋亡相关基因BAX显著上调(P<0.05),且支持细胞内GDNF、CSF-1和EGF在基因表达和蛋白质水平上均显著降低(P<0.05)。体外培养条件下,添加视黄醇抑制支持细胞活性,促进细胞凋亡。     

鸡源复合益生菌对青年白羽肉杂鸡免疫球蛋白和Toll样受体通路的影响

为研究鸡源复合益生菌对青年白羽肉杂鸡血清免疫球蛋白和肠道Toll样受体通路的影响,将180只健康的28日龄白羽肉杂鸡随机分为A(基础饲粮)、B(基础饲粮中添加10¹¹ CFU·kg^-1益生菌)、C(基础饲粮中添加2×10¹¹ CFU·kg^-1益生菌)3个处理,每个处理3个重复,每个重复20只鸡。试验期21 d。结果表明:与A组相比,B组和C组鸡血清中IgG、IgM水平显著(P<0.05)升高,B组和C组鸡肠道TLR2、TLR4、Myd88、TRAF-6、AP-1蛋白表达及mRNA相对表达量显著(P<0.05)升高。与B组相比,C组鸡血清IgG、IgM、IgA水平均无明显差异(P>0.05),鸡肠道TLR4、Myd88蛋白表达显著(P<0.05)升高,Myd88基因mRNA相对表达量显著(P<0.05)升高。综上,添加不同浓度的鸡源复合益生菌能够提高白羽肉杂鸡血清中IgG、IgM水平,通过Toll样受体通路增强肉鸡的免疫功能。     

不同密度青蛤养殖塘异养细菌和弧菌的数量变化

研究了青蛤(Cyclina sinensis)养殖环境中异养细菌数量和弧菌数量的动态变化,以探讨其与养殖密度的相关性和样本间相关性。结果表明:实验周期内各养殖塘水体中异养细菌总数呈现不同的变化趋势且差异不显著(P>0.05),而弧菌数量变化趋势较为一致,9月份与其他月份水样中弧菌数量差异较为显著(P<0.05)。各塘底泥中异养细菌总数变化和弧菌数量变化差异均不显著,而不同密度养殖塘底泥中弧菌数量变化差异显著(P<0.05)。不同采样时间同一塘的青蛤腔液异养细菌总数差异极显著(P<0.01),而弧菌数量差异较为显著(P<0.05)。样本间、样本与养殖密度间相关性分析发现,水体中异养细菌总数变化与弧菌数量变化呈显著正相关(r=0.335,P<0.05);底泥中异养细菌总数变化与弧菌数量变化呈正相关且相关性极显著(r=0.587,P<0.01);底泥和水体中异养细菌总数和弧菌数量变化与养殖密度相关性均不显著(P>0.05);青蛤腔液异养细菌总数变化与养殖密度相关性极显著(r=-0.189,P<0.01),弧菌数量变化与养殖密度相关性极显著(r=-0.123,P<0.01)。     

甘加藏羊发情周期下丘脑-垂体-卵巢轴KISS-1/GPR54的表达与分布

为了研究高原甘加藏羊(Ovis aries)发情周期下丘脑-垂体-卵巢轴(hypothalamic-pituitary-ovary axis,HPOA)中肿瘤转移抑制基因(kisspeptins,KISS-1)/G蛋白偶联受体54(G protein-coupled receptors 54,GPR54)的表达及其对藏羊季节性发情周期的调控作用,本实验选取处于发情周期的甘加藏羊32只,应用qRT-PCR和免疫组织化学技术,检测其在发情周期HPOA组织中的表达和分布。qRT-PCR结果显示,甘加藏羊整个发情周期HPOA组织中均有KISS-1和GPR54 mRNA表达。下丘脑组织中发情前期KISS-1 mRNA相对表达量显著(P<0.05)高于其他3个发情时期;在垂体组织中发情前期和间情期的相对表达量较高,与发情后期差异显著(P<0.05);卵巢轴组织中间情期的相对表达量最高,显著(P<0.05)高于其他3个时期。下丘脑组织中发情期GPR54 mRNA相对表达量显著(P<0.05)高于其他3个时期;垂体组织中发情前期的相对表达量显著(P<0.05)高于其他时期;卵巢轴组织中发情后期的相对表达量显著(P<0.05)高于其他时期。免疫组织化学染色结果显示:Kisspeptin和GPR54阳性产物在下丘脑中主要分布于促垂体区的弓状核、脑室前腹侧区;腺垂体中主要在嗜碱性细胞和嫌色细胞中表达;卵巢轴中主要在卵泡颗粒层及卵泡内膜上表达。KISS-1和GPR54在藏羊发情周期HPOA中的差异表达,对藏羊季节性发情周期有一定的调控作用。     

猪Ⅲ型干扰素原核表达及其抗病毒效果研究

Ⅲ型干扰素(IFN-λ)具有较好的广谱抗病毒能力和免疫功能调节能力,一般在肠道等黏膜部位呈现高表达。猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)和猪德尔塔冠状病毒(porcine deltacoronavirus,PDCoV)是引起仔猪腹泻的重要肠道病原,严重困扰生猪产业健康发展。研究构建了携带猪PoIFN-λ3基因的重组表达质粒,转化大肠埃希菌Rosetta感受态细胞原核表达后,经SDS-PAGE和Western blotting检测分析,重组PoIFN-λ3蛋白成功表达,大小约为27 ku,且以包涵体形式存在。变性、纯化、复性后的PoIFN-λ3重组蛋白刺激IPEC-J2细胞,ISG-15、OAS1、Mx-1、IFIT1、IFIT3、IFITM1和IFITM3等干扰素刺激基因(ISGs)表达均显著上调,且在12 h达到峰值(P<0.001)。IPEC-J2细胞分别感染PEDV和PDCoV病毒时,用PoIFN-λ3重组蛋白预处理、同时处理和感染后处理这3种方式处理后观察病毒增殖情况,与对照组相比,PEDV和PDCoV病毒拷贝数均显著下降(P<0.05)。上述结果表明,变性、纯化、复性后的PoIFN-λ3重组原核表达蛋白具有较好的生物活性,不仅可以诱导IPEC-J2细胞免疫刺激基因表达上调,在体外也可以抑制PEDV和PDCoV在IPEC-J2细胞中的复制,为防治仔猪病毒性腹泻提供了基础。     

绵羊GH基因的Pvu Ⅱ 位点的多态性与其生长性状的关联分析

为探讨GH基因与绵羊的生长发育性能的关系,采用PCR-RFLP的方法分析了GH基因内含子Ⅱ的PvuⅡ位点在5个绵羊群体中的多态性,并与绵羊体质量和体尺等性状进行了关联分析。结果表明:GH基因内含子Ⅱ的PvuⅡ位点在5个绵羊中检测到两种基因型即AB基因型(264 bp/429 bp/693 bp)和BB基因型(264 bp/429 bp)。大尾寒羊、小尾寒羊、豫西脂尾羊、湖羊、杜泊羊的AB基因型频率分别为0.786、0.750、0.424、0.471、0.459,BB基因型频率分别为0.214、0.250、0.576、0.529、0.541。湖羊的GH基因内含子Ⅱ的PvuⅡ位点显著偏离Hardy-Weinbery平衡状态(P<0.05),小尾寒羊、豫西脂尾羊、杜泊羊的GH基因内含子Ⅱ的的PvuⅡ位点极显著偏离Hardy-Weinbery平衡状态(P<0.01)。关联分析表明,AB基因型绵羊的体质量、体长、胸宽、臀端高、管围、尻高、颈长等指标显著大于BB基因型绵羊(P<0.05)。研究表明,GH基因内含子Ⅱ的PvuⅡ位点对绵羊的生长发育性能有一定影响。     

应用Illumina MiSeq高通量测序技术分析饲粮添加乳双歧杆菌对蛋雏鸡盲肠微生物的影响

试验旨在研究饲粮添加乳双歧杆菌对蛋雏鸡盲肠微生物多样性的影响。选取1日龄健康、体质量相近的罗曼褐蛋公雏216只,随机分成2个处理组,每组6个重复,每个重复18只鸡,对照组饲喂基础饲粮(C组),试验组饲喂基础饲粮另添加乳双歧杆菌制剂(T组,添加量:1×10⁷ cfu·g^-1),试验期42 d。试验结束后,每个处理组随机选取6只鸡,再从中选出体质量相近且状态良好的3只,收集盲肠食糜样,并应用Illumina MiSeq高通量测序技术分析盲肠微生物多样性。结果表明:(1)乳双歧杆菌可显著提高雏鸡体质量、平均日增重及平均日采食量(P<0.05)。(2)两组间优势菌门均为拟杆菌门(Bacteroidetes)、厚壁菌门(Firmicutes)和变形菌门(Proteobacteria),试验组Firmicutes和Bacteroidetes数量的比值高于对照组。(3)乳双歧杆菌可显著提高Barnesiella、Romboutsia、Butyricicoccus、Lactobacillus等有益菌含量,而显著降低Clostridium sensu stricto、Escherichia-Shigella的含量(P<0.05)。(4)乳双歧杆菌可提高盲肠菌群丰度,显著提高Shannon和Simpson指数(P<0.05)。综上,饲粮添加乳双歧杆菌后,可能通过改变盲肠微生物的组成结构和含量来发挥益生作用。     

MicroRNA-499对中华鳖脂类代谢相关基因表达的影响

采用体内注射microRNA-499特异性抑制剂antagomirs的方法,揭示microRNA-499对中华鳖脂类代谢相关基因的调控作用。选取健康稚鳖15只,随机分成3组,分别设为空白对照组、注射生理盐水组和注射miR-499 antagomirs组。在同一时间点连续注射3 d后,测定中华鳖血清和肝脏中甘油三酯和总胆固醇含量,采用实时荧光定量PCR测定肝脏中microRNA-499和脂类代谢相关基因表达水平。结果表明,相对于空白对照组和注射生理盐水组,注射miR-499 antagomirs导致中华鳖肝脏甲状腺激素应答蛋白(THRSP)和钠/碘共同转运体(NIS)的表达水平升高,肉碱棕榈酰转移酶1(CPT1)表达水平降低(P<0.05)。microRNA-499影响中华鳖脂类代谢相关基因的表达水平,这可能与中华鳖脂肪生成和脂肪酸β-氧化有关。     

连梅止痢中药制剂对大肠埃希菌K88感染仔猪的疗效

探讨连梅止痢中药制剂对大肠埃希菌K88感染的仔猪腹泻的疗效。72头21日龄初始体质量平均为(4.41 ±0.01) kg的仔猪被分为6组:空白对照组、发病组、低剂量(0.5 mL·kg^-1 BW)、中剂量(1.0 mL·kg^-1 BW)、高剂量组(1.5 mL·kg^-1 BW)及抗生素组(0.2%恩诺沙星2 mL·头^-1)。给断奶仔猪灌服一定数量的大肠埃希菌K88建立腹泻模型,利用乌梅、黄连、诃子以及秦皮原料制备的连梅止痢中药制剂(含生药1 g·mL^-1)对发病猪进行治疗,观察该中药制剂对腹泻病的疗效。结果表明,该中药制剂对仔猪大肠埃希菌腹泻的治愈率为80%。实时定量PCR检测结果表明,在用药的整个阶段中剂量组仔猪粪便中的大肠埃希菌K88平均数量与发病组相比显著减少 (P<0.05),其他剂量组与发病组相比差异不显著(P>0.05)。从仔猪肠道形态上观察,抗生素组和中剂量组仔猪肠道组织结构基本完整。经过生存分析发现,中剂量中药制剂与发病组相比能显著提高仔猪生存率(P<0.05)。发病组生存曲线相比其他组的陡峭,而中剂量组的曲线最平缓,中药制剂能降低仔猪的死亡率。     

微生物固态发酵对饲料营养特性的影响

采用酵母菌单菌和酵母菌、乳酸菌混菌对玉米、豆粕和麸皮组成的饲料进行好氧固态发酵,探索其对饲料营养成分和体外功能活性的影响。结果表明,发酵后,粗蛋白、总磷和低分子量肽含量显著(P<0.05)提高,而粗脂肪含量显著(P<0.05)降低。氨基酸方面,酵母单菌和混菌发酵后,天冬氨酸、丝氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸和精氨酸的含量显著(P<0.05)提高。与发酵前相比,酵母单菌发酵还显著(P<0.05)提高了总氨基酸含量。饲料经过单菌和混菌发酵后,总酚含量、维生素B2、B6以及咖啡酸、没食子酸的含量亦显著(P<0.05)提高。体外功能评价试验表明,发酵饲料提取液对大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、藤黄微球菌和沙门氏菌等4种指示菌均有抑制效果,并对酵母菌和乳酸菌有促生长作用。由此可知,在本试验条件下,酵母单菌发酵和酵母、乳酸菌混菌发酵处理可有效提高饲料的营养品质。     

蛋用鹌鹑IGF-1R基因的多态性与体尺性状相关性分析

类胰岛素生长因子1型受体(IGF-1R)基因是类胰岛素生长因子(IGFs)在生物体内发挥作用的主要效应器,对机体生长发育进程中有重要影响。为探讨IGF-1R基因多态性与蛋用鹌鹑体尺性状的相关性,采用PCR产物直接测序方法对中国黄羽鹌鹑、北京白羽鹌鹑、朝鲜鹌鹑3种蛋用鹌鹑的IGF-1R基因进行多态性分析,并对IGF-1R基因的多态性与鹌鹑体尺性状进行相关性分析。结果表明,在3个蛋用鹌鹑群体中检测到IGF-1R基因A57G和A72T两个突变位点,A57G位点发生了A/G碱基突变,有AA、AG和GG三种基因型;A72T位点发生了A/T碱基突变,有AA、AT和TT三种基因型。中国黄羽鹌鹑的A57G位点对胫长、胸骨长和胫围有显著影响(P<0.05),A72T位点对体质量和胸骨长有显著影响(P<0.05),组合基因型AGAA对体质量有显著影响(P<0.05),组合基因型AAAA对胫长、胸骨长、胫围有明显影响(P<0.05)。北京白羽鹌鹑的A57G位点对体质量、胫长、体长、胫围有显著影响(P<0.05),A72T位点对胸骨长有显著影响(P<0.05),组合基因型AAAA对体质量和胸骨长有显著影响(P<0.05),组合基因型AAAT、GGAA、GGAT对胫长有显著影响(P<0.05),组合基因型GGAA对胸深有显著影响(P<0.05)。朝鲜鹌鹑的A57G位点对体质量有显著影响(P<0.05),A72T位点对胸骨长和胫围有显著影响(P<0.05),组合基因型AGAA对体质量有显著影响(P<0.05),组合基因型AGAT对胫长和胸宽有显著影响(P<0.05)。因此,IGF-1R基因可以作为候选基因应用于蛋用鹌鹑体尺性状的分子标记辅助选择。