四川省马铃薯病毒RT-PCR检测体系的建立

根据5种主要的马铃薯病毒外壳蛋白基因序列,分别合成了5对寡聚核苷酸引物,从马铃薯病叶组织中提取出病毒总RNA,进行cDNA合成和PCR扩增,得到了与预期片段长度一致的PCR特异扩增产物。建立了马铃薯病毒检测的RT-PCR体系,并将建立的体系应用于四川省的马铃薯病毒病的检测,在基因水平上为四川省的马铃薯检测提供了新的手段。     

冬种马铃薯卷叶病田间调查及RT-PCR检测技术研究

对惠州市冬种马铃薯卷叶病发病情况进行调查研究,建立了马铃薯卷叶病毒(PLRV)RT-PCR检测技术。结果表明,马铃薯卷叶病发病率为3.0%～29.7%。比较LiCl、异硫氰酸胍和试剂盒3种方法提取马铃薯卷叶病毒总RNA,以异硫氰酸胍和试剂盒提取效果较好,LiCl次之;根据卷叶病毒外壳蛋白基因序列设计引物,从感染马铃薯卷叶病毒的马铃薯叶片中提取出病毒RNA,合成cDNA并运用RT-PCR技术进行体外扩增,得到一条长度约336bp的特异PCR扩增产物,与理论设计的外壳蛋白基因大小一致,而健康叶片RNA扩增未得到任何产物。应用RT-PCR技术对马铃薯试管苗和种薯进行了卷叶病毒检测。     

应用RT-PCR法快速检测马铃薯X病毒

根据马铃薯X病毒的外壳蛋白基因序列 ,设计合成了 1对寡核苷酸引物 ,从感染PVX的马铃薯病叶组织中提取出病毒的RNA ,进行cDNA合成和PCR扩增 ,得到一条长度约为0 .72kb的特异性PCR扩增产物 ,与理论设计的外壳蛋白基因大小一致。在基因水平上为PVX的检测提供了一种快速、灵敏、简便的新方法 ,为PVX的防治提供了有效手段。     

马铃薯病毒RT-PCR检测体系的建立

依据马铃薯病毒PVS、PVX、PLRV、PVA的CP保守序列设计特异性引物,从马铃薯病叶组织中提取出病毒总RNA,进行cDNA合成和PCR扩增,得到了与预期片段长度一致的PCR特异扩增产物,建立了能够同步检测PVS、PVX、PLRV、PVA的RT-PCR多重检测体系。该方法对PVS、PVX、PLRV、PVA扩增出的靶带大小分别为435、625、222、300 bp,凝胶电泳易辨别区分。研究结果表明,该方法特异性好、灵敏度高、快速简便,为马铃薯病毒的高效检测提供了有效手段。     

马铃薯卷叶病毒的RT-PCR快速检测

根据马铃薯卷叶病毒的外壳蛋白基因序列,设计合成了一对寡核苷酸引物。从感染马铃薯卷叶病毒(PLRV)的马铃薯叶片中提取出病毒RNA,进行cDNA合成并运用RT-PCR技术进行体外扩增,得到一条长度约627bp的特异PCR扩增产物,与理论设计的外壳蛋白基因大小一致,而对照未得到任何产物。从而建立了快速灵敏的PLRV检测方法,为PLRV的防治及检测提供了有效手段。     

榆林地区马铃薯纺锤块茎类病毒的RT-PCR检测与序列分析

以陕西省榆林地区种植2~3代的马铃薯叶片为材料,首先用Trizol法提取马铃薯叶片总RNA,以已公布的马铃薯纺锤块茎类病毒(PSTVd)基因序列设计合成一对特异引物,反转录合成cDNA,通过RT-PCR扩增目的DNA片段,琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物;然后回收纯化扩增产物并进行克隆和测序,采用DNAstar软件分析序列一致性。电泳结果表明,在榆林地区的马铃薯叶片中均扩增到与预期大小一致的目的片段,说明这些马铃薯均感染了PSTVd;序列分析表明,10个不同采样点PSTVd的目的片段大小为250~251 bp,只是单个碱基之间的转换或缺失,PSTVd在榆林地区几乎没有发生变异,与国内外其他15个地区已报道的序列一致性在82.3%~99.5%之间。     

RT-PCR检测菊花B病毒的研究

根据菊花B病毒(CVB)的外壳蛋白基因序列设计、合成引物,以感病组织和健康组织总RNA为模板,进行cDNA合成和PCR扩增,结果从感病组织中扩增出与预期的776bp大小一致的目标片段,而健康组织无此扩增产物;将PCR产物插入pGEM-T载体克隆并测序,序列分析表明与CVB的相应序列同源性达到85%;将感病组织总RNA以10 x梯度稀释成不同浓度,测出RT-PCR检测CVB的灵敏度为10-4x;PCR产物克隆作为RT-PCR反应的阳性对照,解决了毒源保存和传播的问题,从而建立了CVB快速、灵敏、准确的RT-PCR鉴定和检测技术.     

黄瓜上烟草花叶病毒的RT-PCR检测

根据烟草花叶病毒TMV的外壳蛋白基因序列设计、合成引物,以感病组织和健康组织总RNA为模板进行cDNA合成和PCR扩增,对2002年采集的75份黄瓜病毒病样本进行了检测,结果从感病组织中扩增出与预期的425bp大小一致的目标片段而健康组织无此扩增产物;29份材料检测到TMV,检出率达38.67%。     

青海省马铃薯卷叶病毒的RT-PCR法检测

根据马铃薯卷叶病毒（PLRV）外壳蛋白基因的保守序列设计了一对寡聚核苷酸引物,从田间自然感染PLRV的马铃薯病株中提取病毒总RNA,用反转录-聚合酶链式反应扩增出符合设计大小240bp的特异性产物,而对照没有任何扩增产物。建立了快速、准确检验PLRV的分子检测方法,为青海省马铃薯生产中卷叶病毒的检测和防治提供了有效手段。     

利用RT-PCR检测黄瓜上的西瓜花叶病毒

根据西瓜花叶病毒2号(WMV-2)的外壳蛋白基因序列设计、合成引物,以感病组织和健康组织总RNA为模板,含WMV-2外壳蛋白基因的质粒DNA为阳性对照,进行cDNA合成和PCR扩增。结果从感病组织中扩增出与预期的382 bp大小一致的目标片段,而健康组织无此扩增产物。对2002和2003年采集的98份黄瓜病毒病样本进行了同样的RT-PCR检测,结果表明98份材料中77．55％检测到WMV-2。     

百合上黄瓜花叶病毒的一步RT-PCR检测

根据黄瓜花叶病毒的外壳蛋白基因序列设计、合成引物,采用Trizol快速提取百合感病组织和健康组织的总RNA,运用RT-PCR两步法和一步法都可从感病组织中扩增出与预期的335 bp大小一致的目标片段,而健康组织无此扩增产物。两种方法相比,一步RT-PCR法特异性强、灵敏度高、省时经济、程序简单,达到了快速检测的目的。     

应用 RT-PCR 法快速检测马铃薯卷叶病毒

根据马铃薯卷叶病毒的外壳蛋白基因序列,设计合成了一对寡核苷酸引物,从感染ＰＬＲＶ的马铃薯病叶组织中提取出病毒的ＲＮＡ,进行ｃＤＮＡ合成及ＰＣＲ扩增,得到一条长度约６２０ｂｐ的特异ＰＣＲ扩增产物,与理论设计的外壳蛋白基因大小一致。建立了快速灵敏简便的ＰＬＲＶ检测的新方法,其灵敏度要比ＰＬＲＶ的血清学检测方法高１０＾４倍,在基因水平上为ＰＬＲＶ的检测提供了更新手段,并在农业部植物检疫实验所马铃薯病毒检     

猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒(PRRSV)检测方法的建立

根据GeneBank中已经发表的PRRSV毒株的ORF6基因高度保守序列,设计并合成了一对特异性引物,建立了用于检测PRRSV的RT-PCR诊断方法。从感染PRRSV-QD的Marc-145细胞中提取病毒RNA,然后经RT-PCR扩增,获得预期266 bp的目的片断,而猪伪狂犬病毒(PRV)、猪细小病毒(PPV)、猪圆环病毒(PCV)细胞培养物及Marc-145细胞进行同条件检测,结果为阴性;PRRSV扩增产物测序结果与GeneBank中已发表的PRRSV毒株序列同源性达94.4%~97.4%且应用本研究检测方法对已知基因型的10株PRRSV盲检,检出率100%。上述研究结果表明,所建立的RT-PCR诊断方法特异性好、敏感性高,可进一步应用于猪繁殖与呼吸综合征的临床诊断。     

鸡瘦蛋白基因克隆中的若干问题研究

根据GenBank中鸡的LeptinmRNA序列(AccessionNo.AF012727)设计12对引物,用RT-PCR方法从不同品种(系)、不同时期及不同处理鸡的脂肪、肝脏和卵巢组织总RNA中没有扩增出鸡的Leptin基因片段;根据鸡的EST数据库中查到的一条鸡Leptin基因前体序列设计4对引物,用RT-PCR方法在包括卵巢在内的多个组织的cDNA中没能扩增出正确序列。为提高鸡Leptin基因的表达水平,通过给鸡注射胰岛素,利用RT-PCR方法对肝脏、卵巢和脂肪组织的总RNA进行扩增,没有得到目的序列。根据已发表的哺乳动物的Leptin基因序列设计兼并引物对鸡基因组DNA和脂肪、肝脏组织的cDNA进行PCR,结果没有特异性扩增条带,但在小鼠的基因组中可以获得稳定的扩增条带。用扩增长片段LATaq酶从鸡基因组DNA中也没有扩增出Leptin基因片段,而从小鼠的基因组DNA中,可扩增出小鼠Leptin基因片段;以小鼠LeptincDNA片段为探针,对鸡脂肪组织和肝脏组织来源的总RNA进行NorthernBlot分析,并未获得杂交信号;以猪的LeptincDNA片段为探针,对鸡基因组DNA进行SouthernBlot分析,并未获得特异性的结果。研究结果表明,在鸡的脂肪、肝脏和卵巢组织中不存在与小鼠Leptin基因同源性如此高的mRNA序列,在鸡的基因组中也不存在与小鼠、猪等哺乳动物Leptin基因序列同源性如此高的基因?     

河北省马铃薯Y病毒株系分子鉴定及其RT-PCR检测

根据马铃薯Y病毒(PotatovirusY,PVY)的外壳蛋白基因序列,设计合成了一对寡核苷酸引物,从感染PVY的马铃薯田间病叶组织中提取出病毒的RNA,进行cDNA合成及PCR扩增,得到一条长度约800bp的特异PCR扩增产物,与理论设计的基因片段大小一致,本试验建立了快速、灵敏、简便的PVY检测的方法。将RT-PCR扩增产物克隆到质粒pGEM-T上,并进行了序列分析。结果表明,克隆的cDNA片段由801个核苷酸组成,编码267个氨基酸组成的理论分子量为29kD蛋白,与PVY外壳蛋白的大小一致,与基因库登记的代表性株系相比,它们之间的核苷酸序列同源性为89 6%～98 8%,氨基酸序列的同源性为93 3%～98 5%,说明PVYCP基因具有高度的保守性(记为PVY-HBEI),与国内报道的PVY-CHU、PVY-ZHJ和PVY-ZHOU株系的氨基酸序列同源性分别为96 6%、98 5%和97 8%,与PVYN和PVYO株系的氨基酸序列同源性分别为93 6%和97 8%,从分子水平上确定PVY-HBEI归属于普通株系(PVYO株系)。     

从Raji细胞克隆IL-10基因

[目的]探索一种简便可行的白细胞介素-10(IL-10)基因的克隆方法。[方法]以人Burkitt’s淋巴瘤细胞系Raji细胞为材料,提取培养的Raji细胞中的总RNA。根据GenBank中人IL-10基因序列设计1对特异性引物,用RT-PCR方法扩增人IL-10基因的编码cDNA。回收目的片段,将其与pMD18-T载体连接并转化到大肠杆菌感受态细胞DH5α,构建该基因的重组质粒。重组质粒经PCR和双酶切鉴定后进行测序。[结果]以骨髓细胞组织总RNA为模板进行RT-PCR,可从Raji细胞中获得了预期的约550bp特异性条带。成功构建了IL-10基因的重组质粒,PCR扩增和双酶切的鉴定结果说明该插入片段可能为IL-10cDNA。从获得的阳性克隆中挑选1个菌落来分析重组质粒的插入DNA片段序列。序列分析结果证实其与报道的IL-10基因的序列一致。[结论]该研究为IL-10的重组表达及其生物学活性分析奠定了基础。     

RT－PCR方法检测番茄环斑病毒的研究

 根据番茄环斑病毒（TomRSV）外壳蛋白基因序列设计的引物P1,P2,用感病及健康组织总RNA为模板,进行RT-PCR试验,结果从感病组织中扩增出了470 bp的目的片段,而健康组织中无此扩增带。摸索各项实验条件,建立了RT-PCR检测番茄环斑病毒（TomRSV）的方法。