水稻根系联合固氮的研究——Ⅲ.水稻根内分离菌的接种试验

本文报道几年来分离筛选的一些固氮菌株在相应的水稻品种上的接种效应。在设置试验中改变了一般采用的缺氮试验方法,供给水稻生长以适当的氮素营养,使其根分泌物增多,借以作为根系固氮微生物生长和固氮的营养料。盆栽试验结果初步表明:1.经灌浆期测定,接种于水稻相应品种各个生育期的土壤中,接种菌都有明显的根际效应,都能群集于水稻根系的表面,有些甚至进入根内。扬花期及孕穗期接种的群集现象最显著,其它时期接种的较差;而固氮酶活性则分蘖期最高,其次为扬花期,苗期最低,但土壤中检测不到接种菌及固氮酶活性。黄熟期测定的菌数和固氮酶活性都比灌浆期测定的低,而且土壤中也可检测到少量固氮菌和固氮酶活性。2.三个水稻品种接种相应的分离菌,其根际效应也很明显,同样能大量群集于根表。接种的根表菌数比不接种的高15～30倍以上。3.两个有效菌株接种不同水稻品种对产量影响的盆栽试验表明,菌株243(?)适应性较广,在接种的五个品种中四个表现增产,其幅度为6～22.9％,而一菌株则不明显。     

小麦、水稻、玉米、白菜、芹菜内生固氮菌及其系统发育

【目的】了解小麦、水稻、玉米、白菜、芹菜内生固氮菌的主要类群,确定内生固氮菌的系统发育地位。【方法】样品表面灭菌后采用无氮培养基分离、培养内生固氮菌,乙炔还原法测定菌株固氮酶活性;PCR扩增得到菌株16S rDNA,通过序列测定和相似性分析研究菌株的系统发育。【结果】从大田小麦体内分离到内生固氮菌34株,固氮酶活性在0.30-30.24 nmol C2H4/h•mg蛋白,基于16S rDNA序列最大相似性,这些菌株分属于假单胞菌（Pseudomonas）、根瘤菌（Rhizobium）、芽孢杆菌（Bacillus）、黄杆菌（Flavobacterium）等13属21种,种群分布较为广泛;从大田水稻体内分离到内生固氮菌25株,固氮酶活性在3.12-254.12 nmol C2H4/h•mg蛋白,属于芽孢杆菌、伯克霍尔德氏菌（Burkholderia）、肠杆菌（Enterobacter）、克雷伯氏菌（Klebsiella）等9属16种,伯克霍尔德氏菌、肠杆菌和克雷伯氏菌是水稻内生固氮菌特有种群;从大田玉米体内分离到内生固氮菌9株,固氮酶活性在7.27-59.58 nmol C2H4/h•mg蛋白,属于根瘤菌、鞘氨醇单胞菌（Sphingomonas）等5属6种;从盆栽试验小白菜体内分离到内生固氮菌14株,固氮酶活性在2.33-205.21 nmol C2H4/h•mg蛋白,属于根瘤菌、节杆菌（Arthrobacter）等6属8种;从市售芹菜体内分离到内生固氮菌10株,固氮酶活性在1.23-46.70 nmol C2H4/h•mg蛋白,属于鞘氨醇单胞菌、假单胞菌等5属8种。【结论】在生长期小麦、水稻、玉米和部分蔬菜体内普遍存在内生固氮菌,菌株固氮酶活性差异较大,在0.30-254.12 nmol C2H4/h•mg蛋白,系统发育地位分属于假单胞菌、根瘤菌、芽孢杆菌等25个属的56个种,这些内生固氮菌对于农业生产有巨大潜能。     

水稻根系联合固氮的研究 Ⅱ.水稻根系固氮酶活性的测定及固氮微生物的分离

本文报道在福建部分地区及盆栽中采集的800多个根样包括97个水稻品种的固氮酶活性检测结果及根系固氮微生物的分离。通过测定发现水稻根系具有固氮酶活性是较为普遍的,采用切根加培养基预培养后,其根内固氮酶活性出现率可达70～90％以上。水稻根系具有固氮酶活性的样品的分布,与水稻品种、植株生育期、种植地区以及土壤环境有关,固氮酶活性较高的根样大多出现在省肥耐瘦株型紧凑的品种,纬度较低、气候温暖的闽南地区,处于孕穗—灌浆的生育期以及盐碱土、坑田的土壤环境。几年来从有固氮酶活性的根系中分离到菌株1,317个,其中表现固氮酶活性的473株,占分离总数的36％。并发现这些分离的固氮茵的生长和固氮需要含有少量有机氮(如酵母膏)的培养基,对氧分压的要求因菌株不同而异。还检到一些真菌具有乙炔还原活性。     

水稻根系内生固氮菌的分离鉴定及其促生作用研究

【目的】研究不同生育期水稻根系内生固氮菌的多样性,分离鉴定内生固氮菌并筛选具有促生作用的菌株,为水稻生产中固氮菌的应用提供理论依据。【方法】采用无氮培养基培养方法,从拔节期和抽穗期佳辐占根系中分离内生固氮菌,通过扩增16S rRNA方法进行分子鉴定和系统进化分析;采用透明圈法进行溶磷解钾能力验证;采用乙炔还原法测定固氮酶活性。将分离的内生固氮菌株单独接种盆栽水稻幼苗,测定其对株高、根长、鲜质量的影响;将内生固氮菌混合菌液接种水稻品种佳辐占和台粳8号,于齐穂期测定倒1、倒2和倒3叶片的叶绿素含量（SPAD值）。【结果】从拔节期和抽穗期水稻根系中分别分离出10和20株内生固氮菌,且两个时期水稻根系内生固氮菌群多样性存在差异,拔节期以克雷伯氏菌属为主,而抽穗期以假单胞菌属为主。筛选出7株具有溶解无机磷能力的菌株,分别是J3、J10、J23、H27、H30、H33和H37。乙炔还原法测定结果表明,分离的内生固氮菌均具有弱固氮活性,其中 H33和H40-2菌株固氮能力相对较强。将固氮菌回接水稻幼苗,H40-2和J3菌株对水稻株高、地上鲜质量、根长均有显著影响,可促进水稻生长。将固氮菌混合回接水稻根系,发现佳辐占叶片叶绿素含量与对照差异不显著,而台粳8号显著提高。【结论】分离的内生固氮菌株H40 2和J3在水稻苗期具有明显促生作用,可作为功能性内生固氮菌开发利用。     

水稻不同生育期根际的固氮活性

作者于1978和1979两年进行了水稻生育期根际固氮活性试验。从两年的试验结果看,插秧至分蘖初期固氮活性很低,以后逐步上升,活性高峰一般在抽穗至成熟期。 根系样品和根际原状土柱样品之间固氮活性差异甚大,土柱比根系高达几百倍。 水稻根际的固氮活性和根际的水分通气状况关系较大,搁田影响根际的固氮活性。 1979年在三种培养基上共分离了96个菌株,其中21个具有固氮活性,占22％。有活性的菌株大部分来源于根表,也有从根表灭过菌的根上分离到的。     

水稻根系联合固氮菌的种类及数量

用Iwao watanabe设计的培养基A,分离了水稻根际、根表和根内的固氮菌,并对其中75株好氧固氮菌进行了鉴定,发现水稻根区好氧固氮菌的数量随水稻生育期不同而变化,在水稻分蘖期,根际土壤中固氮菌数量最多,为2×10~7个细胞/克鲜土,根表为7×10~6个细胞/克鲜根,根内仅6.5×10~5个细胞/克鲜根,在抽穗扬花期则以根表为最多(2×10~9个细胞/克鲜根),根际为6×10~8个细胞/克鲜土,根内为6×10~7个细胞/克鲜根,水稻根系的好氧固氮菌,鉴定结果表明它们分属于八个属,其中肠杆菌科占25％,产碱菌属占24％,水稻根际以产碱菌属最多,克雷伯氏菌属为次,根表以芽孢菌属为主,其次为假单胞菌属,根内最多是固氮菌属,其次是芽孢杆菌属.     

不同农作物根际自生固氮菌分离及固氮酶活性

为了解高海拔地区农作物根际土壤自生固氮菌分布及优势菌株情况,以未施肥的油菜、玉米、青稞、小麦4种农作物种植点为采样地,对作物根际土壤自生固氮菌进行分离提纯,并根据其固氮酶活性筛选固氮能力较强的菌株。结果表明:油菜根际自生固氮菌数量较多,其固氮能力较其他3种作物更高,其中固氮性最好的菌株为德克斯氏菌属(Derxia spp.)菌株。     

固氮菌Kosakonia radicincitans GXGL-4A对玉米和水稻的促生作用及其根际定殖动态

在前期固氮菌分离、筛选、鉴定的工作基础上,得到固氮菌株Kosakonia radicincitans GXGL-4A(简称GXGL-4A,下同),测定其在LB液体培养基(有氮)、A15液体培养基(无氮)中的生长曲线发现,GXGL-4A在LB液体培养基中生长迅速,在A15液体培养基中也能生长,但生长缓慢。在玉米、水稻生长过程中施用不同浓度的GXGL-4A,通过测定其鲜质量、株高、根长、根鲜质量等生物量指标证实,GXGL-4A对玉米和水稻的生长有显著促生作用,且该促生作用在一定范围内随GXGL-4A浓度的增加而增强。设置封闭系统(灭菌土)和开放系统(非灭菌土)2个处理,将GXGL-4A释放至玉米根际土壤中,通过抗生素抗性标记法和平板分离计数法测定GXGL-4A的种群消长动态,结果显示,在监测的15 d内,灭菌土和非灭菌土中的固氮菌GXGL-4A数量均呈现先增加后减少的变化趋势,且在接菌后1 d达到峰值,灭菌土内的固氮菌GXGL-4A数量高于非灭菌土,GXGL-4A在根际土壤中的生长优势明显。     

自生固氮菌的筛选及其在灭菌土壤中的生长特性

从土壤中筛选自生固氮菌,用无氮培养基进行分离,以凯氏定氮法测定该固氮菌的固氮能力,观察其对水稻苗期的促生长作用,并通过MPN法测定氮细菌施用于土壤后的菌体数量,考察其在土壤中的变化动态。结果表明:筛选到固氮能力较强、对水稻有明显的促进生长作用的菌株A2,在灭菌土壤中,固氮菌增长期约为20 d,对土壤氮含量有明显提高。     

辣椒叶际固氮菌分离筛选及抑菌活性

为后续研制叶面微生物菌肥提供优良固氮菌种，以辣椒为研究对象，利用选择性培养基分离、筛选辣椒叶际固氮细菌，测定其固氮能力和植物病原菌的拮抗能力并对性能优良的菌株进行16S rDNA分子生物学鉴定。研究表明，从辣椒叶际共分离得到2株具有高效固氮性能的自生固氮菌LJ-1和LJ-2,分别鉴定为不动杆菌(Acinetobacter sp.)和根瘤菌(Rhizobium sp.),固氮酶活性分别达93.26和102.23 U·L^-1。两株菌具有广谱抗真菌活性和耐酸碱能力，对油菜菌核病菌、番茄灰霉病菌和棉花立枯病菌抑制效果可达50%以上。因此，辣椒叶际固氮菌LJ-1和LJ-2是具有固氮和生防作用的多功能细菌，可为进一步研发优良的叶际固氮菌肥提供微生物资源。     

固氮菌肥料在有机蔬菜生产上的应用

1品种与类型按菌种及特性分为自生固氮菌肥料、根际联合固氮菌肥料和复合同氮菌肥料。自生固氮菌是在土壤里能固定空气中的氮．供给作物氮素营养．又能分泌激素刺激作物生长的微生物．根际联合固氮菌是既依赖根际环境生长．又在根际中固定空气中的氮气．对作物的生长发育产生积极作用的微生物．联合固氮微生物生活在植物的根内、根表．可以利用一些禾本科植物．尤其是植物根分泌的一些糖类繁殖、固氮．也能进行自生固氮。     

水稻根际促生菌筛选及其对水稻促生效果研究

从水稻根际土壤中分离得到自生固氮菌13株、硅酸盐细菌15株、溶磷菌8株,经筛选N11、K01、P07分别具有较强的固氮、分解难溶态钾和降解难溶态磷的能力。经水稻平皿栽培试验证明各菌株对水稻苗期生长均有促进作用,经初步鉴定N11、K01、P07分别属于固氮菌属、芽孢菌属和假单孢菌属。     

固氮菌接种对甘蔗根系生理特性的影响

为探明固氮菌接种对甘蔗根系生理特性的影响,用甘蔗内生固氮菌GGS6、LCT2和QZT2的混合菌液对巴西固氮甘蔗品种B8（RB86～7515）和广西当家甘蔗品种新台糖22号（ROC22）进行固氮菌接种和不接种处理,在不同时期测定根系活力、碳水化合物、蛋白质含量和固氮菌的固氮酶活性。结果表明,与不接菌处理相比,接菌处理使两供试甘蔗品种根系碳水化合物总量、蛋白质含量均有不同程度提高;明显提高了不同时期B8根系活力,在7月12日、8月17日ROC22的根系活力也有所提高;接菌处理在7月30日、8月17日提高了B8根系固氮菌的固氮酶活性,而提高了不同时期ROC22的酶活性。因此,固氮菌接种有助于甘蔗根系的生长代谢。     

有机肥对水稻根际固氮活性的影响

碳氮比例较低的有机肥料作早稻基肥,虽然降低了水稻根际的氧化还原电位,但增加了NH_4~+—N的浓度,抑制了水稻根际的固氮活性,固氮活性明显低于对照区,差异达显著和极显著水平。但从施肥区分离得到的水稻根系好氧和厌氧固氮菌的数量以及好氧固氮菌的固氮活性却高于对照区。     

UV-B辐射对元阳梯田水稻根系LMWOAs分泌量和根际微生物数量的影响

在元阳梯田地方水稻品种——白脚老粳的拔节孕穗期、抽穗扬花期和成熟期,通过小区实验研究不同UV-B辐射强度(0、5.0、10.0 k J·m~(-2))对水稻根系低分子量有机酸(LMWOAs)分泌量和根际7个类群微生物数量的影响,并对水稻LMWOAs分泌量和根际微生物数量进行相关分析。结果表明:UV-B辐射增强导致水稻根系草酸和琥珀酸分泌量增加,酒石酸和苹果酸分泌量下降。水稻根际细菌、真菌、自生固氮菌、纤维分解菌、无机磷细菌和钾细菌的数量均在成熟期最大,拔节孕穗期次之,抽穗扬花期最小;但放线菌数量在拔节孕穗期最大,抽穗扬花期次之,成熟期最小。UV-B辐射增强不改变根际微生物数量随生育期进程的动态变化规律,但导致水稻根际7个类群微生物的数量显著或极显著增加。水稻根系草酸分泌量与根际自生固氮菌、纤维分解菌数量呈显著正相关,琥珀酸分泌量与自生固氮菌数量呈显著正相关,与细菌、真菌、纤维分解菌、无机磷细菌和钾细菌数量呈极显著正相关。综上可知UV-B辐射增强影响大田水稻根际微生物的数量,与其改变水稻根系低分子量有机酸的分泌量密切相关。     

不同植被土壤好气性自生固氮菌的时空变化格局及其菌株的初步筛选

主要分析了青皮天然林与木麻黄人工林等其他植被类型在土壤好气性自生固氮菌数量分布方面的差异及较强固氮能力菌株的分离和筛选.在石梅湾的8种不同植被类型样地,于不同季节取样4次,每次均取0～10 cm及10～20 cm两个土层的根际土与根外土,用改良阿须贝培养基、MPN法计数土壤好气性自生固氮菌并初步筛选具有较强固氮能力的菌株.结果表明:本区土壤好气性自生固氮菌的时间分布极不均匀,且空间分布明显受到时间的影响.从时间分布来看,在一个年周期中,4月固氮菌数量最多,而7月最少,两者差异显著,此后数量又逐渐增加;从空间分布来看,随采样时间不同,植被、取样深度、植物根系、样地地势等条件均对土壤好气性自生固氮菌数量分布也有所不同,这些条件归根到底是通过改变土壤的氮素营养供给,土壤的水、热、气条件来影响固氮菌的分布;同时各植被类型的好气性自生固氮菌数量季节变化幅度也有异,处于高级别演替阶段青皮过伐林及混交林的季节变化明显小于较低演替阶段的灌丛、次生青皮林及木麻黄林.研究还分离了15个具有潜在固氮能力的菌株,并筛选出4个固氮能力较强的菌株,为进一步在海防林的建设及青皮林的保护中研究利用植物促生菌做了初步探索和准备.     

固氮螺菌(Azospirillum)的研究进展

生物固氮是生物科学中一个重要的研究课题。对共生固氮微生物,如根瘤菌(Rhizo-bium),自生固氮微生物,如固氮菌(Azotobacter)的研究已有上百年的历史了。联合固氮(Associative Nitrogen Fixation)是近几年来才明确提出的一个概念,可以说是生物固氮中的一个新领域。联合固氮微生物不同于共生固氮微生物,它不与寄主植物形成特殊的组织。但也不同于自生固氮微生物,它紧密地附在根表,甚至有人报导它可存在于根组织内。目前发现的联合固氮类型都是细菌—植物联合固氮。固氮螺菌(Azospirillum)是其中一种主要的固氮细菌,由于它与禾木科作物联合固氮而受到重视。     

豆科植物内生固氮菌的分离与筛选

以阿须贝无氮培养基为选择分离条件,对豆科植物内生细菌进行初步分离筛选,并通过固氮酶活性测定方法测定所得菌株的固氮酶活性,筛选有较高固氮酶活性的菌株.获得52株内生固氮菌,均具有固氮酶活性,其中2株固氮酶活性较高,具有潜在的应用价值.     

联合固氮酶活性测定中酶促反应时间的控制方法研究

乙炔还原法是国际上普遍公认的测定生物固氮活性的方法,该法具有简便、快速、灵敏度高等优点.乙炔还原反应的温育时间不同,直接影响乙炔还原法测定固氮酶活性结果的可比性.为确保大批量的联合固氮酶活性测定条件的一致性,有必要选择一种固氮酶活性阻断剂,使联合固氮体系中的乙炔还原反应维持在特定时间后予以阻断.本文比较了3种灭菌剂对2株联合固氮菌的抑菌效果及其对水稻根际联合固氮酶活性阻断效果,结果表明,3.5%甲醛水溶液是一种理想的联合固氮酶活性阻断剂.     

水稻根系分离菌泌氨菌株的筛选试验

本试验采用Burris推荐的氨微量扩散法,从309个水稻根系分离菌株中筛选具有泌氨特性的固氮菌自然突变菌株。初步试验结果表明,培养基以含氮较低的每升加0.1克酵母膏的慢型快长培养基较为适宜。供试菌株中大部分没有泌氨作用,并能消耗培养基中的氮源。发现维涅兰德固氮菌230(Azotobacter uinelandii)菌株的泌氨作用较强,其泌氨量为固氮量的2.05％。该菌在以前的长期试验中尚未注意到有泌氨特性。属于德氏固氮菌属(Derxia)的“卷4”菌株也具有泌氨作用,但固氨量较低,只有固氮量的1.18％。