农杆菌介导法将pac1基因转入烟草的研究

以烟草叶片为外植体,利用农杆菌介导法首次将pac1基因转入吉林省主栽烟草品种吉烟9号、龙江911-21和云烟87中.经过卡那霉素抗性筛选,初步获得吉烟9号转化植株43株、龙江911-21转化植株61株、云烟87转化植株43株.经PCR检测,转化烟草吉烟9号的PCR阳性率为21/43,龙江911-21的PCR阳性率为32/61,云烟87的PCR阳性率为24/43.经PCR检测为阳性的植株均能扩增出与目的片断大小一致的特异性条带,初步表明pac1基因已经转到这些烟草基因组中.从PCR扩增稳定的转基因烟草中随机抽取5株,同时以非转基因烟草为对照,进行Southern Blot分析,结果表明目的基因pac1己经被成功地整合到烟草基因组中.     

利用卡那霉素筛选野罂粟转基因植株的技术研究

待供试转基因和非转基因野罂粟植株长至5～7片叶时,用微型喷雾器将不同浓度的卡那霉素溶液均匀喷施于叶片上,结果显示浓度为6.5g/L的处理表现效果最好。对于大田筛选转基因野罂粟,在苗期对叶片喷施6.5g/L卡那霉素溶液喷雾,并对产生黄斑的野罂粟植株进行剔除后,拔节期用7.5g/L卡那霉素溶液连续5d涂抹后,对产生黄斑的植株进行再次剔除,最终得到30株未见黄斑的野罂粟植株,经PCR进行检测后,最终得到8株野罂粟转基因植株。     

3种筛选NPT-Ⅱ标记转基因油菜方法研究

为获得一种简便的筛选含有NPT-Ⅱ标记基因的转基因油菜种子的方法,对卡那霉素溶液叶片涂抹法、种子浸泡法以及卡那霉素MS培养基筛选3种方法进行研究.结果表明,3种筛选方法的最佳卡那霉素选择压为200 mg/L;涂抹叶片法4～5天可以明显识别植株对卡那霉素抗性与否,此法筛选到的4株植株PCR检测全部呈阳性,可靠性达100%;浸泡种子法2～3天可以明显识别植株对卡那霉素抗性与否,此法筛选到的5株植株PCR检测全部呈阳性,可靠性100%;MS培养基筛选法一般10天可以明显识别植株对卡那霉素抗性与否,此法筛选到20株植株,移栽后存活5株,PCR检测3株呈阳性,2株是假阳性植株,可靠性为60%.因此,可以认为卡那霉素涂抹叶片和浸泡种子两种方法是转基因油菜进行大规模、快速的筛选及后代的遗传分析的理想方法.     

云南清香Ⅲ型烟区不同移栽期对烤烟代谢和发育的影响

【目的】为探索云南清香Ⅲ型烟区不同移栽期对烟草生理代谢及生长发育的影响。【方法】在云南省丽江市永胜县永北镇,在相同栽培管理条件下对不同移栽期的云烟87进行薄膜覆盖栽培,分别为提前14 d移栽(T1)、正常移栽(T2)和延迟14 d移栽(T3),并取样进行农艺性状、产量、物质代谢分析。【结果】不同移栽期对应不同的气候环境,导致烟株形态、代谢及发育的改变。相对于提前14 d移栽(T1)和延迟14 d移栽(T3),正常移栽(T2)旺长期和成熟期烟株叶片最厚、栅栏和海绵组织比适中,烟株具有最好的株高和叶面积并收获较高的烟叶产量与单位产值。【结论】清香Ⅲ型烟区以云烟87为品种,5月初为最佳移栽期。     

利用卡那霉素间接鉴定转基因抗虫棉的研究

研究了利用卡那霉素间接鉴定转基因抗虫棉的方法。结果表明,在棉花苗期使用8000mg/kg卡那霉素溶液处理子叶,或者在蕾期使用6000mg/kg卡那霉素溶液处理棉株顶部第2片展开叶,7～9d后非转基因棉株的叶片点液处出现黄色斑块,而转基因抗虫棉的叶片仍为正常绿色,从而简便有效地鉴别出转基因抗虫棉。经网室接虫测试和室内饲养生物学测试方法验证,该方法结果准确。     

烤烟新品种云烟100的选育及其特征特性

云烟100是云南省烟草农业科学研究院以云烟87为母本、KX14为父本经系谱法选育而成的烤烟新品种,2009年通过全国烟草品种审定委员会审定(国审烟200909)。云烟100株式塔型,叶片长椭圆形,田间长势强,大田生育期平均为125d;平均打顶株高113.3cm,有效叶数20片左右;中抗赤星病,综合抗性与K326相当;平均产量2 763.0kg/hm~2,上等烟比例35.8%,综合经济性状优于K326;原烟外观质量略优于或与K326相当,主要化学成分比例协调;原烟感官质量优于K326,质量档次中等至中偏上;适宜我国南方烟区种植。     

抑芽药棒抑制烟芽效果及对上部烟叶生长的影响

为克服烟株抑芽方法的不足,在烟株打顶后采用3种抑芽药棒对云烟85烟草品种进行了抑芽处理的试验。结果表明,抑芽药棒对烟株上部叶片生长没有不良影响,对抑制烟草侧芽生长效果明显。3种抑芽药棒的抑芽效果为:C>A>B。     

根癌农杆菌介导的芪合酶基因转化烟草遗传体系的优化

【目的】研究根癌农杆菌介导的芪合酶基因转化烟草遗传体系的优化条件。【方法】以"中烟99"叶片为受体,采用根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens,GV3101)介导法,将芪合酶基因导入烟草基因组,并对其遗传体系进行了优化,对筛选获得的转基因烟草植株进行检测。【结果】根癌农杆菌介导的芪合酶基因遗传转化的最佳条件为:将预培养2 d的烟草外植体,用稀释10倍的GV3101菌株菌液(OD600=0.6)浸染8 min后,共培养3 d,然后转入含卡那霉素(Km)50 mg/L和羧苄青霉素(Cb)500 mg/L的筛选分化培养基上诱导分化,待抗性芽长到2~3 cm后,转入含Km 50 mg/L和Cb 500 mg/L的筛选生根培养基上进行筛选,在以上最佳遗传转化条件下,初步筛选到54株转化体,经PCR和RT-PCR检测获得25株转化烟草植株。【结论】经卡那霉素筛选、PCR、RT-PCR检测后,初步证明芪合酶基因已被整合到烟草基因组中,并可以正常转录。     

卡那霉素叶片涂抹法筛选转基因大豆植株的有效性

以吉林小粒1号大豆为材料进行卡那霉素梯度涂抹试验,确定卡那霉素筛选的最佳浓度和筛选临界观察时间,并在此基础上,对转基因大豆植株(含np tⅡ基因)分离后代进行卡那霉素涂抹检测和PCR检测,检验2种方法的符合度。结果表明,卡那霉素的最佳筛选浓度为500 m g/L,观察时间以3 d为宜;抗和高抗卡那霉素植株2种检测方法的符合度为90.8%,感和高感卡那霉素植株的符合度为87.1%。可见,卡那霉素叶片涂抹法完全可以用于大豆转基因植株的快速筛选。     

轮状病毒疫苗基因转化烟草的研究

以烟草叶片的切段为外植体,用含有轮状病毒疫苗基因的农杆菌浸泡5 min,然后共培养2 d,再转入MS+6-BA 1.0 mg/L+IAA0.1 mg/L,添加100 mg/L卡那霉素和500 mg/L氨苄青霉素的筛选培养基上筛选,得到卡那霉素抗性苗32株。对其中的4株卡那霉素抗性苗进行PCR分子检测,结果表明,目的基因已经整合进烟草基因组中。     

转群体感应淬灭基因attM烟草抗青枯病的研究

自根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)克隆获得attM基因。采用叶盘转化法,农杆菌介导转化烟草,经过卡那霉素抗性筛选获得抗性愈伤组织,对其分化产生的植物株系进行PCR、PCR-Southern和荧光定量PCR及GUS染色检测分析。结果表明:attM基因被成功插入烟草基因组DNA中。在转基因株系中均能够表达,相对表达量最大可达125.8,最小为31.0。以野生型烟草和转pBI121空载体的烟草为对照,分别进行了离体及活体检测试验,结果表明:转attM基因烟草植株对茄科雷尔氏菌引起的青枯病抗性显著。1×107～1×108CFU.mL-1的青枯菌接种离体叶片,野生型烟草和转pBI121空载体的烟草的中毒面积与接种面积比值为15～25,转基因植株的比值低于3;青枯菌3×106CFU.mL-1伤根接种盆栽烟草植株14d,野生株和转空载体烟草均青枯死亡,病情指数为100,转基因植株病情指数为31.25。     

烟草转硝酸还原酶基因高效遗传转化研究

通过对农杆茵介导烟草遗传转化方法的优化,建立了快速高效烟草叶盘遗传转化体系.用0D600为0.5的农杆茵悬浮液浸染大小约1.0 cm×1.O cm烟草叶盘5～10 min,再置于MS附加2.25 mg/L 6-BA和0.10 mg/LNAA的分化培养基上,在100 mg/L卡那霉素选择压下,21～28 d可获得抗性不定...     

转獐茅AlNHX基因烟草的耐盐生理研究

[目的]研究从禾本科盐生植物獐茅中分离的液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白基因AlNHX在盐胁迫下的功能和表达。[方法]转化AlNHX的烟草经过抗生素和PCR筛选后,用不同浓度的NaCl处理30 d,测定其单株干重、相对电导率、细胞渗透压以及K+/Na+比。[结果]在不同浓度NaCl处理下,转基因烟草的相对干重和细胞渗透压均高于对照烟草。在300 mmol/L NaCl处理下,转基因烟草的相对电导率明显低于对照。K+、Na+含量测定表明在盐胁迫下转基因烟草的根部和叶片均维持一个相对较高的K+/Na+水平。[结论]AlNHX是一个有效的耐盐基因,可进一步应用于单子叶农作物的基因改良研究。     

Activity of the photosynthetic apparatus and antioxidant enzymes in leaves of transgenic <Emphasis Type="Italic">Solanum lycopersicum</Emphasis> and <Emphasis Type="Italic">Nicotiana tabacum</Emphasis> plants,with <Emphasis Type="Italic">FeSOD1</Emphasis> gene

Introduction of the FeSOD gene enhanced the stability of the photosynthetic apparatus of plants to the action of oxidative stress caused by UV irradiation. The expression of Arabidopsis thaliana FeSOD gene, targeting the enzyme in chloroplasts due to a signal sequence, leaded to significant changes in ultrastructure of cell subcompartments of tobacco and tomato leaves. The activity of superoxide dismutase in leaves of transgenic tomato plants exceeded the value of activity of this enzyme of control plants. Transgenic tobacco plants showed increasing in SOD activity compared with control non-transgenic tobacco. The activity of AP in the leaves of transgenic tobacco and tomato plants was similar with that of control non-transgenic plants, but activity of one accession of transgenic tomato, which is also characterized by high values of SOD activity, exceeded the value of control plant. Differences in ultrastructural organization of chloroplasts in the cells of transgenic and control tobacco and tomato plants have been manifested in a strong enlargement in the size of plastoglobuli. These distinctions were evident especially in the cells of the leaf parenchyma of transgenic tomato as well as transgenic tobacco. Also, a quantity of starch grains in the plastids of guard cells was increased. Chloroplasts in the cells of leaf parenchyma in transgenic plants contained less a starch grains than in wild-type plants.     

本生烟草组培再生及遗传转化的研究

[目的]获得本生烟草转胰高血糖素样肽-1基因植株。[方法]以本生烟草无菌苗叶片为外植体材料,建立本生烟草再生系统,通过农杆菌叶盘法浸染进行遗传转化,获得本生烟草转胰高血糖素样肽-1基因植株。[结果]通过多重比对和重复,确定本生烟草叶片最适分化培养基为MS＋1.5mg/L6-BA＋0.1mg/LNAA,生根培养基为MS＋0.1mg/LIBA;经由卡那霉素浓度梯度试验,确定选择压力为5mg/L卡那霉素;对经卡那霉素筛选获得的抗性芽进行GUS组织化学检测,获得阳性信号。[结论]初步证实外源基因胰高血糖素样肽-1已整合到本生烟草基因组中。     

A simple and general method for transferring genes into plants

Transformed petunia, tobacco, and tomato plants have been produced by means of a novel leaf disk transformation-regeneration method. Surface-sterilized leaf disks were inoculated with an Agrobacterium tumefaciens strain containing a modified tumor-inducing plasmid (in which the phytohormone biosynthetic genes from transferred DNA had been deleted and replaced with a chimeric gene for kanamycin resistance) and cultured for 2 days. The leaf disks were then transferred to selective medium containing kanamycin. Shoot regeneration occurred within 2 to 4 weeks, and transformants were confirmed by their ability to form roots in medium containing kanamycin. This method for producing transformed plants combines gene transfer, plant regeneration, and effective selection for transformants into a single process and should be applicable to plant species that can be infected by Agrobacterium and regenerated from leaf explants.     

不同启动子在转基因烟草中抗番茄黄化曲叶病毒的研究

为了提高植物对番茄黄化曲叶病毒的抗性,利用CaMV35S启动子、棉花韧皮部特异启动子PGHNBS、拟南芥韧皮部特异启动子SUC2分别构建了含有不同启动子控制下的烟粉虱内GroEL基因的植物表达载体P-Gro-EL、P-PGHNBS-GroEL、P-SUC2-GroEL。通过农杆菌介导转化法,获得了一批抗卡那霉素的转化再生烟草植株。RT-PCR结果表明,3个启动子皆驱动GroEL基因在转基因烟草中表达。对转化再生烟草的一次病毒注射侵染结果显示,共有19株抗性烟草植株,其中,转P-GroEL载体的有7株,转P-PGHNBS-GroEL和P-SUC2-GroEL载体的各有6株;2次病毒注射侵染的结果显示,获得7株抗性烟草植株,它们是转P-GroEL载体的1株、转P-PGHNBS-GroEL和P-SUC2-GroEL载体的各3株。2次接种的试验结果表明,PGHNBS和SUC2转基因烟草植株的抗病效果均比CaMV35S转基因植株明显。证明利用韧皮部特异表达GroEL基因可以获得抗番茄黄化曲叶病毒的转基因植物。     

茶树咖啡碱合成酶基因cDNA在烟草中的表达

为了在烟草中合成咖啡碱,将咖啡碱合成酶(Tea caffeine synthase,TCS)基因cDNA全序列克隆到双元载体pBI121中,通过农杆菌叶盘转化法将TCS基因成功转入烟草,结果得到72株转基因烟草植株。对其中3株转基因植株进行PCR检测和PCR-Southern检测,证实TCS基因已整合到基因组中;RT-PCR和Northern分析显示,TCS在这些植株中均能正常转录。用从转基因植株中提取的粗酶液进行体外酶促反应,能催化7-甲基黄嘌呤和可可碱向咖啡碱的转变,由此表明,转基因烟草植株中能产生具有正常生物学活性的TCS,但从3株转基因烟草中均未检测到咖啡碱。     

过量表达棉花GhSAP1提高转基因烟草的耐盐性

【目的】SAP（stress-associated protein）是一类涉及胁迫应答和调控的锌指蛋白。克隆并分析其对逆境胁迫应答的反应,为棉花抗逆育种提供候选基因。【方法】通过电子克隆方法并经RT-PCR验证获得棉花锌指蛋白基因GhSAP1,将带有目的基因的载体质粒通过PEG介导转化棉花叶肉原生质体细胞,瞬时表达分析其编码蛋白的特性及亚细胞定位信息。通过qRT-PCR技术分析目标基因的组织表达特征及非生物胁迫条件下的表达特性。通过农杆菌介导叶盘转化法,经组织培养获得转基因烟草进行异位表达,检测其与抗逆相关的生理指标,证明其提高植物抗逆能力。【结果】GhSAP1 ORF长度为543 bp,编码一条含180个氨基酸残基的多肽。其理论等电点8.97,分子量19.3 kD,具有典型的A20/AN1锌指结构域。亚细胞定位显示该基因编码的蛋白定位于细胞核上。不同组织器官表达分析显示,GhSAP1在根、茎、叶中的表达量高,而在开花后5 d的胚珠中表达量很低。GhSAP1受盐胁迫诱导,高盐处理2 h后表达量最高。利用含100 μg•mL-1 Kan的培养基进行抗性筛选转基因后代,结合目标基因的PCR与RT-PCR验证,获得转GhSAP1的转基因烟草阳性株系10个。目标基因GhSAP1均能在烟草基因组中整合并异位过量表达。随机选择3个转基因烟草株系,盐胁迫处理显示,发芽一周的种子在含200 mmol•L-1 NaCl培养基上胁迫12 d,转基因植株幼苗平均成活率为81.7%,比非转基因对照植株增加近3倍,其平均根长为3.05 cm,极显著高于非转基因对照。利用GhSAP1表达较高的L2纯系进行成株期烟草盐胁迫处理30 d,转基因烟草后代的SOD活性和可溶性总糖含量增幅分别为23.89 U•g-1 FW和8.37 %,均显著高于非转基因对照;与未胁迫处理相比,转基因植株的叶绿素含量降低幅度仅为0.17 mg•g-1 FW,而非转基因对照降低了0.39 mg•g-1 FW;盐胁迫处理后,转基因植株的MDA含量增幅为7.42 nmol•g-1FW,而非转基因对照增幅达20.85 nmol•g-1FW;在盐胁迫下,转基因植株具有更强的K+根部运输到植株绿色组织能力,其地上部的K+/Na+为1.23,显著高于非转基因对照。【结论】GhSAP1在参与植物的逆境应答反应机制中具有重要作用,过量表达GhSAP1可显著提高转基因烟草的耐盐能力。