‘红阳’猕猴桃MYB基因的克隆与表达

为探讨MYB基因在‘红阳’(Actinidia chinesis‘Hongyang’)猕猴桃果实着色过程中的重要作用,利用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)结合快速扩增cDNA末端(RACE)技术克隆了‘红阳’猕猴桃的一个MYB转录因子基因。该基因的cDNA全长962bp,序列包含一个666bp的开放阅读框(ORF),编码221个氨基酸残基的蛋白质,其N端具有2个典型的MYBDNA结合域。同源性分析显示,该酶的氨基酸序列与矮牵牛、葡萄、番茄、金鱼草等植物中花青素途径相关的MYB转录因子基因的相似性都达到80%以上。实时荧光定量PCR分析结果显示,AcMYB在‘红阳’猕猴桃中的表达量与花青素含量呈正相关,二者均在果实转色主要阶段维持较高水平,推测该基因在调控花青素合成的过程中起着重要作用。     

甘蓝型油菜BnaWRKY30-like基因cDNA序列克隆 及生物信息学分析

WRKY 转录因子是植物所特有的一个超级基因家族，能调控植物生长发育过程及逆境反应。根据转录组测序获得的 EST 序列设计引物, 利用 RT-PCR 及 RACE 技术克隆了甘蓝型油菜WRKY30 基因 cDNA 全长序列, 并运用生物信息学手段对序列进行了分析及预测。结果表明：BnaWRKY30-like 基因全长cDNA序列中包含102 bp 的5′-UTR序列，188 bp 的3′-UTR序列以及942 bp的完整ORF，编码313个氨基酸。该转录因子蛋白相对分子量为35 319.85D，等电点为 6.22，基本氨基酸中含量最高的丝氨酸（Ser），313个氨基酸中含有41个酸性氨基酸，34个碱性氨基酸，在121～182区域含有一个典型的WRKY结构域。亚细胞定位预测发现该转录因子定位于细胞核的可能性最高。蛋白质的二级结构预测表明共有α-螺旋占26.20%，延伸链占10.54%，β-转角占4.47%，无规则卷曲占58.79%。BnaWRKY30-like基因编码的蛋白具有典型的WRKY转录因子特征，与拟南芥WRKY30基因亲缘关系近，可能在油菜早期生长发育过程及盐胁迫中的发挥调控作用。     

草莓花青苷分子调控机理的初步研究

为了初步阐明草莓花青苷合成调控的分子机理,文章从章姬、红颊、丰香、红花、越丽、越珠和10-26-77等草莓品种(系)中扩增了与调控草莓花青苷合成相关的MYB10和MYB1基因的c DNA和DNA全长以及MYB10基因的启动子序列。利用荧光定量PCR分析了章姬和10-26-77不同果实发育阶段的基因表达模式,利用高效液相色谱法(HPLC)分析了这2个草莓品种(系)在不同发育时期的花青苷含量。结果表明,不同草莓品种(系)的MYB10和MYB1基因在c DNA序列上没有差别,但DNA序列上存在SSR位点。MYB10在调节草莓果实花青苷合成代谢中起着决定性的作用,花青苷含量的变化与MYB10基因的表达变化趋势一致。不同草莓品种在MYB10转录因子基因启动子序列上的差异是导致基因转录调控不同的根本原因,从而调控草莓花青苷合成基因的转录表达水平,使得草莓花青苷含量有差异,呈现出颜色上的深浅。     

草莓MYB类转录因子FaMYB5基因的克隆与表达分析

以丰香草莓（Fragaria ×ananassa cv. Toyonaka）为试材,通过同源克隆技术获得FaMYB5基因全长编码序列,运用生物学软件对该序列进行相关生物信息学分析,同时采用实时荧光定量PCR方法对FaMYB5基因在果实不同发育阶段的表达模式进行研究。FaMYB5基因的cDNA全长为822 bp,编码273个氨基酸,蛋白质分子量为29159 ku,等电点为5709,与森林草莓的FvMYB5同源性达957%。实时荧光定量PCR分析显示,随着果实发育成熟,FaMYB5基因的表达逐渐上升。在果实的小绿期（SG）,FaMYB5基因的表达量最低。但是在白果期（WT）出现1个降低的峰值,其表达量略高于小绿期,草莓果实开始转红时其表达量又逐渐上升,在果实全红期（FR）达到最大。结果获得了丰香草莓MYB类转录因子FaMYB5基因的cDNA全长,其表达存在差异。     

草莓乙烯响应因子FaERF003基因克隆与表达模式分析

[目的]为了探明乙烯响应因子FaERF003在草莓果实成熟中的作用.[方法]转录组测序和实时荧光定量PCR检测FaERF003基因在草莓果实不同发育时期的表达水平,利用生物信息学方法分析FaERF003 DNA结合域的氨基酸序列与蛋白质结构,烟草叶片瞬时转化分析FaERF003亚细胞定位.[结果]FaERF003基因CDS区全长894 bp,编码297个氨基酸,预测FaERF003蛋白的分子量为32.9 kD,等电点为8.55,属于AP2/ERF蛋白超家族.FaERF003在草莓果实成熟过程中表达迅速升高且与乙烯前体ACC含量变化趋势相似,推测该基因与乙烯信号转导相关.FaERF003蛋白定位于细胞核和胞质.[结论]FaERF003可能作为乙烯响应因子与乙烯调控草莓果实成熟密切相关.     

重瓣榆叶梅PrtSHP的基因克隆与序列结构分析

采用同源克隆法结合3′-RACE技术从重瓣榆叶梅(Prunus triloba var.Plena)中分离得到了1个雌蕊和果实发育调控基因SHP的同源基因PrtSHP的全长cDNA(GenBank登录号:JF911701).其cDNA全长970 bp,包括1个编码244个氨基酸的735 bp的完整开放阅读框.蛋白质序列比对和分子系统发生分析表明,PrtSHP是拟南芥的SHP的同源基因,其编码的蛋白质的C末端结构域具有2个高度保守的模体(AG Ⅰ模体和AG Ⅱ模体),属C类转录因子中PLE进化系.     

马铃薯乙烯响应因子基因的克隆表达及生物信息学分析

根据番茄ERF5基因(NM_001247583.1)序列设计引物,采用RT-PCR方法得到马铃薯ERF基因的cDNA,并对其进行生物信息学及表达分析.结果表明:该cDNA全长789bp,阅读框为732bp,编码243个氨基酸.序列同源性分析表明该基因序列与番茄ERF5基因的序列同源性达82%,氨基酸序列同源性达70%.对该马铃薯ERF基因的氨基酸序列经BLAST进行多序列比对,发现该氨基酸序列的98～160bp为AP2结构域,属于AP2/EREBP转录因子的EREBP亚族ERF类.蛋白质三级结构预测表明该基因的AP2结构域非常保守.对ERF基因进行荧光定量PCR分析,表明该基因可能参与了马铃薯块茎解除休眠与发芽过程的调控.     

核桃油脂合成转录因子JrWRI1基因的克隆及生物信息学分析

为研究核桃果实油脂合成与积累的分子调控机理,以核桃果实种仁cDNA为模板克隆得到油脂合成关键转录因子JrWRI1基因,其cDNA序列全长为1 230 bp,编码409个氨基酸。通过对其结构特征、生物学特性进行分析,发现该基因编码蛋白属于AP2/ERF转录因子超级家族,具有特异的DNA结合序列,调节生物合成和代谢过程,定位于细胞核中,符合转录因子行使功能的特点。并构建了JrWRI1超表达重组载体,为进一步研究JrWRI1在核桃果实油脂合成与积累过程中的功能奠定基础,也为利用分子手段加快高油核桃新品种的选育提供参考。     

SA、MeJA、ACC和苹果轮纹病病原菌诱导湖北海棠MhWRKYl基因的表达

【目的】从湖北海棠叶片中克隆MhWRKY1转录因子的全长cDNA序列,分析该基因在各种组织中(叶、茎、根)的表达特性,并分析SA、MeJA、ACC在叶、茎、根中诱导MhWRKY1基因的表达模式以及苹果轮纹病病原菌诱导条件下湖北海棠叶片中该基因的表达特性。【方法】利用电子克隆技术和RT-PCR验证相结合的方法,从SA诱导的湖北海棠全长cDNA文库中,克隆MhWRKY1转录因子的全长序列;利用生物信息学的方法对其进行结构和功能的初步分析;利用实时荧光定量RT-PCR技术分析该基因在不同组织中的表达以及在SA、MeJA、ACC和苹果轮纹病病原菌诱导下的表达特性。【结果】克隆了MhWRKY1基因的全长cDNA序列为1 338 bp,GenBank数据库登录号为FJ598139。生物信息学分析表明,该基因最大开放阅读框为993 bp,编码330个氨基酸。推导的氨基酸序列与杨树WRKY26、杨树WRKY20、大豆WRKY,马铃薯WRKY2、烟草WRKY、拟南芥WRKY7、水稻WRKY53的同源性分别为68%、68%、66%、60%,59%,49%和43%。该转录因子含有1个WRKY结构域,其N端含有1个WRKYGQK结构...     

玫瑰GASA4-like基因的克隆及其序列分析

从大马士革玫瑰(Rosa damascena)中利用同源克隆结合RACE的方法首次获得了一个GASA4-like基因的cDNA和DNA序列全长(GenBank登陆号FJ595792,FJ595793),并利用TAIL-PCR的方法克隆了其部分启动子序列。结果表明,玫瑰GASA4-like基因包含4个外显子,3个内含子,开放阅读框为327bp,编码108个氨基酸序列。对推导的氨基酸序列分析发现,N末端1~26个氨基酸是一信号肽序列,C末端含有12个保守的半胱氨酸残基,具有GASA基因家族共同的一些结构特征。系统进化分析表明,玫瑰GASA4-like与分生组织中表达的GASA蛋白聚为一类。启动子顺式作用调控元件分析表明,GASA4-like基因上游318bp的部分启动子含有诱导表达调控元件和一些转录因子的结合位点;最后,对GASA4-like基因可能的生物学功能进行了预测。     

刺梨果实半乳糖内酯脱氢酶基因cDNA片段的克隆及在不同器官的表达

 根据GenBank中登录的拟南芥、花椰菜、甘薯和草莓等植物的半乳糖内酯脱氢酶基因(GalLDH)保守序列设计引物，采用RT-PCR法，从刺梨果实中扩增出该基因的cDNA片段855 bp并测序。序列分析表明，刺梨GalLDH与草莓GalLDH的相似性达92%，与其它植物同源基因的相似性也在80%左右；该片段编码285个氨基酸，推导的氨基酸序列与其它植物同源基因的相似性高达75%～87%。Northern杂交分析表明，该基因在刺梨不同器官中的表达差异明显：在果实内有很高的表达水平，叶内较弱，而在茎和根内只能检测到微弱的信号。这种差异与不同器官中维生素C的积累量高度一致。     

草莓miR156靶基因SPL9的克隆与表达分析

 【目的】从草莓中克隆SPL(SQUAMOSA promoter binding protein-like)转录因子基因SPL9，并分析其在草莓植株不同生长时期的表达水平及与miR156的表达关系，探讨SPL9在草莓植株生长发育中的作用。【方法】根据苹果SPL基因家族的保守序列设计简并引物，以草莓叶片为试材，利用RT-PCR克隆草莓SPL9基因片段，在此基础上利用RACE方法克隆SPL9的cDNA全长。利用实时定量RT-PCR技术分析草莓叶片中SPL9及miR156的表达水平。【结果】从草莓（Fragaria×ananassa）品种‘全明星’中克隆出SPL9基因的cDNA全长序列，命名为FaSPL9。其CDS长度为1 143 bp，编码381个氨基酸，与拟南芥AtSPL9、葡萄VvSPL9、枳PtSPL9、苹果MdSPL9以及玉米ZmSPL9的氨基酸序列同源性分别为：40.30%、64.57%、56.09%、70.33%，38.35%。FaSPL9有着高度保守的SBP结构域和一个双向核定位信号KRXXXRRRK。FaSPL9基因序列中包含miR156的靶位点，实时定量RT-PCR结果表明，在草莓植株的不同生长时期FaSPL9的表达量不同，且与miR156呈现相反的表达模式。【结论】从草莓中分离出FaSPL9基因，其作为miR156的靶基因，推测FaSPL9对草莓植株的生长发育具有重要的调控作用。     

桃果实磷脂酶Dα基因的电子克隆及序列分析

 【目的】克隆桃果实中的磷脂酶Dα基因,并对其进行序列分析和低温表达模式分析。【方法】采用电子克隆与RT-PCR相结合的方法分离桃果实PLDα 基因cDNA全长序列;半定量RT-PCR和Northern杂交检测目的基因在桃果实低温贮藏过程中的表达情况。【结果】成功获得全长为2 859 bp的桃果实PLDα基因序列,该序列具有完整的开放阅读框架（ORF,172～2 604 bp）,编码810个氨基酸。对ORF进行的RT-PCR验证结果与电子克隆序列一致。序列分析显示,桃果实PLDα基因编码的氨基酸序列与草莓、番茄、葡萄等物种的磷脂酶Dα氨基酸序列之间具有高度的保守性,含有N端C2结构域及两个保守的活性中心。半定量RT-PCR和Northern杂交分析显示,桃PLDα基因在低温贮藏过程中被诱导表达。【结论】本研究首次通过电子克隆的方法获得了桃果实PLDα基因的全长序列,揭示了其序列特征,并初步明确了其在桃低温贮藏期间的表达模式。结果证明基于EST数据库的电子克隆已经是获取植物新基因的有效途径,同时为更深入研究桃果实的耐冷性及低温贮藏方法奠定了基础。     

草莓果实cDNA文库的构建及鉴定

草莓是研究果实发育的模式植物。基因表达谱分析已成为目前分子生物学领域重要的研究方向。草莓cDNA文库构建是研究果实发育基因表达的基础工作。本研究从草莓白果中提取高质量的总RNA,通过MMLV反转录酶的作用,把RNA中的mRNA反转成cDNA第一链,再利用特异引物通过LD-PCR扩增合成双链cDNA。将纯化带有黏性末端的双链cDNA与λTrip I Ex2载体进行连接,最后对重组载体进行E.coli XL1-Blue体外包埋为cDNA原始文库。经过鉴定,原始文库的滴度为1.13×10-7 cfu/mL,重组率为100%,插入片段多分布在0.2~2.0kb之间,表明构建的草莓果实cDNA文库质量较高,能够满足后续的分子生物学研究工作的需要,同时也为其他果树相关研究提供借鉴。     

草莓八氢番茄红素合成酶基因的克隆及其表达特性

 【目的】分离和克隆草莓果实八氢番茄红素合成酶基因psy,分析其序列特征,了解其在不同组织部位的表达情况。【方法】采用RT-PCR和RACE技术从草莓果实中克隆草莓类胡萝卜素合成途径中关键基因psy,用生物信息学方法对获得的cDNA序列及推定氨基酸序列进行分析,并用半定量PCR法研究psy基因在不同组织中的表达。【结果】分离到psy基因,GenBank登录号为FJ784889。该cDNA全长1 458 bp,具有1个1 194 bp的完整开放阅读框(ORF),编码398个氨基酸。序列分析表明,psy编码的氨基酸序列与其它植物的PSY蛋白有很高的相似性。系统进化树分析显示,草莓PSY与胡萝卜和玉米的PSY蛋白亲缘关系比较近。原核表达结果表明psy基因在大肠杆菌中获得高效表达。利用半定量RT-PCR技术进行组织表达模式分析发现,psy基因在草莓的花、叶片和果实中均有表达。表达量为花＞红果＞粉红果＞白果＞青果＞老叶＞新叶。【结论】从草莓中克隆到类胡萝卜素生物合成的关键酶基因psy,该基因可能参与调控类胡萝卜素的合成。     

玉米ZmPTF1基因克隆和过表达分析

PTF是一类具有bHLH结构域的转录因子,在低磷胁迫应答中调节一系列下游磷胁迫基因的表达.根据拟南芥和水稻中的序列信息,通过RACE的方法获得ZmPTF1的全长cDNA序列.序列分析表明该1709bp的cDNA片段含有1446bp的完整开放读码框,编码481个氨基酸的多肽链,含有一个bHLH结构域,与已报道的OsPTF1在氨基酸水平上有65%的相似性.构建了pCAMBIA1300-Pubi-ZmPTF1-Tnos-als质粒转化玉米,得到过表达的转基因后代.对低磷营养液浇灌下的T2代植株分析表明:过表达ZmPTF1促进了植株根系的发育,提高了植株对低磷环境的耐受性.     

16个草莓品种品系果实品质的多元分析与评价

为筛选出综合果实品质优良的草莓品种,丰富草莓栽培、育种、加工及利用依据,以山西省内16个草莓品种品系为试材,测定其外观性状、营养物质及酚类物质含量等果实品质因子,并采用相关性分析、主成分分析以及主成分综合评分法进行比较和评价。研究表明,主成分分析可将草莓果实的9个品质因子简化为酚类构成因子、外观品质构成因子和营养构成因子3个类型的因子,其可反映81.0141%的原始数据信息量;16个草莓品种品系中,‘枥乙女’、‘章姬’和‘06-2-8’综合品质最佳,而‘温塔娜’、‘甜查理’和’05-1-5’综合品质最差,直观分析无法全面地对多个草莓品种品系的果实品质进行比较,说明草莓果实品质分析有必要运用科学的数学方法,减少主观片面性。