猪细小病毒N株弱毒苗的保存温度和时间对豚鼠抗体反应的影响

用不同保存温度和时间的猪细小病毒Ｎ株弱毒苗注射豚鼠,检测ＰＰＶ－Ｎ株弱毒苗的保存期,结果为４℃至少能保存一年,－２０℃至少能保存３年。根据抗体反应的规律性,证明豚鼠可用作ＰＰＶ弱毒苗抗体检测的试验动物。     

猪细小病毒病弱毒疫苗的保存期试验

将2批猪细小病毒病弱毒疫苗分别在2—8℃保存11个月、12个月、13个月,-20℃保存22个月、24个月、26个月,进行物理性状、无菌检验、支原体检验、外源病毒检验、安全试验及免疫效力试验,探讨不同保存条件和保存期对疫苗的影响。结果表明:物理性状、无菌检验、支原体检验、外源病毒检验均符合《中国兽药典》的要求。安全试验每批次疫苗接种乳鼠全部健活;以10头份/头的剂量接种PPV HI抗体阴性猪,接种后定期采集血样和鼻肛分泌物进行病毒分离,结果均为阴性。疫苗在2—8℃保存至13个月,-20℃保存至26个月TCID_(50)均≥10~(6.25)笛/头份;接种PPV HI抗体阴性豚鼠抗体全部转为阳性;疫苗免疫PPV HI抗体阴性猪,免疫后1个月、7个月分别用PPV强毒攻击获得100%保护。     

H9亚型禽流感病毒毒种保存期试验

将H9亚型禽流感病毒TJ株检验和基础种子批冻干毒存放于-70℃保存,并于保存当日和保存后3、6、9、12、18和24个月,随机抽样,分别进行病毒含量测定、血凝价测定、毒力测定和无菌检验;将检验和生产种子批湿毒于-20℃保存,并于保存当日和保存后3、6、9和12个月,随机抽样分别进行病毒含量测定、血凝价测定、毒力测定和无菌检验。结果表明,检验种子和基础种子冻干毒保存24个月病毒含量和血凝价与保存当日无显著差异,无细菌、霉菌污染;检验用冻干强毒对42和56日龄鸡的毒力与保存当日无明显变化,无细菌、霉菌污染。检验用强毒与生产种子批湿毒保存9个月,毒力和病毒含量、血凝价无明显变化,无细菌、霉菌污染。冻干毒种更长时间的保存期正在进行中,所以将H9亚型禽流感病毒TJ株冻干毒于-70℃保存的有效期暂定为21个月;将湿毒于-20℃保存的有效期定为6个月。     

猪细小病毒HNLY201301株遗传特性及其对小鼠的致病性研究

【目的】探究猪细小病毒HNLY201301株的遗传特性及其对小鼠的致病性。【方法】对HNLY201301株进行遗传学分析、生物学分析以及小鼠攻毒试验。【结果】HNLY201301株属于经典猪细小病毒1型（PPV1），具有强毒株的遗传特性。该毒株可在猪肾（PK-15）细胞上复制，其滴度最高可达10-8.45TCID50/mL。该毒株的血凝谱广，能凝集小鼠、大鼠、豚鼠、兔、鸡、鸭和猪的红细胞。该毒株可通过静脉注射和阴道灌注感染小鼠，主要引起小鼠子宫损伤。【结论】细小病毒仍在我国猪场间流行，且具有较强致病性，对该病的防控应引起重视。     

不同温度下蓝舌病病毒的毒价变化研究

[目的]为蓝舌病病毒的长期保存奠定基础。[方法]在70、-20、4和20℃下保存蓝舌病病毒1个月后,测定其毒价变化,研究不同温度对蓝舌病病毒毒价的影响。[结果]在室温和4℃下保存1个月后蓝舌病病毒毒价保持不变。在-70℃下保存1个月后蓝舌病病毒毒价从原来的5.5降至4.2。在-20℃下保存1个月蓝舌病病毒毒价变化最大,从原来的5.5降至2.8。[结论]长期保存时,应将蓝舌病病毒在-20℃下保存。     

猪细小病毒病、伪狂犬病二联灭活疫苗保存期试验

将试制的3批细小病毒病、猪伪狂犬病二联灭活疫苗(批号201601、201602和201603),置于2～8℃冰箱内保存,间隔3、6、9、12和15个月后,分别取出进行疫苗的性状和效力检验,以确定疫苗的稳定性和保存期。结果,疫苗经保存15个月后,物理性状符合现行《中国兽药典》标准;疫苗接种豚鼠进行猪细小病毒部分的效力检验,HI抗体效价均≥1:64,对照鼠HI效价≤1:8;疫苗接种猪伪狂犬病毒中和抗体阴性健康猪进行猪伪狂犬病毒部分效力检验,血清中和指数均≥316,表明接种猪能产生对猪伪狂犬病毒坚强免疫力。试验结果表明,疫苗于2～8℃保存15个月的过程中,稳定性良好,物理性状无变化,免疫效力未降低,保存期达到15个月。     

猪细小病毒病、伪狂犬病二联灭活疫苗保存期试验

将试制的3批细小病毒病、猪伪狂犬病二联灭活疫苗(批号201601、201602和201603),置于2～8℃冰箱内保存,间隔3、6、9、12和15个月后,分别取出进行疫苗的性状和效力检验,以确定疫苗的稳定性和保存期。结果,疫苗经保存15个月后,物理性状符合现行《中国兽药典》标准;疫苗接种豚鼠进行猪细小病毒部分的效力检验,HI抗体效价均≥1:64,对照鼠HI效价≤1:8;疫苗接种猪伪狂犬病毒中和抗体阴性健康猪进行猪伪狂犬病毒部分效力检验,血清中和指数均≥316,表明接种猪能产生对猪伪狂犬病毒坚强免疫力。试验结果表明,疫苗于2～8℃保存15个月的过程中,稳定性良好,物理性状无变化,免疫效力未降低,保存期达到15个月。     

犬细小病毒AT-7株的分离与鉴定

通过采集疑似感染细小病毒(CPV)犬粪便,采用同步培养法接种胎猫肾细胞(FK81)进行病毒分离鉴定.通过PCR检测、HA试验、电镜观察、PEG纯化,获得1株犬细小病毒,并命名为AT-7株.感染的F81细胞48 h后出现明显的细胞病变;在感染的F81细胞中扩增出CPV基因的特异性片段;病毒液可凝集猪红细胞,血凝价为1:128,血凝性能被特异性抗体抑制.     

果子狸细小病毒的分离与鉴定

用F81细胞从河南送检的患有肠炎的果子狸粪便样品中分离出一株病毒，经形态学、理化学、生物学和分子病毒学实验鉴定是一株CPV-2a的突变株。此毒株在F81细胞上生长，能产生CPV感染的特征性细胞病变，细胞肿胀、变圆、破碎、脱落；病毒粒子二十面体立体对称，直径为20～24nm；无囊膜，能抵抗氯仿的处理，耐酸，耐热，但能被5-IUDR抑制。可凝集猪红细胞，不凝集鸡、豚鼠、大鼠、兔、人“O”型红细胞，能被抗CPV抗体所抑制。设计特异性细小病毒引物扩增VP2基因的两个片段，并进行测序，分析结果表明，该毒株是在CPV-2a的基础上其VP2的第297位氨基酸发生A→S突变，第300位氨基酸发生G→S突变，第301位氨基酸发生T→A突变。该毒株暂定名为PV／GZL/H／1／02。该病毒能感染犬。     

猪细小病毒的分离与鉴定

利用ST细胞对采集的猪木乃伊胎儿内脏进行病毒分离,ST细胞产生规律性病变,表现为细胞圆缩、拉网、灶性脱落等变化;分离毒适应于ST细胞培养,并可凝集豚鼠红细胞,TCID_(50)随着传代次数升高而逐渐增高;分离毒能被PPV特异性阳性血清中和,而不能被PPV阴性血清中和;对细胞培养物进行PPV荧光抗体染色可见特异性荧光,理化特性试验证实分离毒对温度、酸碱不敏感,对乙醚、氯仿等脂溶性溶剂具有较强的抗性,并能抵抗短时间的胰酶处理;接种豚鼠可产生PPV HI抗体。试验结果证实分离毒为猪细小病毒。     

狂犬病（HEP／BHK_（21）活疫苗的试制

狂犬病ＦｌｕｒｙＨＥＰ株经ＢＨＫ（２１）细胞传代后，从１９８７年试制了７批疫苗，批间毒价稳定，ＭＩＣＬＤ（５０）均在１０（－４．５）／０．０３ｍｌ以上，冻干苗毒价≥１０（－４．５）／０．０３ｍｌ。冻干苗以５％蔗糖、１％明胶为保护剂，在－２０℃保存一年，４－８℃保存一年，室温（１８～２５℃）保存７天，毒价均无明显下降。     

猪细小病毒N株免疫期测定

用PPV—N株制备成弱毒疫苗,在配种前1个月接种PPV HI抗体阴性的后备母猪,接种2周后检测PPV HI抗体均达到1：256以上。当怀孕到40d时用PPV强毒攻击,攻毒后40d剖杀的2头怀孕母猪其胎儿正常健活,胎儿心血未检测到PPV HI抗体,胎儿脏器未分离到病毒;自然分娩的2头母猪,其仔猪健活,未吃初乳仔猪PPV HI抗体阴性,仔猪脏器未分离到病毒;而强毒攻击的对照猪均出现不同程度的死胎,并从未吃初乳仔猪检测到PPV HI抗体和从死胎儿肺回收到病毒。按上述方法连续观察到第3胎（免疫后15个月）,证明免疫母猪怀孕到第3胎仍能抵抗PPV强毒攻击,说明PPV—N株对母猪的免疫期达1年以上。     

不同冻藏温度对速冻冬枣品质的影响

[目的]为研究冻藏期间冬枣品质的变化。[方法]利用-70℃对冬枣进行速冻后,采用-40℃、-18℃、-10℃和-4℃进行冻藏,就不同冻藏时期冬枣的品质特性变化进行研究。[结果]-70℃速冻后,合适的冻藏温度为-18℃和-40℃,-40℃冻藏能使冬枣的保鲜期10个月以上,而-18℃冻藏能保鲜冬枣6个月以上。[结论]速冻冻藏能有效维持冬枣的品质特性,如延缓含水量、可溶性糖、维生素C和有机酸含量的下降,保持较高的硬度和延缓花青素含量的升高。     

猪细小病毒灭活疫苗NJ株毒种分离及鉴定

为防控猪细小病毒病,进行了猪细小病毒灭活疫苗毒种研究。将南京某猪场初产母猪流产胎儿的脾、肺等组织病料处理后接种ST细胞培养,获得了1株猪细小病毒强毒,将分离毒株适当稀释接种ST细胞,经3轮蚀斑纯化获得1株纯净的猪细小病毒NJ株(PPV-NJ株),作为疫苗毒株。将NJ株接种ST细胞培养连续传15代,每代次病毒效价均不低于1 ml 107.25TCID50、血凝素效价不低于29。选择第5代病毒液,灭活后与矿物油佐剂混合乳化制成灭活疫苗,以不同剂量分别免疫豚鼠和后备母猪,用血凝抑制试验(HI)和ELISA检测抗体效价。分别用剂量0.125 ml、0.250 ml和0.500 ml疫苗免疫豚鼠28 d后,各免疫组HI抗体效价均高于28,0.5 ml组HI抗体效价高达211,ELISA抗体均显示阳性(OD630≥0.32),分别用剂量0.5 ml、1.0 ml和2.0 ml疫苗免疫后备母猪后,HI检测结果显示,3个剂量组免疫后1周HI抗体效价高于26,3周后达峰值,至免疫后4个月略有下降,2.00 ml剂量组HI效价最高(211.75)。ELISA检测结果显示,各剂量组在免疫后1周均转阳(OD630≥0.32),免疫后4～18周均维持较高水平。HI抗体效价和ELISA抗体水平与免疫剂量均呈正相关性。结果显示,利用NJ株病毒制备的灭活疫苗具有抗体产生快、效价高等特点,显示出良好的疫苗开发前景。     

抗犬瘟热病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立

[目的]筛选出稳定分泌抗犬瘟热病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株。[方法]用纯化的犬瘟热病毒(CDV)抗原免疫BALB/c小鼠,取脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,经间接ELISA和有限稀释法克隆杂交瘤细胞。研究了杂交瘤细胞的稳定性和染色体数,测定了单克隆抗体的效价并鉴定其特异性和亚型。[结果]经反复筛选和亚克隆后,共获得3株能稳定分泌抗CDV单克隆抗体的杂交瘤细胞株。3株单抗对CDV均有较高的特异性,与犬传染性肝炎病毒、犬细小病毒均不反应。3株杂交瘤细胞的腹水效价为1∶(8 000~128 000),细胞培养上清效价为1∶(256~512),染色体数为80~100。3株单克隆抗体重链均属于IgG1,轻链均属于κ链。[结论]该研究为研制CDV快速检测试剂盒奠定了基础。     

猪细小病毒X株在不同细胞上增殖效果比较

为选择猪细小病毒X株增殖的细胞系,对猪细小病毒X株在ST、PK-15、CEF、Vero细胞系上增殖情况进行比较,观察病变时间和病变情况,并分别测定其TCID50和血凝价。结果表明,猪细小病毒X株在这4种细胞上都能产生细胞病变,在ST、PK-15、CEF、Vero细胞上最先开始出现病变的时间分别为24、36、72和48 h,测其在以上4种细胞上的TCID50分别为10-6.4/0.1 mL、10-5.8/0.1 mL、10-2.1/0.1 mL和10-3.2/0.1 mL,HA分别为1 210、1 28、1 23、1 25,因此,建议选用ST细胞作为猪细小病毒X株的增殖细胞系。     

PRV-gE-～PPV混合制剂的细胞感染及动物免疫实验

PPVS-1A毒株和PRV-gE-毒株按一定的比例混合,在ST和BHK-21细胞上,分别测定PPV TCID50和PRV TCID50;接种3-4月龄的PPV、PRV抗体阴性猪,定期采血,分别测定PPV、PRV抗体,结果表明:二者在细胞上无明显干扰现象,具有较好的相容性;免疫猪体,能产生良好的抗体反应,无明显的免疫干扰现象。     

猪繁殖与呼吸综合征疫苗室温保存工艺的研究

为了提高猪繁殖与呼吸综合征（PRRS）弱毒活疫苗的耐热性能,用蔗糖、胰蛋白胨、EDTA、乳糖等成分配伍成不同组方,对PRRS病毒进行梯度真空泡沫干燥。37℃ 10 d耐老化试验结果表明,组方T28C-1、T28C-4、T28C-5和T28C-7的病毒损失均＜0.5 Lg;疫苗长期保存期试验结果表明,T28C-4、T28C-5在37℃可保存4个月,25℃及自然条件下可保存5个月以上;将37℃、25℃及4℃下保存3个月的T28C-4干燥疫苗免疫20日龄仔猪,免后2周ELISA抗体水平合格且与商品苗趋势相当。试验结果表明PRRSV泡沫干燥疫苗有很好的耐热效果。     

流感病毒快速诊断试剂中HA抗原热稳定性的研究

[目的]筛选流感病毒HA抗原保护剂。[方法]将H3N2和H1N1亚型流感病毒分别加入A～F组中,在37℃下进行加速试验,并通过血凝试验测定HA滴度。[结果]在28 d A组(添加PBS缓冲液)中H3N2和H1N1亚型流感病毒的HA抗原血凝滴度分别为20和32。F组(添加BSA、岩藻糖、Proclin 300、Triton 100)HA抗原的热稳定性最好,在28 d H3N2和H1N1亚型流感病毒HA抗原血凝滴度分别为48和96。[结论]F组成分对流感病毒HA抗原的保护作用最好,可作为保护剂候选配方。