3株鸽源新城疫病毒陕西分离株F基因的克隆与序列分析

对3株鸽源性新城疫病毒F基因进行扩增和序列分析,探讨分离毒株相互之间以及与疫苗毒之间的遗传进化关系.采集病料,通过非免疫鸡胚接毒传代分离病毒,HA及HI试验鉴定其为ND病毒;设计特异性引物,RT-PCR扩增分离ND病毒F 基因的重要功能区片段(1 395 bp),并对其进行克隆、测序及序列分析.结果表明:3株鸽源NDV陕西分离株相互之间F 基因核苷酸序列的同源性在98.0%～99.3%,氨基酸序列同源性为98.5%～99.1%;其F 基因裂解位点的氨基酸组成与NDV 强毒株的特征性结构(112 R-R-Q-K-R-F117 )一致.系统发育进化树表明,此3 株强毒株与某贵州分离株(登录号:EF589137) 高度同源,处于进化树的同一分支,属于基因Ⅵ型.分离到的3株鸽源NDV之间同源性较高,鸡胚病变和序列分析表明其为强毒,与传统的La Sota,B1等疫苗株同源性很低.     

鸡新城疫病毒分离株F基因的分子特性分析

【目的】对新城疫病毒(NDV)分离毒株进行分子特征分析,了解免疫鸡群发生新城疫的原因。【方法】用非免疫鸡胚从病鸡肺脏中分离新城疫病毒;参考GenBank上发表的NDV的F基因序列设计引物,应用RT-PCR方法对新城疫病毒分离株进行扩增,并构建克隆载体,对阳性质粒测序后进行F基因核苷酸及推导氨基酸序列分析。【结果】从发病鸡群中分离到6株NDV,分离毒株间的F基因核苷酸和F蛋白氨基酸同源性分别在99.6%~99.9%和99.1%~99.8%;分离毒株与参考毒株的F基因核苷酸和F蛋白氨基酸序列同源性分别在83.2%~87.3%和90.2%~93.8%;分离毒株F蛋白裂解位点的氨基酸顺序为112R-R-Q-K-R-F117,符合强毒株的分子特征;6个分离株均属NDV基因Ⅶ型。【结论】NDV分离株的F基因已经发生明显变异,与La Sota、Clone-30、V4等常用疫苗株在遗传进化上的亲缘关系较远,这可能是免疫鸡群发生新城疫的重要原因之一。     

广西山雉新城疫病毒分离株生物学特性测定

对1株从广西某山雉养殖场发病山雉中分离得到的新城疫病毒进行生物学特性测定.结果显示,分离株的鸡胚平均死亡时间(MDT)为50.4h,1日龄雏鸡脑内接种致病指数(ICPI)为1.58,F蛋白核苷酸序列与新城疫标准强毒株F48E9株的核苷酸同源性为84.5%,与Lasota的核苷酸同源性为81.8%,推导氨基酸在裂解位点的序列是112G-R-R-Q-K-R-F117.通过MDT、ICPI和推导氨基酸裂解位点分析,确定分离株是一株毒力较强的新城疫病毒强毒株.     

腺胃型传染性支气管炎病毒的分离鉴定

从河北病鸡肿大腺胃中分离到1株病毒(命名为CK/CH/HBHS/07F株),经鸡胚传代、血凝特性测定、新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)干扰试验、传染性支气管炎病毒(Infectious bronchitis virus,IBV)膜蛋白(membrane protein,M)基因序列分析、人工感染试验等方法对该病毒进行了鉴定。该分离毒株感染鸡胚的尿囊液没有直接血凝活性,经胰酶处理后可凝集鸡红细胞,其血凝活性可被IBV阳性血清所抑制;经鸡胚传至第3代时,可致死鸡胚或出现侏儒胚;序列分析结果表明,该病毒M基因与18株不同致病型IBV毒株间的核苷酸和氨基酸序列同源性分别为82.8%~94.1%、82.4%~97.4%,与腺胃型毒株CK/CH/LJL/04I同源性最高,该分离株能人工复制出与自然病例相似的病理变化。初步证实CK/CH/HBHS/07F株为腺胃型IBV。     

新城疫病毒的分离与鉴定

[目的]对活禽市场进行新城疫病毒的流行病学调查.[方法]从活禽市场采集40份鸡泄殖腔棉拭子,由SPF鸡胚扩增病毒,收集病毒尿囊液;采用RT-PCR技术扩增新城疫病毒的DNA,并测序.[结果]共分离出4株新城疫病毒.通过对分离株F蛋白的氨基酸序列分析发现,分离株裂解位点附近的氨基酸残基组成均为112ERQERL117,符合新城疫病毒弱毒株裂解序列特征,而且分离到的NDV之间具有较高的同源性,介于86.3％ ～ 93.9％,并与疫苗株LaSota的F基因核苷酸序列属于同一分支.[结论]小型活禽市场中鸡携带了弱毒新城疫病毒,因此应加强活禽市场的管理.     

鹅副粘病毒LS-1株的分离鉴定及F基因分析

从山东省梁山县疑似鹅副粘病毒感染的病死鹅中分离到1株LS-1病毒株,经血凝和血凝抑制试验,证实该毒株为禽1型副粘病毒.毒力测定结果表明,该病毒对鸡胚平均致死时间(MDT)为39.5 h;1日龄无特定病原体(SPF)鸡脑内接种分离病毒的致病指数(ICPI)为1.76;6周龄SPF鸡静脉接种致病指数(IVPI)为2.42.序列测定结果表明LS-1株F基因核苷酸长度为1 653 bp,编码为551个氨基酸,有6个糖基化位点,其裂解位点的氨基酸序列为112-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Phe-117,与已公布的强毒株裂解位点的氨基酸序列相符.同源性分析表明,该毒株F基因与目前已公布的鹅副粘病毒F基因核苷酸同源性在87.0%~98.4%之间,推导的氨基酸序列同源性在87.0%~98.5%之间.     

新城疫病毒河北分离株F基因的克隆与序列分析

通过RT-PCR技术扩增和克隆2003—2007年由河北省分离到的、具有一定代表性的鸡新城疫病毒分离株F基因,与GeneBank中已发表的NDV不同基因型代表株F基因相应核苷酸片段及其氨基酸序列进行比较,构建系统发育进化树并确定分离株的毒力强弱及所属基因型。结果显示,分离株在该区段没有碱基缺失和插入,但有多处点突变分散存在。分离株F基因核苷酸序列与国内外已发表毒株相应序列核苷酸同源性为80.5%~98.5%,推导的氨基酸序列同源性为77.5%~97.7%。表明目前河北新城疫的流行以基因Ⅶ型为主,同时兼有传统的基因Ⅵ型和基因Ⅱ型。     

鸭源新城疫病毒的分离与鉴定

[目的]分离并鉴定鸭源新城疫病毒。[方法]从安徽地区鸭病料中分离新城疫病毒,测定其鸡胚半数感染量(EID_(50))、鸡胚平均致死时间(MDT)和1日龄雏鸡脑内接种致病指数(ICPI)。[结果]2株新城疫病毒均为强毒。通过RT-PCR技术对这2株鸭新城疫病毒的F基因进行序列测定与分析,结果发现F基因裂解位点为~(112)RRQKRF~(117),符合NDV强毒株裂解位点氨基酸序列。F基因遗传进化树分析发现,AH1株属于基因Ⅶ型,而AH2株属于基因Ⅵ型,来源于鸽源病毒。[结论]水禽新城疫病毒(NDV)的感染来源复杂,应避免将不同种类的家禽混合饲养。     

1株赛鸽新城疫强毒株的致病特性及分子特征分析

为了解赛鸽群中新城疫流行毒株的分子遗传特征及变异情况,从河北省疑似赛鸽新城疫病例中采集病料,常规处理后接种SPF鸡胚,经血凝试验(HA)和血凝抑制试验(HI)鉴定病毒,并对分离毒株进行致病性试验、毒力测定,采用RT-PCR方法扩增F基因,并与其他不同种属新城疫毒株进行遗传进化发育分析和氨基酸序列同源性分析。结果显示,从病料中分离到1株新城疫病毒(命名为HB株),致病性试验产生与发病鸽相似的临床症状和剖检变化;其鸡胚平均死亡时间(MDT)、1日龄雏鸡脑内致病指数(ICPI)和6周龄雏鸡静脉致病指数(IVPI)分别为52.8 h、1.78和2.59,表明HB株新城疫病毒为强毒株;HB株F基因碱基序列包含1个大小为1 662 bp的完整开放阅读框,基因分型结果显示,HB株属于基因型Ⅵ型。根据遗传进化发育关系和同源性分析结果发现,HB株与pi/CH/LGD/110208、dove/Italy/2736/00、Q-GB 506/97等毒株核苷酸序列相似性和氨基酸同源性较高,尤其与pigeon/Qinghai/1344/2017毒株亲缘关系最近,分别达98.45%和99.5%;与目前使用的传统新城疫疫苗毒株LaSota、B1、V4、Mukteswar株等遗传关系较远;F蛋白裂解位点氨基酸序列为~(112)R-R-Q-K-R-F~(117),符合强毒株特征。以上结果表明,HB株为强毒株且与目前广泛使用的新城疫疫苗毒株遗传关系较远。     

鸡传染性支气管炎病毒ck/CH/HN/1205株的分离鉴定及S1基因的分子特征

2012年3月从河南省某疑似患鸡传染性支气管炎鸡场中分离到1株鸡传染性支气管炎病毒,通过鸡胚矮小化试验、鸡红细胞凝集试验、干扰新城疫病毒增殖试验、动物回归试验和RT-PCR试验对该毒株进行了鉴定,并对分离株的S1基因进行序列分析.结果显示:该毒株能使鸡胚形成典型的“侏儒胚”;病毒尿囊液经胰酶处理后可凝集鸡红细胞,效价达28;病毒能够显著干扰鸡新城疫病毒LaSota株在鸡胚中的增殖;病毒可致使15日龄SPF雏鸡出现典型的鸡传染性支气管炎病变.其S1基因全长为1 620 bp,与GenBank中已经发表的部分国内外毒株S1基因的核苷酸同源性在75.6％ ～ 99.1％之间;系统进化分析显示,分离株属于QX-like基因型,与疫苗株H120、W93的核苷酸序列同源性仅为78.5％和78.3％,亲缘关系较远.     

一株新城疫病毒F基因的克隆及序列分析

以PCR扩增新域疫病毒JZ05株的F基因,并进行克隆和测序.采用DNAssist序列分析软件将JZ05毒株,基因与另外18个NDV毒株F基因序列及其氨基酸序列进行比对分析.测序结果表明.NDV JZ05株F基因产物F0蛋白酶裂解位点(111~117位)的氨基酸序列为GRRQKRF.与18个NDV毒株F蛋白的氨基酸序7,1对比,半胱氨酸残基数目和位置完全一致;仅NDV JZ05株发生单个氨基酸残基变更的有5处;而其F蛋白细胞融合活性位点中的一些保守氨基酸残基都没有发生变更.10个毒株(Ch98、Ch2000、YN、JZ05、JS01、GD05、SCL03、SSX03、Lye01、TW)之间全长氨基酸序列的同源性均在96%以上,这10个毒株与3个疫苗毒株(LaSota、B1、Clone30)的同源性在88.07%～89.51%.     

贵州省新城疫分子流行病学研究

应用RT-PCR技术对贵州省不同时期不同禽源NDV分离株(肉鸡源P1株与BY株、蛋鸡源H2株与FW株、七彩山鸡源N98株、越南斗鸡源DQ株、鸵鸟源TN株及鸽源GZ株)F蛋白基因进行扩增、克隆和测序分析,结果表明:8株NDV贵州分离株F基因长度均为1 662 bp,可编码553个氨基酸;NDV贵州分离株间核苷酸同源性为84.0%~99.7%,氨基酸同源性为87.5%~99.3%;与国内外NDV参考毒株(LaSota株、B1株、F48E9株、CH2 000株和TW2 000株)的核苷酸同源性为84.2%~98.9%,氨基酸同源性为87.2%~98.6%;GZ株和TN株为基因II型,DQ株、N98株、P1株和H2株为基因VII型(均为VIId亚型),BY株和FW株为基因IX型。表明,不同时期NDV贵州分离株的基因型不同,近年流行的ND疫情主要是由基因VII型NDV引起,与国内其他省市ND流行趋势基本一致。     

豆天蛾核型多角体病毒F蛋白基因的克隆和序列分析

从豆天蛾幼虫虫体中分离纯化出一种新型的豆天蛾核型多角体病毒(CbNPV),提取基因组DNA,进行基因组测序。结果发现一个与杆状病毒F蛋白基因同源性很高的读码框序列,该长度为2 109 bp,编码702个氨基酸。氨基酸序列同源性分析表明:CbNPV F蛋白与II类NPV和I类NPV F蛋白的同源性分别为32.9%~61.8%和8.0%~16.1%,并且将它与多种I类NPV杆状病毒同功能蛋白GP64进行分析,同源性在9.1%~11.4%,表明CbNPV F蛋白与I类NPV的F及GP64蛋白的同源性很低,因此认为CbNPV属于II类NPV。     

一株鸡新城疫病毒的分离与鉴定

从广东某发病鸡场分离鉴定出1株鸡新城疫病毒,采用RT-PCR法扩增出包括裂解位点在内的部分F基因,对其进行序列测定后与GenBank中的毒株进行比较。结果表明：所克隆片断长度为463bp;F基因的裂解位点序列为112R-R-Q-K-R-F117,并且第101位为K（赖氨酸）,121位为V（缬氨酸）,具有基因Ⅶ型副粘病毒强毒株的特征序列;分离株与Lasota株同源性为81.2%,与我国标准强毒F48E9的同源性只有82.4%,表明该基因已经发生了变化。     

云南省烟草花叶病毒和黄瓜花叶病毒外壳蛋白基因克隆及序列分析

以从云南省主要烟区烟草上分离到的烟草花叶病毒（Tobacco mosaic virus, TMV）和黄瓜花叶病毒（Cucumber mosaic virus, CMV）的RNA为模板,采用RT-PCR技术,对TMV云南分离物（TMV-YN）的外壳蛋白（Coat protein,CP）基因及3’端非编码区和CMV云南分离物（CMV-YNa）的CP基因进行了cDNA克隆和序列测定。结果表明,TMV-YN的cDNA全长684个碱基（EMBL登录号为AJ239099）,通过GenBank进行同源性比较发现：其5'端的480个碱基为CP基因,编码159个氨基酸;3'端的204个氨基酸为非编码区;此CP基因与TMV-U1株系和TMV韩国普通株系核苷酸同源性均为100%。CMV-YNa的CP基因全长657个碱基（EMBL登录号为AJ239098）,编码218个氨基酸;此CP基因与CMV亚组 I 的CMV-RB株系、CMV-117F株系和CMV-Y株系的核苷酸同源性分别为96%、93%和92%。     

鸡新城疫病毒融合蛋白基因的克隆及进化分析

根据GeneBank中报道的NDV融合蛋白基因(F)序列,设计了一对特异性引物,用该引物对NDVLN-SN株进行了RT-PCR扩增;将扩增得到的PCR片段纯化后与pGEM-T连接得到重组质粒pGEM-F,用于核苷酸序列测定。结果该基因ORF长1662bp,编码553个氨基酸;将LN-SN毒株与GeneBank中已报道的NDV毒株进行比较,F基因核苷酸序列的同源性在83.4%~99.9%之间,推导的F蛋白氨基酸序列的同源性在88.4%~99.8%之间。     

一株犬副流感病毒CPIV-BJ01株全基因组测序与其遗传变异分析

为分析本实验室分离的犬副流感病毒CPIV-BJ01株全基因组序列与其遗传变异情况,对CPIV-BJ01株全长进行分段扩增并测序,拼接获得全基因组序列,与GenBank发布的27株副流感病毒5型分别进行全基因组和包膜糖蛋白(F、SH和HN)核苷酸及氨基酸序列的相似性比对,分析其遗传进化关系。结果显示,CPIV-BJ01毒株与犬源PIV5 1 168-1亲缘关系最近,核苷酸相似性为99.9%,氨基酸相似性为99.8%。CPIV-BJ01的F和HN基因序列变化较为保守,核苷酸和氨基酸变化均在4%以内,其中F蛋白的氨基酸变化形成一处新的O-糖基化位点;CPIV-BJ01株的SH基因序列与其他演化分支毒株差异显著,核苷酸相似性为84.4%~97.0%,氨基酸相似性为31.8%~95.6%。综上,CPIV-BJ01株基因组序列与前人报道的毒株相比,在F、HN基因和部分非编码区存在核苷酸或氨基酸序列的改变,同时F蛋白存在糖基化修饰的改变,均为该毒株所特有,该研究结果丰富了中国CPIV流行株的基因组信息。     

鸡新城疫病毒新乡株ND-XX10的分离与鉴定

2010年初,已免疫过新城疫疫苗的新乡市某鸡场蛋鸡出现以消化道、呼吸道出血为主要症状的疑似新城疫病例.将病料经10日龄SPF鸡胚增殖分离病毒,命名为ND-XX10.提取其病毒基因组RNA,并以此为模板,RT-PCR扩增获得F基因主要功能区(1～631 bp)片段并进行测序.结果显示,ND-XX10毒株F蛋白的裂解位点为...     

猪源新城疫病毒SP13株的F基因克隆及序列分析

采用RT-PCR方法对猪源新城疫病毒(NDV)SP13株的F基因进行了扩增与克隆,并测定出F基因的核苷酸全序列,推导出氨基酸序列.F基因全长为1662 bp,单一的开放阅读框,编码553个氨基酸的长肽,裂解位点的氨基酸序列为112G-R-Q-G-R-L117,与弱毒株在这一区域的序列(112G-R/K-Q-G/S-R-L117)相符;F蛋白有6个潜在的糖基化位点和13个Cys残基位点,其疏水构型有3个强疏水区.通过同源率、系统发育、致病性、疏水性和抗原性等比较分析的结果表明,SP13与LaSota、Clone 30株不但同源性达到99.9%,而且在致病性、疏水性和抗原性等方面也极为相似.