健康鸡猪体内大肠杆菌对四环素的耐药性及耐药基因分布

【目的】四环素作为人类和动物临床上广泛使用的广谱抗生素,其耐药性问题一直为全球所关注。健康动物体内的共生性大肠杆菌作为耐药指示菌和耐药基因的贮存库,了解其对四环素的耐药性及耐药机制对于疾病的防控具有重要意义。【方法】从健康鸡、猪体内分离大肠杆菌,用微量肉汤法检测其对四环素的耐药性,并用PCR方法对耐药菌株中8种四环素耐药基因的携带情况进行调查,运用统计学方法分析鸡、猪体内大肠杆菌分离株的耐药性和耐药基因分布情况的差异。【结果】总共分离鉴定出大肠杆菌269株,其中86.2%的菌株对四环素产生了耐药性,健康猪体内大肠杆菌分离株的耐药性明显高于健康鸡体内分离株(P0.05)。tet(A)、tet(B)和tet(M)3种四环素耐药基因广泛存在于健康鸡、猪体内的共生大肠杆菌中,所携带比例分别为87.9%、28.4%和15.5%;所有对四环素耐药的大肠杆菌均携带tet(A)或tet(B)基因,其中25.0%和2.6%的耐药菌株分别携带有2种和3种耐药基因,tet(M)基因与tet(A)或tet(A)+tet(B)基因共存于对四环素耐药的大肠杆菌中;健康鸡、猪体内耐药性大肠杆菌在tet(A)+tet(M)基因携带率方面的差异具有统计学意义(P0.01)。【结论】健康鸡、猪体内的大肠杆菌分离株普遍对四环素耐药,四环素耐药基因广泛分布于大肠杆菌分离株中,大肠杆菌对四环素的耐药机制以主动外排作用为主,核糖体保护基因在大肠杆菌对四环素耐药机制方面的作用尚待进一步的研究。     

犬源大肠杆菌分离株对四环素类药物耐药性的检测

用微量肉汤倍比稀释法测定四环素类等抗菌药物对53株犬源大肠杆菌分离株的最小抑菌浓度(MIC),用PCR和DNA测序方法检测犬源大肠杆菌中四环素耐药基因(tet基因),了解tet基因的流行情况、分析试验菌对四环素类药物的耐药机制。结果表明:25%的分离菌呈多重耐药现象,最多对8种药物耐药。分离菌对四环素类中的土霉素、四环素、多西环素耐药率高,耐药率介于69.8%~86.1%。基因检测结果显示,犬源大肠杆菌中共检测到5种tet基因,分别为tet A、tet B、tet C、tet G、tet L基因,都属于外排泵基因,未检测到核糖体保护基因。其中tet G基因的检出率最高,共检出39株(检出率达70%),有40个菌株同时检出2种或2种以上tet基因,有3株同时检测到4种tet基因,仅有4株未检测到任何tet基因。研究表明:犬源大肠杆菌对常用抗菌药物的耐药情况十分严重,tet基因的携带率高,主动外排是犬源大肠杆菌对四环素类耐药的主要机制。     

犬源大肠杆菌分离株对四环素类药物耐药性的检测

用微量肉汤倍比稀释法测定四环素类等抗菌药物对53株犬源大肠杆菌分离株的最小抑菌浓度(MIC),用PCR和DNA测序方法检测犬源大肠杆菌中四环素耐药基因(tet基因),了解tet基因的流行情况、分析试验菌对四环素类药物的耐药机制。结果表明:25%的分离菌呈多重耐药现象,最多对8种药物耐药。分离菌对四环素类中的土霉素、四环素、多西环素耐药率高,耐药率介于69.8%⁸6.1%。基因检测结果显示,犬源大肠杆菌中共检测到5种tet基因,分别为tet A、tet B、tet C、tet G、tet L基因,都属于外排泵基因,未检测到核糖体保护基因。其中tet G基因的检出率最高,共检出39株(检出率达70%),有40个菌株同时检出2种或2种以上tet基因,有3株同时检测到4种tet基因,仅有4株未检测到任何tet基因。研究表明:犬源大肠杆菌对常用抗菌药物的耐药情况十分严重,tet基因的携带率高,主动外排是犬源大肠杆菌对四环素类耐药的主要机制。     

四环素耐药基因在养猪场猪粪和土壤中的分布研究

该文采用PCR方法研究了养猪场中猪粪和土壤中耐四环素乳糖发酵型肠杆菌(TR-LFE)中的tet-R分布和多样性。结果表明,在分离的258株耐四环素乳糖发酵型肠杆菌中,共检测到191株含有tet-R基因,占74.03%。各样品的耐四环素乳糖发酵型肠杆菌中tet-R基因的检出率范围为3.12%~96.87%。根据检出频率的大小,各类tet-R基因的排列顺序为:tet(A),tet(B),tet(M),tet(G),tet(C),tet(D),tet(S),所有样品都没有检测到tet(O)和tet(X)。     

猪源屎肠球菌tetM基因的检测

用微量肉汤倍比稀释法测定了猪源屎肠球菌对四环素等抗生素的敏感性,用PCR和DNA测序方法检测了屎肠球菌中四环素类耐药基因(tet基因),并分析了试验菌对四环素类的耐药机制。结果表明:14株猪源屎肠球菌对四环素、多西环素、环丙沙星、红霉素全部耐药,4株对头孢噻呋耐药;在14株屎肠球菌中,分别有13株和9株含tet L和tet M基因,其中有9株同时携带tet L和tet M基因;猪源屎肠球菌主要存在主动外排和核糖体保护两种耐药机制,其对四环素类的耐药性主要与携带tet M和tet L有关。     

猪源屎肠球菌tetM基因的检测

用微量肉汤倍比稀释法测定了猪源屎肠球菌对四环素等抗生素的敏感性,用PCR和DNA测序方法检测了屎肠球菌中四环素类耐药基因(tet基因),并分析了试验菌对四环素类的耐药机制。结果表明:14株猪源屎肠球菌对四环素、多西环素、环丙沙星、红霉素全部耐药,4株对头孢噻呋耐药;在14株屎肠球菌中,分别有13株和9株含tet L和tet M基因,其中有9株同时携带tet L和tet M基因;猪源屎肠球菌主要存在主动外排和核糖体保护两种耐药机制,其对四环素类的耐药性主要与携带tet M和tet L有关。     

禽源沙门氏菌对四环素耐药分析

为检测分析辽宁省东部地区禽源性沙门氏菌对四环素的耐药情况,采样分离来自健康鸡群34株沙门氏菌,分别进行四环素药敏试验,及四环素基因tet(A)、tet(B)、tet(C)、tet(D)检测。结果表明,34株沙门氏菌中有30株对四环素产生耐药,30株沙门氏菌对4种耐药基因的检出率大小顺序为tet(A)tet(C)tet(B)tet(D),该试验为家禽合理使用四环素提供依据。     

乌骨鸡肉及组织中土霉素、四环素残留量研究

利用高效液相色谱法(HPLC)测定乌骨鸡胸肉、腿肉、心、肝、肾、肌胃组织中的土霉素、四环素残留量.结果表明,土霉素、四环素标准品浓度在8.2～262.5 μg·mL-1范围内线性关系良好,土霉素线性方程为^y=19 392.82x-22.90(r=0.999 48),四环素线性方程为^y=14 089.84x-33.34(r=0.998 88).乌骨鸡胸肉的土霉素加样回收率平均为89.84%,RSD=1.03%;四环素加样回收率平均为90.65%,RSD=1.05%.     

四环素耐药基因在猪粪便、堆肥和土壤中的归趋

抗生素抗性基因(antibiotic resistance genes,简写为ARGs)是一种新兴的环境污染物[1],在我国禽畜养殖业中由于抗生素的大量使用,导致禽畜粪便中ARGs广泛存在,但其在环境中归趋的研究还较少。四环素是我国禽畜养殖业中广泛使用的抗生素,本研究采用分子生物学技术,研究了猪粪便中四环素耐药基因(an-tibiotic resistance genes,TRGs)的分布以及迁移变化。通过普通PCR定性检测,发现在养猪场各样品中均检测出TRGs。荧光定量PCR检测发现猪粪堆肥中tet(A)和tet(C)基因的含量相比于土壤中的tet(A)和tet(C)的含量均高0~1个数量级,而比新鲜猪粪中的分别低0~3和1~4个数量级。据此推测TRGs在新鲜猪粪、堆肥和土壤中总体呈逐级降低的趋势,堆肥处理有利于TRGs含量的消减。     

石家庄汪洋沟地区抗生素、抗性细菌和抗性基因污染特征

以石家庄汪洋沟地区为研究对象,采用高效液相色谱-质谱法(HPLC-MS)、平板计数、实时荧光定量(qPCR)法分别对地表水、地下水及沉积物样品中的抗生素、抗性细菌和抗性基因进行定量分析。结果表明,汪洋沟地区四环素类抗生素总体含量高于磺胺类抗生素,水体中ρ(∑四环素)为5.81×101~3.87×105ng·L-1,ρ(∑磺胺)为1.02×101~5.37×103ng·L-1;沉积物中w(∑四环素)为4.28×101~1.63×105ng·g-1,w(∑磺胺)为1.18×101~1.68×104ng·g-1;水体中四环素的抗性细菌数量为4.00×101~2.13×104CFU·mL-1,磺胺抗性细菌数量为6.67×101~7.34×105CFU·mL-1;水体中抗性细菌含量比沉积物中低3~4个数量级。样品中检出的5种四环素类抗性基因(tetA、tetB、tetE、tetW和tetZ)、2种磺胺类抗性基因(sul1,sul2)及2种整合子基因(int1,int2)的相对表达量较高,其中tetA及sul1为汪洋沟地区的优势抗性基因,相对表达量均高于1.58×10-2。主成分分析结果表明ARGs的含量分布受不同污染源和复杂的水质特征的影响。从tet(B)基因的系统发育分析结果可以看出,水质的变化会导致抗性菌种存在差异。与国内外河流相比,汪洋沟抗生素含量处于较高污染水平,抗性基因污染也较为严重。     

绿色和有机蔬菜基地土壤中喹诺酮类抗生素的污染特征

利用高效液相色谱-串联质谱(HPLC-MS/MS)分析方法,探讨了广州市某绿色蔬菜基地和有机蔬菜基地土壤中4种喹诺酮类抗生素的含量与分布特征。结果表明,土壤中各化合物的检出率除洛美沙星为85%以外,其余均为100%,平均含量为0.80～24.95μg.kg-1,以诺氟沙星(24.95μg.kg-1)为主,其次为环丙沙星(15.40μg.kg-1)和恩诺沙星(7.68μg.kg-1)。4种喹诺酮类化合物总含量在7.15～122.25μg.kg-1之间,主要分布在50～100μg.kg-1之间,平均为48.85μg.kg-1。有机蔬菜基地土壤中4种喹诺酮类化合物的含量均高于绿色蔬菜基地土壤。同一基地不同蔬菜土壤中喹诺酮类抗生素的含量有一定差异,但化合物组成特征差异不大。研究区土壤中喹诺酮类抗生素的含量低于兽药国际协调委员会(VICH)筹划指导委员会的抗生素生态毒性效应触发值(100μg.kg-1),表明生态风险较小。     

不同施肥模式对洱海流域稻田土壤中耐药基因污染的影响

为探究不同施肥模式对洱海流域稻田土壤抗生素耐药基因（ARGs）和可移动遗传元件（MGEs）的影响,通过长期田间定位试验,采用高通量荧光定量PCR技术及实时荧光定量PCR技术相结合的方法,对不同施肥模式下稻田土壤中的144种ARGs和10种MGEs进行检测,全面解析了稻田ARGs的污染状况及空间分布规律。结果表明：不同施肥处理土壤中ARGs分布特征不同,其赋存绝对丰度水平整体呈现施用粪肥 > 施用缓控释肥 > 施用化肥 > 不施肥;施加粪肥土壤中的ARGs的赋存多样性和MGEs的种类显著高于其他处理土壤,不施肥模式则显著低于其他处理模式（P<0.05）。不同ARGs的相对丰度在稻田土壤柱中出现垂直迁移富集趋势,但其在不同土层中的富集程度存在差异。不同施肥模式稻田土壤各土层中的优势ARGs为多重耐药类（占比均值为60.3%）、氨基糖苷类（占比均值为10.5%）和四环素类（占比均值为7.5%）,其水平多与MGEs丰度显著相关（P<0.05）,表明MGEs促进了稻田土壤中ARGs的传播,加剧了土壤中ARGs的积累富集。研究表明,不同施肥模式对稻田土壤中ARGs和MGEs的分布规律有显著影响,不同深度土层中ARGs的富集程度各异。     

洱海流域畜禽饲料·粪便·土壤中四环素类抗生素残留分析

[目的]研究洱海流域畜禽粪便、饲料和土壤中的四环素类抗生素残留状况。[方法]以云南省洱海流域养殖业链为研究对象,采样分析了11个饲料样品、10个粪便样品、21个土壤样品中土霉素、四环素、金霉素残留状况。[结果]饲料中四环素、土霉素、金霉素的检出率分别为100%、100%、50%,其中猪饲料中土霉素、金霉素含量最高,其次是鸡饲料,奶牛饲料添加的抗生素相对较低;粪样中土霉素检出率为100%,四环素检出率为80%,金霉素检出率为90%,其中鸡粪中残留的抗生素最高;土壤抗生素残留较低,金霉素的检出率为66.6%,四环素、土霉素均未检出。[结论]洱海流域养殖业残留抗生素对环境和人体健康的风险较低。     

重金属协同选择环境细菌抗生素抗性及其机制研究进展

抗生素的长期滥用,引起环境细菌耐药性不断增强,加速了抗生素抗性基因(Antibiotic resistance genes,ARGs)在环境中的传播扩散。在重金属污染的环境中,细菌不仅具备重金属抗性,并且具备多种抗生素抗性,抗生素抗性基因的污染水平也随之升高。在介绍重金属与抗生素抗性最新研究进展的基础上,阐述了环境细菌的抗生素抗性、重金属抗性及其相关抗性机制,并着重论述重金属和抗生素协同选择环境细菌耐药性及其机制。     

Insights into the effects of pulsed antimicrobials on the chicken resistome and microbiota from fecal metagenomes

Antimicrobial resistance has become a global problem that poses great threats to human health. Antimicrobials are widely used in broiler chicken production and consequently affect their gut microbiota and resistome. To better understand how continuous antimicrobial use in farm animals alters their microbial ecology, we used a metagenomic approach to investigate the effects of pulsed antimicrobial administration on the bacterial community, antibiotic resistance genes (ARGs) and ARG bacterial hosts in the feces of broiler chickens. Chickens received three 5-day courses of individual or combined antimicrobials, including amoxicillin, chlortetracycline and florfenicol. The florfenicol administration significantly increased the abundance of mcr-1 gene accompanied by floR gene, while amoxicillin significantly increased the abundance of genes encoding the AcrAB-tolC multidrug efflux pump (marA, soxS, sdiA, rob, evgS and phoP). These three antimicrobials all led to an increase in Proteobacteria. The increase in ARG host, Escherichia, was mainly attributed to the β-lactam, chloramphenicol and tetracycline resistance genes harbored by Escherichia under the pulsed antimicrobial treatments. These results indicated that pulsed antimicrobial administration with amoxicillin, chlortetracycline, florfenicol or their combinations significantly increased the abundance of Proteobacteria and enhanced the abundance of particular ARGs. The ARG types were occupied by the multidrug resistance genes and had significant correlations with the total ARGs in the antimicrobial-treated groups. The results of this study provide comprehensive insight into pulsed antimicrobial-mediated alteration of chicken fecal microbiota and resistome.     

天津市家庭农场养殖粪污耐药基因赋存特征及风险评估

为了解家庭农场养殖粪污中抗生素耐药基因(ARGs)的赋存特征及潜在风险,本研究选取天津市蓟州区22家典型的家庭农场,采用实时荧光定量PCR方法,考察了不同种类畜禽粪污中ARGs的污染特征及其对周边农田土壤的影响。结果表明,磺胺类、四环素类、喹诺酮类和大环内酯类耐药基因在家庭农场畜禽粪污中普遍存在,且四环素类耐药基因tetO、tetQ、tetW和大环内酯类耐药基因ermB含量最为丰富,同时检出了blaOXA-1、blaTEM-1和blaampC等与人类健康密切相关的β-内酰胺类抗生素耐药基因(bla基因)。此外,还发现如下规律:相比于猪场和牛场,鸡场粪污中的ARGs污染程度更为严重;在不同生育阶段的猪群中,母猪粪污中的多数耐药基因相对丰度要显著高于仔猪和育肥猪(P<0.05);畜禽粪肥施用可显著增加土壤环境中ARGs的丰度(约8~18倍)(P<0.05)。本研究表明,家庭农场畜禽养殖粪污中耐药基因污染严重且普遍,同时随着粪污还田进入土壤环境增大环境风险,最终可能会通过污染农作物危害人类健康,应引起高度重视。     

畜禽粪便中兽用抗生素削减方法的研究进展

兽用抗生素具有显著的促动物生长、预防动物疾病的作用。随着集约化畜牧业以及配合饲料工业的不断发展,抗生素作为饲料添加剂在全球范围内已被广泛应用。我国畜禽养殖业对抗生素的依赖甚是严重,每年用于畜禽养殖的兽药抗生素超过了8吨,占抗生素总产量的一半以上。这些兽用抗生素并不能完全被动物体所吸收,绝大部分以原药或者代谢产物的形式随畜禽粪便和尿液排出体外,导致畜禽粪污中多种抗生素残留,最高浓度达到了183.50 mg·kg~(-1)。残留抗生素可能经各种途径进入土壤和水体环境中,一方面影响土著微生物的活性,另一方面引起抗性菌和抗性基因的产生和传播,给生态系统安全和人类身体健康带来巨大的负面效应。因此,充分、有效消减畜禽粪污中兽药抗生素十分重要而迫切。论文作者在总结大量文献的基础上,对国内外畜禽粪便抗生素的污染特点和赋存规律进行了系统介绍,并着重阐述了国内外畜禽粪便中兽用抗生素削减方法的最新研究进展,描述了畜禽粪便好氧堆肥和厌氧发酵的分类及工艺流程。在此基础上重点对好氧堆肥和厌氧发酵两种处理方式下畜禽粪便中兽用抗生素的去除程度进行了详尽、深入分析,同时对抗生素消减效果的影响因素进行了充分讨论。主要结论:好氧堆肥对土霉素、四环素、金霉素、磺胺甲恶唑、磺胺嘧啶、磺胺甲基嘧啶、环丙沙星、恩诺沙星和泰乐菌素等主要类别抗生素的最高去除率可达65.5%—100%,去除效果受抗生素种类、初始浓度、添加方式、堆肥温度、供养方式、底物组成影响;厌氧发酵对氨苄青霉素、四环素、磺胺甲氧二嗪的去除可达100%,但几乎无法去除磺胺噻唑、磺胺二甲基嘧啶、磺胺氯哒嗪、泰乐菌素,去除效果受抗生素种类、浓度、发酵温度、污泥性质、混合速率和发酵时间影响。最后,对需要进一步开展的研究进行了展望,建议加强兽用抗生素的监管,制定相关的法规和标准,加速兽用抗生素替代物品的研发,减少源头污染;深入开展畜禽废弃物好氧堆肥或者厌氧发酵过程中抗生素降解产物及机理研究;筛选具有强降解能力的微生物作为菌剂,强化其对畜禽养殖废弃物中兽用抗生素的消减;深入研究好氧堆肥和厌氧发酵过程中抗生素和ARGs之间的相互关系,去除兽用抗生素的同时也加速ARGs的削减。     

广州市北郊蔬菜基地土壤四环素类抗生素的残留及风险评估

为了解蔬菜基地土壤中四环素类抗生素的残留及风险状况,采集了广州市北郊20个蔬菜基地30个土壤样品,利用固相萃取(SPE)-高效液相色谱-串联质谱(HPLC-MS/MS)分析方法,检测土壤中四环素类抗生素(四环素、土霉素和金霉素)的残留状况,并引入层次分析法、风险商值法和指示克里金法,分析研究区域土壤抗生素的主要来源、生态风险以及空间分布。结果表明,广州市北郊蔬菜基地土壤四环素(Tetracycline,TC)、土霉素(Oxytetracycline,OTC)和金霉素(Chlorotetracycline,CTC)的含量范围分别为ND~30.37μg·kg~(-1)、ND~903.13μg·kg~(-1)和ND~103.02μg·kg~(-1),其平均值分别为5.64、38.39μg·kg~(-1)和8.92μg·kg~(-1),3种TCs在土壤中的平均含量高低顺序为:OTCCTCTC。粪肥是土壤3种TCs的主要来源,其贡献率大于50%;其次是商业性有机肥,其权重系数为24%左右。广州市北郊蔬菜基地土壤中3种TCs的生态风险整体较低,但西部部分区域处于中、高风险等级,首要防控污染物为OTC,其次是CTC。     

畜禽粪便中抗生素抗性基因(ARGs)污染问题及环境调控

抗生素在畜禽养殖业的大量使用造成抗生素抗性基因(ARGs)污染日益严重。动物体内诱导出的抗性菌株随粪便排出后,通过基因水平转移进入土壤进而污染土壤和地下水环境。堆肥作为一种将粪便资源化的优良传统方法,能否有效去除畜禽粪便中的ARGs而防止环境污染值得探讨。通过总结畜禽粪便ARGs污染现状,粪便堆肥过程中微生物群落结构变化与影响微生物变化的因素以及堆肥可能对粪便中ARGs造成的影响,提出将堆肥作为去除畜禽粪便中ARGs的一种有效手段,利用堆肥产生的高温去除抗性菌株和抗性质粒等,并且考虑加入能直接灭杀肠道微生物的化学抑制剂(如石灰氮、胺类、吲哚等),实现降低畜禽粪便ARGs丰度的可能。据此强调开展畜禽粪便中ARGs研究的必要性,认为将堆肥和ARGs研究结合起来,可以有效地降低这种新型污染物的污染水平。     

滇池流域农田土壤有机氯农药残留特征

在滇池流域农田,重点是滇池滨湖区和入滇河流柴河流域,选择不同土地利用类型、不同种植年限大棚采集土壤样品进行气相色谱(ECD)分析。结果表明,试区土壤中有机氯农药(OCPS)检出率为95.9%,OCPS的残留量范围、平均值分别为nd～63.4μg·kg-1、6.3μg·kg-1,以p,p′-DDE为主要残留物,98.3%的样点达到国家《土壤环境质量标准》一级标准(<50μg·kg-1)。与国内同类报道相比,滇池周边土壤中OCPS的残留较低。不同土地利用类型有机氯残留量排序为:设施栽培>水稻田>露天菜地>荒草地>坡耕地;不同大棚种植年限土壤中,棚龄长于15a的OCPS残留量要明显高于棚龄短于15a的,而棚龄短于15a的,土壤中OCPS含量差异不明显。