一种快速简便的浓核病毒DNA的制备方法

利用家蚕浓核病毒感染蚕中肠组织,建立了一种快速、简便、高效的浓核病毒DNA的制备方法.将感染蚕的中肠组织研磨后,10000 g离心10 min,上清液经过细菌过滤器过滤,滤液直接用蛋白酶K消化,再用酚/氯仿抽提,即可高效获得家蚕浓核病毒DNA.     

家蚕中肠特异启动子BmAPN的克隆及活性分析

【目的】克隆和鉴定1个家蚕中肠特异启动子,为研究家蚕的免疫应答和应用研究提供新的工具。【方法】从家蚕品种大造中提取基因组总DNA,用PCR方法克隆家蚕中肠特异表达基因BmAPN（GenBank登录号：BAA33715.1）的上游调控序列。利用此序列构建以EGFP为报告基因的转基因表达载体pBac[BmAPN-EGFP-SV40,3×P3-DsRed],通过显微注射获得转基因家蚕,在个体水平上检测启动子的活性。【结果】所克隆的BmAPN启动子长度为1 598 bp,其驱动的EGFP仅在转基因家蚕中肠特异表达,与内源基因BmAPN的表达特征一致。该启动子在家蚕幼虫时期活性相对较高,且在起蚕期的活性要明显高于眠蚕期,推测该启动子中的特异元件受激素调控。【结论】经克隆获得的BmAPN启动子为有活性的启动子,且为家蚕中肠特异启动子。     

家蚕病毒防治有新药

湖北省农科院果茶蚕桑研究所(邮码:430070,电话:027-87389539研制的家蚕病毒防治药剂“脓病清”前不久通过了专家验收。该药剂对家蚕血液型脓病、中肠型脓病及浓核病的防治效果在98%以上,是一种对人畜安全、无副作用的高效广谱蚕药。家蚕病毒防治有新药!湖北@董梁     

麒麟区家蚕新品种“华康2号”试验初报

正血液型浓病是家蚕饲养中一种易发、常见的主要病害,对蚕桑生产造成了极大的危害。华康2号是中国农业科学院蚕业研究所以秋丰、白玉做为基础蚕品种,通过杂交、回交等技术手段,导入家蚕核型多角体病毒(Bm NPV),具有较高耐受性基因而育成的对核型多角体病(血液型浓病)高耐受性的一对夏秋蚕用品种。为此,曲靖市麒麟区蚕桑站于2015-2016年连续2年从浙江省桐乡市蚕业有限公司引进华康2号     

氟化物对家蚕不同组织酯酶同工酶的影响

为了探讨氟化物对家蚕代谢机制的影响,以家蚕耐氟品种 T6和氟化物敏感品种734为研究材料,从5龄起蚕开始分别添食经200,400mg/kgNaF溶液浸泡后的新鲜桑叶,采用聚丙烯酰胺凝胶电泳法,检测家蚕头、血液和中肠组织中酯酶同工酶的变化.结果表明,T6头部和中肠的酯酶同工酶活性大于734,而且酶带数多于734.NaF会扰乱734血液酯酶同工酶系统.推测血液可能是酯酶同工酶和 NaF作用的主要组织,且酯酶同工酶与蚕体的耐氟性能有一定的相关性.     

不同粒径银纳米颗粒在家蚕体内的转运·分布及代谢研究

以家蚕为模式生物,研究了2种不同粒径的银纳米颗粒[Ag NPs,直径分别为(23.2±2.8)nm和(47.6±5.2) nm,分别记为Ag NPs-23.2 nm及Ag NPs-47.6 nm]在家蚕体内的转运、分布和代谢。在家蚕5龄的第3天,将不同浓度的Ag NPs(60μg/头、120μg/头、180μg/头)通过腹足注射的方式导入家蚕体内,分别于注射后24、48、72 h解剖家蚕,获得家蚕血液、丝腺和中肠,同时收集蚕砂,结茧后收集蚕丝,然后用微波消解结合电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)测定各组织及蚕砂、蚕丝中Ag的浓度。结果表明,不同组织中Ag的浓度随时间的变化趋势差异较大。120μg/头Ag NPs注射24 h后,血液中Ag的浓度分别为(23.87±3.00)μg/mL(Ag NPs-23.2 nm)、6.54±0.33μg/mL(Ag NPs-47.6 nm),中肠对应的Ag浓度分别为(200.34±12.11)μg/g(Ag NPs-23.2 nm)、(20.12±1.60)μg/g(Ag NPs-47.6 nm)。血液中Ag的浓度随着时间的推移而降低,而中肠中Ag的浓度则持续升高;蚕砂中Ag浓度也随时间而降低。由此可见,注射进入血液中的Ag NPs会向中肠转运,再通过代谢进入蚕砂而被排出体外。小粒径的Ag NPs更容易被家蚕吸收并在体内富集,而大粒径的Ag NPs更容易被代谢进入蚕砂。通过对不同粒径Ag NPs在家蚕体内的转运、分布和代谢的研究,可为Ag NPs的毒理研究提供了一定的支持。     

抗家蚕浓核症病毒单克隆抗体实用化研究

制备了家蚕浓核症诊断试剂盒,将单克隆抗体与双向免疫技术相结合,用于家蚕浓核症的诊断.采用此试剂盒,对家蚕浓核症的最早检出时间为感染病毒后48小时.若将此单克隆抗体与免疫酶技术或萤光抗体技术结合,则能在感染病毒后12～16小时的家蚕中肠组织内检测到病毒抗原.配制的单克隆抗体应用液效价稳定,在37℃下放置一个月,室温下放置两个月仍然有效.单克隆抗体能代替常规抗血清用于家蚕浓核症的诊断.     

蚯蚓提取液对家蚕热激蛋白水平及免疫功能的影响

为探讨蚯蚓提取液对家蚕热激蛋白的表达及免疫功能的影响,家蚕5龄幼虫饲喂蚯蚓提取液(50、100和200倍原液稀释)处理的桑叶,饲喂6 d后解剖获取家蚕中肠及血淋巴组织,利用实时荧光定量PCR检测中肠组织中HSP70和HSP90基因的表达;利用ELISA试剂盒检测中肠和血淋巴中HSP70、HSP90、溶菌酶(lysozyme)和抗菌肽(attacin)的水平。结果表明:1/100和1/200稀释组家蚕中肠组织中HSP70基因表达分别是对照组的2.97和1.86倍(P<0.05),1/100稀释组家蚕中肠组织中HSP90基因表达是对照组的2.2倍(P<0.05);1/50稀释组中肠HSP70和血淋巴抗菌肽显著高于对照组(P<0.05);各处理组中肠和血淋巴中HSP90差异不显著(P>0.05)。由此可见,桑叶中添食蚯蚓提取液可促进热激蛋白的表达,提高抗菌肽的水平,进而提高蚕体的抗性和免疫功能。     

5龄家蚕中肠β-呋喃果糖苷酶基因转录表达分析

【目的】探明5龄家蚕中肠β-呋喃果糖苷酶基因表达及其酶活性变化规律,为解析家蚕回避桑叶1-脱氧野尻霉素(DNJ)毒害作用的适应机制提供参考依据。【方法】通过实时荧光定量PCR对5龄家蚕中肠β-呋喃果糖苷酶基因Bm Suc1和Bm Suc2的表达进行定量检测和分析,同时测定β-呋喃果糖苷酶活性。【结果】Bm Suc1基因在5龄家蚕中肠的不同发育阶段均有表达,其中在5龄起蚕和盛食期的相对表达量较高;而Bm Suc2基因在整个5龄期的相对表达量均非常低。从5龄起蚕到熟蚕,β-呋喃果糖苷酶活性呈先升高后降低的变化趋势,以第5 d(盛食期)的酶活性最高,达158.82U/mg。【结论】Bm Suc1基因表达水平及β-呋喃果糖苷酶活性变化规律与5龄家蚕吸收利用桑叶蔗糖营养的生理进程基本一致,提示Bm Suc1基因作为一种蔗糖水解酶基因在家蚕中肠组织消化吸收桑叶蔗糖营养物质的过程中发挥主导作用。     

家蚕与柞蚕的基因组RAPD分析

用RAPD技术对家蚕和柞蚕进行基因组DNA分析,研究和比较家蚕和柞蚕之间的遗传多态性,确定家蚕和柞蚕的遗传差异.该实验中共使用了6种随机引物:5′-GACCGCTTGT-3′,5′-CAGGCCCTTC-3′,5′-TGACGGCGGT-3′,5′-CAGCACTGAC-3′,5′-CAGCACTGAC-3′,5′-CAAGGGCAGA-3′,扩增出60条清晰的条带;单个随机引物的扩增条带数在8～11条;所扩增的基因组DNA条带的分子量在0.3～3.3 kb.计算结果得出家蚕与柞蚕的遗传距离较大,平均距离约为0.639.实验还发现,在等量组织、同条件下抽提DNA时,从丝腺中抽提出的DNA量最大,从中肠和脂肪中抽提出的DNA量相对较少.     

Susceptibility and tissue specificity of Spodoptera frugiperda to Junonia coenia densovirus

The fall armyworm, Spodoptera frugiperda, which destroys many economic crops such as rice and maize, has recently invaded China. Insect viruses as biological control agents play important roles in killing pests. One potential viral insecticide is the environmentally highly infective and virulent densovirus. We successfully rescued Junonia coenia densovirus(JcDV) using its infectious clone in different insect cell lines and larvae of three insect species. Results showed that the lysate of cultured insect cells transfected by the JcDV infectious clone killed the 2 nd instar S. frugiperda. The LD_(50) of homogenate from JcDV-infected Spodoptera litura to the 2 nd instar S. frugiperda(1.76×10~8 viral genome copies per larva during 10 d post infection) was higher than that of the 2 nd instar S. litura(7.39×10~7 Jc DV genome copies) or Helicoverpa armigera larvae(9.71×10~7 JcDV genome copies). The LT_(50) of the S. litura homogenate(2.60×10~9 viral genome copies each larva) to the 2 nd instar S. frugiperda was 6.96 d, longer than that of the S. litura(6.18 d) or the 2 nd instar H. armigera(5.94 d). JcDV could infect the fat body of H. armigera, but not S. frugiperda or S. litura. Although JcDV can infect all three lepidopteran species, their susceptibility to the virus differs. JcDV has great potential as a biological control agent against pests such as S. frugiperda.     

家蚕浓核病毒镇江株非结构蛋白2(NS2)的表达及活性研究

 【目的】对家蚕浓核病毒镇江株非结构蛋白2（NS2）基因进行克隆、表达,并测定表达产物的生物活性。【方法】利用PCR技术从家蚕浓核病毒镇江株（BmDNV-Z）基因组中扩增得到非结构蛋白2(NS2)基因片段,将其克隆到表达载体pET28a得到重组表达质粒pET28a-NS2,在大肠杆菌BL21（DE3）中进行表达,SDS-PAGE和Western blot检测,表达产物经Ni柱纯化,经过复性检测其Helicase和ATPase活性。【结果】克隆获得了BmDNV-Z NS2基因,并在大肠杆菌中得到了成功表达,表达产物经Ni柱纯化获得了目的蛋白NS2。纯化的NS2蛋白具有Helicase活性,能将双链DNA底物解旋成为单链,并且具有一定的底物极性选择性,对于极性底物表现出更高的解旋活性。同时,纯化的NS2蛋白具有ATPase活性,其酶活力可达到0.276 μmol?μg-1?h-1。【结论】BmDNV-Z NS2基因编码的病毒非结构蛋白具有Helicase和ATPase活性,并且Helicase活性具有一定的底物极性选择性,推测该基因在病毒DNA的复制过程中发挥重要作用。     

Expression and Activity Analysis of Non-Structural Protein 2 （NS2） of Bombyx mori Densovirus Zhenjiang Strain

The gene of the non-structure protein 2 （NS2） was cloned by PCR from the genome ofBombyx mori densovirus Zhenjiang strain （BmDNV-Z）, inserted into prokaryotic expression vector pET28a to construct recombinant plasmid pET28a-NS2 and then expressed in bacteria Escherichia coli BL21 （DE3）. The expressed recombinant protein was identified by SDS-PAGE and Western blot analysis. Then, the recombinant protein was purified by Ni-NTA column, renatured and tested for enzyme activities. The purified NS2 protein exhibited a helicase activity unwinding double-stranded DNA substrates into single-strand primers, and higher unwinding activity to polarity substrate. Similarly, the purified NS2 protein possessed an ATPase activity and its enzyme activity was 0.276 μmol gg^-1 h^-1 in this study. The results indicated that the non- structure protein which encoded by the gene of BmDNV-Z NS2 possesses the biological activities of helicase and ATPase, and the helicase prefers to polarity substrates. Based on these results, it is speculated that the gene of BmDNV-Z NS2 plays an important role in the viral DNA replication.     

Effect of high-molecular-weight glutenin subunit Dy10 on wheat dough properties and end-use quality

High-molecular-weight glutenin subunits (HMW-GSs) are the most critical grain storage proteins that determine the unique processing qualities of wheat. Although it is a part of the superior HMW-GS pair (Dx5+Dy10), the contribution of the Dy10 subunit to wheat processing quality remains unclear. In this study, we elucidated the effect of Dy10 on wheat processing quality by generating and analyzing a deletion mutant (with the Dy10-null allele), and by elucidating the changes to wheat flour following the incorporation of purified Dy10. The Dy10-null allele was transcribed normally, but the Dy10 subunit was lacking. These findings implied that the Dy10-null allele reduced the glutenin:gliadin ratio and negatively affected dough strength (i.e., Zeleny sedimentation value, gluten index, and dough development and stability times) and the bread-making quality; however, it positively affected the biscuit-making quality. The incorporation of various amounts of purified Dy10 into wheat flour had a detrimental effect on biscuit-making quality. The results of this study demonstrate that the Dy10 subunit is essential for maintaining wheat dough strength. Furthermore, the Dy10-null allele may be exploited by soft wheat breeding programs.     

葡萄类钙调磷酸酶B亚基互作蛋白激酶VvCIPK10的特性与表达

【目的】在葡萄中克隆丝苏氨酸蛋白激酶Vv CIPK10,分析其激酶特性和在逆境胁迫下的表达模式,为进一步研究该基因参与逆境胁迫的分子功能,探讨葡萄抗逆分子机制提供理论依据。【方法】利用电子克隆技术获得Vv CIPK10序列,设计特异引物进行RT-PCR反应,对克隆到的序列进行开放阅读框和保守结构域分析;构建原核表达载体,转化表达菌株后用IPTG进行诱导表达,收集菌体后裂解细胞,制备蛋白上样液,SDS-PAGE电泳对表达产物进行分析,同时对融合蛋白进行可溶性分析;IPTG大量诱导表达融合蛋白,收集菌体后进行超声破碎细胞,用麦芽糖结合蛋白纯化柱纯化MBP-Vv CIPK10融合蛋白,SDS-PAGE电泳进行分析;纯化后的融合蛋白与体外自磷酸化缓冲液进行自磷酸化反应,反应后SDS-PAGE电泳,压磷屏检测体外自磷酸化反应;构建重组瞬时表达载体p BI221-GFP/Vv CIPK10;分离拟南芥原生质体,通过PEG介导的瞬时转化方法将重组表达载体p BI221-GFP/Vv CIPK10转化至原生质体;通过基因枪介导的转化方法将重组表达载体p BI221-GFP/Vv CIPK10转化至洋葱表皮细胞,培养16 h后用激光共聚焦显微镜进行荧光信号检测;选择生长相对一致且健壮的葡萄植株,于干旱、低温和盐胁迫处理后不同时间取样,同时在田间取葡萄不同组织样品,实时荧光定量PCR检测Vv CIPK10在葡萄不同组织中的表达以及在不同逆境胁迫下的表达模式。【结果】PCR克隆获得葡萄Vv CIPK10全长为1 357 bp,5′端非编码区为30 bp,3′端非编码区为156 bp,开放阅读框为1 171 bp,编码436个氨基酸,理论等电点为8.59,分子量为48.7 k Da。保守结构域预测分析显示该蛋白5′端具有一个激酶结构域,3′末端具有一个PPI结构域和一个NAF结构域。BLSATP分析表明葡萄Vv CIPK10与桃树CIPK(XP_007205151)一致性最高(74%)。重组表达载体p MAL-C5X/Vv CIPK10在大肠杆菌中经诱导表达获得与理论分子量(43 k Da+48.7 k Da)相一致的融合蛋白。MBP-Vv CIPK10融合蛋白经柱纯化后获得单一的蛋白条带,Vv CIPK10的自磷酸化活性依赖于Mn~(2+),不依赖于Mg~(2+)和Ca~(2+),EDTA可以抑制Vv CIPK10的自磷酸化活性。亚细胞定位结果显示,Vv CIPK10定位在细胞核、细胞膜和细胞质。Vv CIPK10在葡萄各个组织中均有表达,主要在葡萄根和叶片中大量表达,葡萄茎、花序、果实和卷须中的表达量较低。在干旱、低温和盐胁迫处理后,Vv CIPK10呈现受诱导表达模式。Vv CIPK10的表达在低温胁迫后6 h达到峰值,干旱和盐胁迫后2 h即达到峰值。【结论】葡萄Vv CIPK10能够响应干旱、低温和盐胁迫,推测Vv CIPK10在葡萄抗非生物逆境胁迫中具有重要作用。     

PEG处理对提高一串红种子活力的研究

以优、中、劣三个活力不等的一串红种子为材料,研究了PEG不同浓度和不同处理时间对种子发芽率的影响.结果表明:(1)PEG可明显改善中、低活力种子细胞膜透性,显著提高种子发芽率.(2)劣质一串红种子,用25;PEG处理1 d或10;处理4 d,其发芽率比对照提高16.12倍、19.2倍;中等活力一串红种子用10;PEG处理1 d较佳;而优良种子经过处理,反而效果不好.     

水稻簇矮病毒：植物呼肠孤病毒属的一个新成员

水稻簇矮病毒（ＲＢＳＶ）是由黑尾叶蝉（Ｎｅｐｈｏｔｅｔｉｘｃｉｎｃｔｉｃｅｐｓ）和二点黑尾叶蝉（Ｎ．ｖｉｒｅｓｃｅｎｓ）传播的持久性病毒，但不经卵传递；病害表现有奇特的多蘖症或节枝症，且其病株汁液与水稻矮缩病毒（ＲＤＶ）抗血清不起免疫反应．采用差速离心和蔗糖密度梯度离心，可获得ＲＢＳＶ提纯制剂，提纯制剂经紫外扫描，呈典型的核蛋白吸收曲线，Ａ２６０／２８０＝１．６４．在电镜下观察提纯病毒，可见大量比较均一的球状粒体，直径为６０．０ｎｍ．病毒粒体有双层衣壳，蛋白亚基清晰可辨．通过免疫扩散和免疫电镜试验，病毒粒体与ＲＢＳＶ抗血清有明显的血清学反应，而这种抗血清与ＲＤＶ、水稻瘤矮病毒（ＲＧＤＶ）不起反应．提纯ＲＢＳＶ制剂以苯酚－甲基苯酚－ＳＤＳ方法提取核酸．将其注射到昆虫介体内，具有侵染性．核酸制品有典型的核酸紫外吸收曲线，Ａ２６０／２８０＝２．０２．根据核酸在不同离子强度下对ＲＮａｓｅ的稳定性等的测定，表明其核酸属双链ＲＮＡ．根据紫外吸收测定，ＲＮＡ在ＲＢＳＶ粒体中的含量为１７．５％．用聚丙烯酰胺凝胶电泳测定，其ＲＮＡ的总分子质量为１６．６６×１０６．各组分相对分子质量分别为２．７０×１０６、２．３０×１０６、１?     

两种LD50计算方法对副溶血性弧菌毒力的比较研究

副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus,Vp)是目前备受关注的人畜共患病的病原。为了比较7株不同来源的Vp对斑马鱼的毒力大小及致病能力,采用急性毒性试验测定96 h内Vp对斑马鱼的半数致死剂量(median lethal dosage,LD_(50)),用累积法和Bliss法对比分析LD_(50)指标。结果显示:Vp KNH1无致病性。其他菌株感染后,均表现出腹部出血,腹腔有腹水,内脏出血等症状。用累积法和Bliss法分析人类致病菌株ATCC17802、ATCC33847及水生动物致病菌株Vp13、Vp31、Vp41、Vp57共6株不同来源的副溶血性弧菌的LD_(50),累积法计算得到的LD_(50)分别为6.0×107、7.4×107、3.9×107、1.6×108、1.6×108、9.3×107CFU/m L;Bliss法得到的LD_(50)分别为:5.0×107、7.6×107、3.6×107、1.5×108、1.6×108、9.4×107CFU/m L。研究结果发现两种计算方法得出的LD_(50)数值差距较小,结果相似,不同菌株毒力强弱的顺序均为:Vp13ATCC17802ATCC33847Vp57Vp31≥Vp41Vp KNH1。综上所述,累积法及Bliss法均可用于检测细菌毒力大小,但由于计算机的发展使得Bliss计算方法更加简便,为更优的选择。     

Potassium: argon dating of iron meteorites

The potassium:argon age of the metal phase of Weekeroo Station iron meteorite, determined by neutronactivation analysis, is about 10(10) years; it is similar to ages previously measured for other iron meteorites, but distinctly disagrees with a strontium: rubidium age of 4.7 X 10(9) years measured by other workers on silicate inclusions in this meteorite.     

基于能值与生命周期评价耦合模型的农业系统生态效率评估——以北京市郊区为例

结合能值分析和生命周期评价模型,从期望产出效率和非期望产出效率两个角度构建生态效率计量方法,评价京郊3种典型农作物生产系统的可持续性,为北京市农业内部结构优化提供科学的决策依据。研究表明:玉米、蔬菜和桃的能值投入产出比分别是6.61×10~4、1.47×10~5、1.92×10~5sej·J~(-1),玉米的期望产出效率最高,蔬菜其次,桃最低;玉米、蔬菜和桃生产系统的非期望产出效率分别是1.29×10~6、1.60×10~5和2.59×10~5,玉米的非期望产出效率最高,桃其次,蔬菜最低;玉米的生态效率最高,为2.95×10~(-4),蔬菜其次,为7.42×10~(-6),桃最低,为7.05×10~(-6);以蔬菜为例进行敏感性分析表明,投入要素中对生态效率敏感性最大的是电能(用于农田灌溉),氮肥次之,再次是有机堆肥和农药。调整种植业结构不仅要考虑农产品的产量及经济收益,还需要考虑生态效率。有机肥替代化肥能够显著提高农作物生产系统的生态效率,但要注意有机肥中重金属含量对人体健康的影响。总之,发展节水型粮食作物种植、加强农业节水和提高有机肥比例是改善北京市农田生态系统生态效率的重要措施。