猪繁殖与呼吸综合征病毒NX-1株ORF5,ORF7基因的克隆

为了从分子水平了解猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)ORF5和ORF7基因的特征,并为PRRSV的遗传进化和分子变异研究提供资料。对宁夏地区流行的PRRSV进行采样分析,运用RT-PCR技术分别扩增了PRRSV NX-1/2008毒株囊膜蛋白基因ORF5与衣壳蛋白基因ORF7,并对其进行了克隆,随后利用DNAS-TAR生物软件进行了同源性比对和进化分析。结果显示,PRRSV NX-1/2008毒株的ORF5,ORF7基因均与JXa-1/2007等高致病性毒株高度同源,ORF7的氨基酸同源性则达到了100%。与空间距离较远的JXa-1/2007毒株相比,NX-1株的ORF5基因在中和抗体决定区196位上发生突变,而与相距较近的HUB-1/2006,CH-1 a/2001等毒株相比较,则无此突变;与CH-1 a/2001毒株相比,GP5蛋白的免疫原性核心位点B 39位的F→I,在诱导中和抗体起重要作用的33位糖基化位点N→S,同时,诱骗位点A(30~38氨基酸)的32,33和35位氨基酸都发生了突变。NX-1株的ORF7基因与国内CH-1 a/2001等低致病性毒株间的突变有69%位于抗原决定区,而其中有56%是高致病性毒株的主动突变。研究表明,分离的PRRSV高致病性毒株与低致病性毒株的抗原性在基因组上有较大范围的变异,且这种变异可能还主要位于免疫决定区。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5 蛋白的结构与功能研究进展

猪繁殖与呼吸综合征（Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome,PRRS）是由猪繁殖与呼吸综合征病毒PRRSV引起的一种高度接触性传染病。作为一种RNA病毒,PRRSV的基因组存在广泛变异,其中以NSP2和ORF5基因变异为主。由于不同谱系毒株的ORF5有特征性的核苷酸序列,因此ORF5可用于PRRSV的分型。ORF5编码GP5蛋白,GP5蛋白含有多个表位,可与细胞受体作用,从而影响病毒的感染、复制。近年来,关于PRRSV的分子流行病学调查倾向于揭示不同毒株所特有的氨基酸突变。这些突变通常发生在GP5蛋白的信号肽编码区、非中和表位、中和表位和跨膜区。因此有研究将这些突变数据与病毒的毒力强弱、中和能力关联起来。而研究者尝试通过突变来推测GP5蛋白的构象或功能改变,从蛋白互作的结构基础层面来解释这种联系。由于GP5的三级结构并不能用传统的高分辨率冷冻电镜以及X射线晶体学方法观测,因此生物信息学方法成为相关研究的唯一选择。此外,GP5可用于基因工程疫苗的研制。综述了近年来关于GP5蛋白的生物信息学研究,并总结了GP5蛋白对病毒感染、复制、毒力、...     

陕西及周边地区PRRSV Nsp2与GP5基因变异分析

【目的】了解陕西及周边省份部分地区猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)Nsp2和GP5的变异情况。【方法】采用套式RT-PCR方法,从肝、脾、肺和血清中直接扩增Nsp2、GP5基因并克隆测序,将获得的PRRSV流行毒株序列与GenBank中30个PRRSV参考毒株进行比对分析,构建进化树。【结果】获得了13株PRRSV的Nsp2基因序列(GenBank登录号KM233849~KM233861)和12株GP5基因序列(GenBank登录号KM233862~KM233873)。基因进化树分析显示所有测定PRRSV流行毒株均属北美洲型。对Nsp2基因序列分析发现,12株PRRSV为氨基酸缺失毒株,1株PRRSV为经典毒株。发现GSXF毒株有可能是一株重组毒株。PRRSV变异株与经典株相比,GP5蛋白中存在多处氨基酸点突变。【结论】陕西猪场PRRSV流行毒株以变异株为主,同时存在经典毒株和重组毒株。     

1株NSP2蛋白5个氨基酸缺失的PRRSV遗传进化分析

【目的】研究新疆猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的遗传变异情况。【方法】提取PRRSV感染病猪肺脏RNA,通过RT-PCR方法对PRRSV NSP2部分基因和ORF5基因进行扩增、克隆和测序,分析其分子变异特征。【结果】成功克隆到1株PRRSV,命名为XJzx1株,其NSP2基因编码蛋白第472~476位存在5个氨基酸的连续缺失,有别于高致病毒株第482、533~561位30个氨基酸的典型缺失,位于经典毒株HB-2(sh)/2002第471~482位12个氨基酸缺失区域内;XJzx1与HK13株NSP2部分基因核苷酸序列相似性最高,为87.5%,系统进化树分析显示,XJzx1株与我国高致病毒株JXA1、HUN4、SX2009等同属一个分支;XJzx1 ORF5基因与我国经典毒株CH-1a、BJ-4、HK6等同属一个分支,其GP5蛋白不存在氨基酸的缺失或插入,而表现为多位点的突变。【结论】PRRSV XJzx1株具有独特的遗传进化特征,其毒性较经典毒株有所加强,推测为新型变异株。     

吉林地区高致病性PRRSV JL-04/12株的 分离鉴定与全基因组测序

【目的】确定吉林省某疑似高致病性PRRS猪场的病原,研究其基因特性。【方法】采集疑似感染高致病性PRRSV病猪的脏器组织,处理后接种MARC-145细胞,观察细胞病变,分离PRRSV;应用RT-PCR方法检测和确定分离毒株的基因型,采用间接免疫荧光、电镜观察和全基因组测序检测分离的病毒。【结果】分离毒株为北美洲型PRRSV,命名为JL-04/12,其基因组全长为15 320bp(不包括PolyA),可使MARC-145细胞产生典型的细胞病变。序列比对结果表明:JL-04/12株与经典毒株VR-2332和CH-1a的核苷酸同源性分别为89.5%和94.9%;与高致病性毒株JXA1、HUN4的核苷酸同源性为99.1%。分离毒株JL-04/12编码的2个非结构蛋白和GP2～GP4的氨基酸序列与HUN4株同源性较高,在97.2%～99.3%,而JL-04/12编码的GP5的氨基酸序列与JXA1株同源性较高,为98.5%;JL-04/12编码的GP6和N蛋白的氨基酸序列与高致病性PRRSV毒株JXA1和HUN4的同源性均为100%。PRRSV JL-04/12株的Nsp2不连续缺失30个氨基酸,与高致病性PRRSV毒株JXA1和HUN4的同源性最高,均为97.8%,判定该分离株为变异的高致病性PRRSV。【结论】从吉林省分离到1株高致病性PRRSV,说明高致病性PRRS变异病毒在吉林省仍然存在。     

表达PRRSV NADC30-like毒株GP5-M的重组伪狂犬病病毒的构建及其生物学特性探究

为获得一株能够融合表达猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV)GP5-M蛋白的重组伪狂犬病病毒PRV-GP5-M毒株，以猪伪狂犬病病毒(pseudorabies virus, PRV)变异株TK基因缺失株PRV FJ01/TK-为病毒载体，以gI/gE基因为插入靶点，利用同源重组技术和CRISPR/Cas9技术敲除gI/gE基因，并在gI/gE位置上插入CMV-GP5-M表达盒，经噬斑纯化，成功构建能够正确表达GP5-M蛋白重组病毒PRV-GP5-M。进一步对该毒株的稳定性、生长动力学、培养特性、安全性等生物学特性进行探究。结果表明，该重组毒株具有良好的遗传稳定性、安全性，易于增殖培养。研究结果为靶向PRRSV GP5与M蛋白生成新的PRRSV疫苗提供了新的线索，同时可为预防近些年流行的PRRSV NADC30-like毒株和PRV变异株的疫苗研发提供重要参考。     

1株PRRSV类NADC30毒株的分离鉴定及序列分析

为了解猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)流行株的变异情况,将PRRSV阳性病料处理后接种Marc-145细胞,成功分离到1株PRRSV毒株,将其命名为HENZXC-4,并对其全基因组序列进行测定和分析。结果表明,HENZXC-4为未发生重组的类NADC30毒株,其NSP2蛋白存在131个氨基酸不连续缺失,且其GP5蛋白存在1个氨基酸插入。     

PRRS吉林株GP5基因序列测定与分析

PRRSV易引起基因变异现象,使得异地疫苗不能有效地控制本地区PRRS的发生。为研制适合本地区的亚单位疫苗,试验参照GeneBank中已发表的PRRSV序列设计了1对特异性引物,对吉林分离株JL-0605对GP5基因进行了序列扩增和测序,序列分析结果表明,PRRSV JL-0605株GP5氨基酸序列与CH-1α和HEB1株氨基酸序列高度一致,而与VR-2332和BJ-4株有一定的差异,和LV株在N端及中心区具有很大的差异,JL-0605株GP5蛋白抗原性及亲水性与中国河北株具有较高的相似性;与VR-2332株相比,30～40位氨基酸处抗原表位形态发生较大变化,在135～145位氨基酸处抗原表位优势增强现象。     

免疫压力下猪繁殖与呼吸综合征病毒的变异

为了解连续免疫压力下猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）的变异规律,以及为猪繁殖与呼吸综合征病的防控提供科学依据,以贵州分离株 PRRSV AS 为研究对象,监测分析了 PRRSV 接种免疫猪群后其主要基因变异情况。结果表明：1）接种 PRRSV 后,免疫猪只未发生死亡现象,但出现轻微的临床表现和病理变化,且能在病变组织中分离到 PRRSV,并扩增出与预期大小相一致的 Nsp2和 GP5基因条带;2）对Nsp2基因,两次分离物 PRRSV AS-a、PRRSV AS-b 与原始病毒 PRRSV AS 的遗传距离相应为0．018和0．064,呈加速渐远趋势;PRRSV AS-a 发生16处点突变,其中9处为非同义突变,7处为同义突变;PRRSV AS-b 发生25处点突变,其中非同义突变12处,同义突变13处;从 PRRSV AS 向 PRRSV AS-a 到PRRSV AS-b 演变过程中,Nsp2基因编码蛋白第285～293位抗原指数发生不同程度改变,且演变趋势呈正向选择作用;3）对 GP5基因,两次分离物 PRRSV AS-a、PRRSV AS-b 与原始病毒 PRRSV AS 的遗传距离相应为0．004和0．015,变异趋势不明显;PRRSV AS-a 发生2处点突变,非同义突变和同义突变各1处;PRRSV AS-b 发生3处点突变,其中非同义突变2处,同义突变1处;从 PRRSV AS 向 PRRSV AS-a 到PRRSV AS-b 演变过程中,GP5基因编码蛋白重要抗原表位未发生改变,但其演变呈正向选择作用。说明,在连续免疫压力下 PRRSV 容易发生变异。     

欧洲型PRRSV的分离鉴定及其ORF5基因序列分析

采自福建省规模化猪场的疑似病料进行PRRSV分离鉴定,采用RT-PCR方法扩增PRRSV ORF5全基因并进行序列测定分析。从采集的病料中成功分离2株PRRSV,2株分离毒株ORF5与Gen Bank中选择的参考毒株比较发现,其核苷酸同源性为82.5%~90.6%,氨基酸同源性为80.6%~91.5%。通过序列进行系统进化分析均显示分离毒株属于欧洲型PRRSV,ORF5基因与LV相比变异较大,应加大对欧洲型PRRSV的监控。     

产销通路的建立及招商引资意见

针对大陆农业发展存在的不足有必要建立产销通路 ,并提及物流在流通环节的重要性。最后就大陆各地的招商引资提出了意见     

秸秆切碎灭茬机的设计与试验

针对双轴击切式破碎秸秆和根茬所存在的问题，本文提出单轴压切原理和非等长刀切碎模型，并对秸杆切碎灭茬机的关键参数进行了优化设计。该机田间试验表明切碎率达91．4％，根茬破碎率达86．5％。该机的应用必将促进一年两熟平作旱区保护性耕作技术的发展。     

秸秆切碎灭茬机的设计与试验

针对双轴击切式破碎秸秆和根茬所存在的问题，本文提出单轴压切原理和非等长刀切碎模型，并对秸杆切碎灭茬机的关键参数进行了优化设计。该机田间试验表明切碎率达91．4％，根茬破碎率达86．5％。该机的应用必将促进一年两熟平作旱区保护性耕作技术的发展。     

《机械原理》与《机械设计》实验教学改革实践

《机械原理》和《机械设计》两门课程的实验教学在培养学生的综合设计、创新设计能力等方面,有其他课程不可替代的重要作用,针对两门课程传统实验教学中存在的问题,提出了以独立设课为中心的实验教学改革和实践方案,取得了显著的效果。     

植物学与分子生物学研究创新型实验项目的设计与实施

以农杆菌渗入烟草表皮瞬间表达绿色荧光蛋白的观察实验为例,对植物学与分子生物学研究创新型实验的选题设计、教学过程和效果进行了探讨。该实验项目的实施培养了学生的团队精神、科学素养和创新意识,提高了实验设计和实际操作能力,是生物科学特色专业实验教学改革的有益尝试。     

保护地茄果类蔬菜落花落果的原因及防治对策

从自身原因和外部环境条件两方面分析了保护地蔬菜落花落果的主要原因,提出防治措施,有效控制落花落果的发生。     

灌水和过量施钾对烤烟养分含量及烟叶产量品质的影响

采用田间试验研究了灌水和过量施钾对烤烟（Nicotiana tabacum L.)养分含量和产量品质的影响。结果表明，在烤烟N：K2O用量比达到1：3的基础上随钾用量增加，烟株体内营养元素含量、烟叶产量和化学成分均没显著差异，灌水可以显著提高烟叶产量和上等烟比例，但灌水与钾用量互作对烤后烟叶养分含量和化学成分的影响不显著。     

万寿菊病虫害的发生与防治措施

万寿菊又名金盏花、臭芙蓉 ,千寿菊、蜂窝菊 ,属菊科万寿菊属一年生草本植物。黑龙江省八五三农场人工栽培万寿菊主要是取其花朵作为提取黄色素的原料。在正常条件下 ,种植万寿菊可实现公顷产鲜花 2 2 .5t以上、产值可达 135 0 0元左右、利润可达6 0 0 0元左右 ,经济效益较好。     

耐低温兼性厌氧蛋白酶产生菌192的筛选、鉴定及酶学性质

为了提高厌氧水解效率,采用双层平板法筛选出一株耐低温兼性厌氧蛋白酶产生菌192.经形态、生理生化和16S rDNA序列分析鉴定为蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus),对其产酶条件进行了初步研究.结果表明,该茵的最适生长温度为30℃,生长8～12h达对数期,初始pH 7.5时酶活力最高.蛋白酶最适反应温度为45℃、pH 7.0,酶活力最高达39.3 U/mL.该酶在50℃以下,pH 6.0～9.0性能稳定.在60℃以上热稳定性很差,70℃保存lh酶活力全部丧失.     

副猪嗜血杆菌分离鉴定与PCR检测方法的建立及应用

从养猪场送检的猪肺病料中分离到3株疑似副猪嗜血杆菌(HPS)可疑菌株。经形态镜检、染色特性、生化和部分生物学特性试验,初步鉴定为HPS。在细菌学鉴定基础上,设计合成3对引物,分别以3株分离菌株的DNA为模板进行PCR扩增,结果均扩增出822 bp8、24 bp和1.9 kb的预期特异性条带。以HPS GD株作为参考阳性菌株,以P1、P2为引物,设计优化PCR反应程序,建立HPS PCR检测方法,并应用于临床病料检测。结果表明,所建立的HPS PCR检测方法特异与敏感性高、适用性强,可应用于HPS感染的诊断和检测。