草莓灰霉病菌对速克灵的抗性研究

速克灵对草莓灰霉病具有很好的防治效果,但长期、单一使用很容易使草莓灰霉病菌产生抗药性。为合理使用这类杀菌剂,延缓或防止抗药性的产生,笔者通过UV-C诱变草莓灰霉病菌敏感菌株CF1获得了对速克灵具有高抗性的突变株CF1-1和CF1-2,并对抗性突变株的生长量、产孢量和致病力进行了研究,结果表明:CF1-1与CF1-2对速克灵抗性程度高,抗性水平与敏感菌株相比分别增加了484.6倍和911.0倍。抗性菌株在无速克灵的培养基上菌丝生长较敏感菌株弱,产孢量也明显少于敏感菌株;但其引起草莓离体叶片发病较敏感菌株重,病斑大且边缘颜色深;薄片黄瓜测定结果也表明,在无速克灵的情况下,敏感菌株CF1引起发病较重;而在有药条件下CF1受到一定抑制,但抗性菌株仍能致黄瓜片发病。将抗性菌株连续培养7代后对速克灵的抗性仍是相对稳定的。     

对多菌灵、速克灵具多重抗性的灰霉病菌菌株性质的研究

从江苏常州草莓上分离到的 Botrytis cineren 菌株 B205对多菌灵、速克灵均表现高度抗性。多重抗性菌株在含多菌灵或速克灵的 PSA 培养基上菌丝生长很少受抑制,在无药的 PSA 培养基上菌丝连续培养8代后,抗性程度并不下降,只表现生长速率有所降低;对扑海因呈交互抗药性,但对福美双、克菌丹、百菌清、退菌特、粉锈宁等杀菌剂的反应与敏感菌相似;该多重抗性菌的产孢能力明显低于敏感菌。     

蔬菜灰霉病菌对速克灵抗药性变异研究

蔬菜灰霉病的灰葡萄孢（Botrytiscinerea）分生孢子经紫外光灯照射,可获得10-4～10－5频率的速克灵抗药性突变体。获得的8个抗性突变体的抗性水平平均EC50值为11．9776μg／ml,EC90值为226．5361μg／ml。抗性突变体的酯酶同工酶港带比其亲本敏感菌株谱带多2～4条,其中Rf＝0．38的谱带是抗性菌株所拥有而敏感菌株所共同缺乏的。抗性菌株对速克灵抗药性能稳定遗传,具有与亲本菌株相同的繁殖能力和致病性。突变体和抗性菌株苗期抗、感测定结果表明,对速克灵、多菌灵杀菌剂表现双重抗性,但对灰霉克、利得杀菌剂不存在交互抗性。     

番茄灰霉病菌对速克灵的抗性检测

对来自安徽省合肥、蚌埠、六安、和县的 5 4个番茄灰霉病菌株进行了对速克灵的抗性测定 ,并分析了番茄灰霉病菌生长特性与抗药性、致病力的相关性。结果表明 ,4个菌株为速克灵高抗型 ,占 7.4% ;无中抗型 ;5 0个菌株为敏感型 ,占 92 .6%。各菌株间生长速度、菌核干重差异较小 ,产孢量差异较大。产孢量与菌核干重相关极显著 ,其余性状间相关皆不显著     

蛋白激酶A催化亚基VdPKAC1对菌丝型大丽轮枝菌V07DF2培养性状及致病力的调控

【目的】通过同源重组敲除技术,解析菌丝型大丽轮枝菌中蛋白激酶A催化亚基基因VdPKAC1在调控微菌核发育、产孢及其致病力方面的作用。【方法】利用Invitrogen公司的Gateway®技术构建VdPKAC1的同源重组敲除质粒。该质粒的潮霉素抗性基因盒两端分别为靶标基因5′和3′端各1 kb的DNA序列。通过农杆菌AGL-1的介导,将该质粒的T-DNA区域整合到来源于棉花的菌丝型大丽轮枝菌V07DF2菌株中。从6个随机选择的含有潮霉素抗性基因片段的转化子中,通过靶标基因的PCR检测,获得了5个VdPKAC1基因敲除突变体。经过Southern杂交检测,选择了3个敲除突变体材料（2B5、C5和HH2）进行突变表型的观察和分析。在液体PDB培养7 d后观察敲除突变体与野生型菌株的黑色素产生情况;在固体PDA培养28 d后,观察敲除突变体与野生菌株的菌丝生长和休眠结构形成情况。此外,利用棉花根提取物对液体Cazpek-Dox培养7 d的各菌株分别进行诱导处理,在处理24、72 h后分别统计分生孢子数量,以此对敲除突变体和野生菌株的分生孢子产生能力进行评估。最后,将孢子浓度为1×107个/mL的突变体和野生菌株的分生孢子液灌根接种2叶期的棉花,测定其致病力。【结果】Southern杂交结果表明,在上述5个敲除突变体中,只有2B5和C5两个菌株为T-DNA单拷贝插入,而其他菌株均存在T-DNA异位整合的情况。在PDA培养条件下,3个敲除突变体（2B5、C5和HH2）与野生型相比具有黑色素合成增加,气生菌丝更加发达的特点。其中,敲除突变体2B5和C5在平板培养条件下还形成了野生型菌株没有的、与典型微菌核形态不同的深褐色“链状休眠菌丝体结构”。在棉花根提取物的诱导处理下,3个敲除突变体产生的分生孢子数量少于野生型菌株。另外,致病力分析结果表明,敲除突变体材料仍然具有一定的致病力,但却显著弱于野生菌株V07DF2。【结论】在大丽轮枝菌中,通过蛋白激酶A介导的环腺苷酸信号途径控制多种重要性状,而VdPKAC1是这一途径中的重要成员。以前的报道证实,VdPKAC1负调控微菌核的数量,而本研究利用菌丝型菌株V07DF2在PDA培养基上不产生微菌核的这一特性,通过同源重组原理敲除该负调控基因,成功获得可以在PDA上产生休眠结构的菌丝型大丽轮枝菌菌株的突变体。这些突变体材料将为大丽轮枝菌微菌核发育信号途径及其调控基因的发掘提供平台和基础。     

灰葡萄孢对速克灵抗性的研究

从江苏各地采集番茄等15种蔬菜灰霉病标本,经分离获灰葡萄孢(Botrytis cinerea Pers.)127株。以速克灵有效成分5μg·mL~(-1)为标准,检测灰葡萄孢对速克灵的抗性。结果表明:病菌抗速克灵菌株频率平均为11.0％。抗性菌株中,85.7％属低抗水平,EC_(50)值在2.21～6.67μg·mL~(-1)之间。但菌株D_(1-3)抗药性水平极高,EC_(50)和EC_(95)分别达263.78和6000μg·mL~(-1)以上,EC_(95)值约是敏感菌株的1400倍。抗性菌株转管培养15和30代后,抗性水平仍较稳定。抗性菌株在菌丝生长速度、分生孢子与菌核形成以及对番茄致病力等方面无明显规律性,但高抗菌株D_(1-3)具有很强的生长、繁殖能力和致病力。     

番茄早疫病菌抗感异菌脲菌株特性研究

测定不同营养条件、温度和pH值对番茄早疫病菌抗感异菌脲菌株生长的影响。结果表明,抗感菌株均在以蛋白胨为氮源的培养基中生长最快,敏感菌株在以可溶性淀粉为碳源的培养基中生长最快,突变体和抗性菌株在以乳糖为碳源的培养基上生长最快。突变体在pH值为7时生长最快而敏感菌株在pH值为6时生长最快,在不同pH值条件下,敏感菌株都比突变体生长速度快。在4～35℃菌丝均能生长,以20～25℃生长最快。测定抗感菌株对渗透压的敏感性和菌丝内的甘油、可溶性糖含量。结果发现,突变体比亲本菌株对渗透压具有较高的敏感性,所有抗性菌株在含高于10g/LNaCl的PDA平板上菌落直径随着NaCl质量浓度的升高而减小,在含高于40g/LNaCl的平板上停止生长。含药培养液中敏感菌株菌丝内甘油合成大量增加和积累,突变体和抗性菌株菌丝内甘油含量增加较少或有所下降,菌丝内可溶性糖含量变化不明显。     

黄瓜灰霉病菌对多菌灵、速克灵及乙霉威的抗性检测

为了明确山西省晋中地区黄瓜灰霉病菌对多菌灵、乙霉威及速克灵的抗性水平,运用组织分离法从太谷、祁县和平遥的罹病黄瓜上分离到30个灰霉病菌菌株(Botrytis cinerea Pers.),并用最低抑制浓度法(MIC)和菌落直径生长法分别测定了这30个菌株的抗性频率和抗性水平。结果表明,30个菌株对乙霉威、多菌灵和速克灵的抗性频率分别为70%,80%和90%;3种杀菌剂敏感菌株的平均EC50分别为0.036 9,0.057 4,0.269 2μg/mL;3种杀菌剂抗性菌株的平均抗性倍数分别为66.0倍、421.5倍和55.3倍。表明山西晋中地区黄瓜灰霉病菌对乙霉威和速克灵的抗性达到中抗,对多菌灵的抗性为高抗。建议在该地区生产中停止使用多菌灵,减少使用乙霉威和速克灵或与其他药剂混合使用。     

南京市郊灰霉菌对苯并咪唑类杀菌剂田间抗性的检测

从大葱上分离到的B1茵株(Botrytis cinerea)对多菌灵、托布津类杀菌剂有高度耐药性。在含多菌灵1000微克/毫升的马铃薯蔗糖琼脂(PSA)培养基上,该菌株的菌丝生长很少受到抑制,难以测定最低抑制浓度(MIC)值,而野生敏感菌株在0.5微克/毫升多菌灵浓度下,菌丝则完全不能生长。B1菌株对多菌灵、托布津、苯菌灵有高度交互抗性,但对克菌丹、百菌清、二甲菌核利杀菌剂的反应与野生型菌株相似。 B1菌株在无药的PSA培养基上菌丝转移连续培养12代后测定,只表现生长速率有所减慢,而对多菌灵的抗性程度无下降。     

番茄灰霉菌的多重抗药性研究

从山东3个用药情况不同的保护地番茄上，采集番茄灰霉菌进行了番茄灰霉菌（B.cinerea）对3种不同类型杀菌剂的抗性监测，在用药历史长、水平高的寿光丰城，灰霉病对多菌灵、腐霉利、乙霉威产生多重抗性的菌株出现频率为53．7％，对多菌灵、速克灵产生双抗的菌株出现频率为100％；在泰安良庄，上述菌株出现的频率分别为6．8％和72．7％；在新建棚区新泰龙廷均为敏感菌株。所有的多菌灵抗性菌株均属高抗菌株（EC50＞100mg/L），速克灵抗性菌株均属低抗菌株（1mg/L＜EC50＜10mg/L），乙霉威抗性菌株均属低抗菌株（O．9mg/L＜EC50＜4mg/L）。在无药PDA培养基上连续培养8代后，对多菌灵、腐霉利、乙霉威的抗性程度并未降低。分别在PDA培养基和黄瓜子叶上进行了高体适合度和致病力的测定。     

苹果树腐烂病菌GTP-环化水解酶II基因敲除载体构建及其突变体的表型分析

【目的】利用反向遗传学方法构建苹果树腐烂病菌（Valsa mali）中表达GTP-环化水解酶II基因Vmgtp1的敲除载体,通过同源重组的方法进行基因敲除分析目标基因的功能,为全面解析苹果树腐烂病菌致病的分子机制奠定基础,并为有效控制苹果树腐烂病的方法技术和药剂研制提供理论依据。【方法】通过对笔者实验室苹果树腐烂病菌转录组数据的分析比对得到GTP-环化水解酶II基因Vmgtp1（暂命名）,该基因在接种5 d后,在病组织中表现出一定的上调表达,推测该基因可能与苹果树腐烂病菌致病相关。采用Double-joint PCR方法,将目标基因Vmgtp1的上游片段UP、下游片段DOWN及筛选标记潮霉素磷酸转移酶基因（hph）进行片段融合。对得到的PCR产物及质粒pHIG2RHPH2-GFP-GUS进行双酶切,通过T4连接酶,将片段UP-HPH-DOWN连接到质粒pHIG2RHPH2-GFP-GUS上,转化到JM109菌株中,挑取阳性克隆,提取质粒,得到含有hph的Vmgtp1敲除载体,再利用PEG介导的遗传转化获得抗潮霉素的突变体,然后用4对引物对突变体进行PCR检测及Southern Blot验证得到敲除突变体,最后对敲除突变体及野生型菌株03-8进行菌落颜色、菌落大小、繁殖体产生情况等表型分析和接种在离体苹果烫伤枝条上观察病斑大小的致病性检测,对检测数据用SPSS软件进行差异显著性分析。【结果】通过上述方法成功构建了表达GTP-环化水解酶II基因的Vmgtp1敲除载体,并利用PEG介导的遗传转化方法在苹果树腐烂病菌中进行了转化,共获得101个能够在含潮霉素PDA培养基上生长的突变菌株,经过PCR及Southern Blot对101个突变菌株进行分析验证,得到1个敲除突变体,编号为ΔVmgtp1-90。在PDA培养基上,敲除突变体ΔVmgtp1-90与野生型菌株03-8相比,ΔVmgtp1-90菌落平均生长速率为11.33 mm?d-1,03-8平均生长速率为24.67 mm?d-1,突变体菌落生长速率明显变慢,颜色变浅,气生菌丝稀疏;ΔVmgtp1-90光照培养40 d仍无繁殖体的产生,而03-8光照条件下培养15 d后就能产生繁殖体,30 d后有分生孢子从繁殖体上溢出。致病性检测试验发现,接种ΔVmgtp1-90菌株7 d后,富士苹果枝条上病斑的平均直径为9.3 mm,与之相比,接种03-8的苹果枝条病斑平均直径为24.8 mm,ΔVmgtp1-90致病性显著减弱。【结论】通过基因敲除和遗传转化获得苹果树腐烂病菌中表达GTP环化水解酶II Vmgtp1的敲除突变体ΔVmgtp1-90,比较Vmgtp1突变体与野生型菌株的表型及致病性差异,发现Vmgtp1可能参与调控苹果树腐烂病菌菌丝生长和繁殖体的产生过程,并且可能在苹果树腐烂病菌致病过程中起作用,但是是否起主要作用还有待进一步研究。     

辐射诱变高产虫草素蛹虫草菌株的研究

[目的]筛选高产虫草素蛹虫草菌株。[方法]采用放射性元素60Co-γ射线辐射诱变方法对蛹虫草菌株进行处理。[结果]筛选出yccGy1016诱变菌株为目标菌株,其生物转化率达12.5%,菌丝中虫草素含量达481.6 mg/kg,子实体虫草素含量达9 600 mg/kg,明显高于对照菌株。[结论]经10代加富PDA斜面继代培养及罐头瓶小麦培养基栽培试验,yccGy1016诱变菌株具有产量性状稳定、产生虫草素能力强的特点。     

番茄早疫病菌抗腐霉利突变体的生物学及生理生化特性研究

生物学生理生化特性研究表明,抗药突变体与亲本敏感菌株对pH值的要求略有差别,并且,在不同PH值条件下,亲本菌株都比突变体生长速度快;二者在不同温度下生长情况也有差别。通过生物学测定抗药突变体与亲本敏感菌株的相对电导率,发现抗药突变体能在更短的时间内渗出更多的电解质。此外,抗药突变体的苯丙氨酸解氨酶活性比敏感亲本菌株高,当用不同浓度腐霉利处理或饥饿处理时,抗药突变体与敏感亲本菌株PAL活性均上升,但抗药突变体的酶活性始终高于敏感亲本菌株。     

设施栽培黄瓜枯萎病菌拮抗菌的筛选

通过从PDA平板对峙培养试验设施黄瓜内生细菌中筛选出对枯萎病菌（Fusarium.Oxysporum f.sp.cucumberium Owen.）具有拮抗效果的菌株,作为将来进行黄瓜病害生物防治的资源菌株。结果表明,52株内生细菌中有14个菌株对枯萎病菌有拮抗作用,占菌株总数的26.9%,抑菌圈半径最大的可达6mm。     

腐霉利在新疆北部地区黄瓜上的最终残留量研究

为了探明腐霉利在新疆北部地区黄瓜上残留特性和使用安全性,通过田间试验和室内检测,研究了腐霉利在黄瓜中的最终残留量。结果表明:以腐霉利50%可湿性粉剂562.5～750.0 g/hm2(有效成分),连续施药2～3次,最后一次施药后3 d收获的黄瓜中腐霉利残留量均低于0.13 mg/kg,推荐该药在黄瓜上的安全间隔期为3 d。     

尖孢镰刀菌FoPLC4参与调控孢子形成和致病性

【目的】黄瓜枯萎病是黄瓜生产中的重要病害,其病原菌为尖孢镰刀菌黄瓜专化型（Fusarium oxysporum f. sp. cucumerinum）。研究旨在明确尖孢镰刀菌黄瓜专化型编码磷脂酶C（phospholipase C,PLC）的FoPLC4在调控分生孢子形成和致病性等方面的功能。【方法】采用生物信息学方法,确定FoPLC4在染色体上的位置,分析FoPLC4结构。基于尖孢镰刀菌番茄专化型基因组数据库,采用特异性引物克隆黄瓜枯萎病菌FoPLC4。根据同源重组原理构建携带潮霉素磷酸转移酶（hygromycin phosphotransferase,HPH）基因的敲除载体,利用PEG（polyethylene glycol）介导的方法转化原生质体,获得黄瓜枯萎病菌的敲除突变体?FoPLC4和遗传回复突变体?FoPLC4/plc4。转化子经潮霉素B平板筛选后通过PCR和RT-PCR分子验证。在PDA（potato dextrose agar）培养基上测定?FoPLC4生物学性状。利用分生孢子接种黄瓜胚根测定?FoPLC4在黄瓜幼苗上的致病性。【结果】FoPLC4位于尖孢镰刀菌基因组的4号染色体,DNA全长3 282 bp,不含内含子,编码1 093个氨基酸;FoPLC4含有5个结构域,包括EF手形（EF-hand）区、PH（pleckstrin homology）区、C2区和2个催化区,属于PLCδ亚型。与野生型菌株相比,?FoPLC4菌落生长速率没有显著改变,但气生菌丝较疏松;?FoPLC4可以同时产生大型分生孢子和小型分生孢子,大型分生孢子只占孢子总数的12.1%,而野生型菌株在相同条件下只能产生小型分生孢子,?FoPLC4产孢量下降了82.2%。致病性测定表明?FoPLC4在黄瓜幼苗上的萎蔫症状明显减轻,接种10 d后病情指数下降了53.3%。回复突变体?FoPLC4/plc4在菌落生长、产孢和致病性等性状与野生型相比没有显著差别。【结论】尖孢镰刀菌黄瓜专化型FoPLC4全长3 282 bp,不含内含子,编码1 093个氨基酸。与野生型相比,?FoPLC4分生孢子的产孢类型明显改变、产孢数量和对黄瓜幼苗的致病性显著降低。FoPLC4在调控尖孢镰刀菌分生孢子形成和致病性中发挥重要作用。     

K_2HPO_4采后处理对马铃薯干腐病的抑制

采用K2HPO4浸泡马铃薯块茎和切片,研究K2HPO4对损伤接种Fusarium sulphureum马铃薯干腐病的控制效果.结果表明:K2HPO4处理可有效抑制损伤接种马铃薯块茎和切片病斑直径的扩展,其中以70 mmol.L-1处理效果最好.K2HPO4对切片的最强抗性诱导出现在处理后48 h;K2HPO4处理后损伤接种切片组织中POD、PPO、PAL和GLU活性明显增高,O2.-和木质素含量显著积累,说明K2HPO4可通过诱导马铃薯体内的防卫反应来增强其对干腐病的抗性.     

灰霉病菌抗感腐霉利菌株形态和生理生化特性的比较

经紫外线照射、亚硝基胍处理和药剂诱导,分别从灰霉病菌野生敏感菌株XY6-1S获得高抗腐霉利菌株XY6-1R052、XY6-1R140和XY6-1R202,其EC_(50)>100,μg·mL~(-1)、MIC>1 000μg·mL~(-1).在1～4μg·mL~(-1)药剂浓度下,敏感菌株菌丝呈现不同程度的形态异常,甚至细胞壁破损,而抗性菌株菌丝未有明显改变.在含20μg·L~(-1)以上蔗糖或1.25 g·L~(-1)以上NaCl培养基上,抗药菌株菌丝生长明显差于敏感菌株,表明前者比后者对高渗透压敏感.另外,抗药菌株菌丝相对电导率显著高于敏感菌株,显示抗药菌株细胞膜透性明显改变,因而导致电介质渗漏.在含药培养液中,敏感菌株菌丝甘油含量急剧上升,提高904.63%,而抗药菌株菌丝甘油含量仅增加20.54%～44.00%,因此对于高渗环境,敏感菌株具有较好的调节能力.