欧拉羊胚肾细胞的分离培养和鉴定

[目的]分离培养并鉴定欧拉羊胚肾细胞,为该品种基因组文库构建和遗传多样性研究提供生物学材料。[方法]用胰蛋白酶热消化法分离并培养欧拉羊胚肾原代细胞,通过差速消化和差速贴壁法纯化成纤维细胞,扩大培养至第3代用液氮保存,细胞复苏后进行活力、形态、生长曲线、微生物污染检测和连续传代培养试验。[结果]欧拉羊胚肾细胞呈成纤维型,复苏活力90%以上,生长良好,生长曲线呈"S",最大增殖浓度为4.61×105/ml,倍增时间26 h;细菌、真菌、病毒、支原体检测呈阴性,连续传代培养在10代内生长正常。[结论]欧拉羊胚肾细胞分离培养成功,使这一重要种质资源在细胞水平上得以保存。     

寿光黑鸡成纤维细胞的体外培养与冷冻保存

[目的]建立鸡成纤维细胞的体外培养体系。[方法]用组织块法和消化法分别分离培养鸡皮肤成纤维细胞;比较细胞生长速率及冻存复苏率。[结果]酶消化培养的成纤维细胞原代生长较快,约5 d便可形成单层;2种方法传代细胞的生长速度相似,仅需2~3 d就可形成单层;使用酶消化法和反复贴壁法,经3~4代后,可获得纯化的成纤维细胞;成纤维细胞经冷冻复苏后有75%~80%存活;分离纯化的胚胎和皮肤成纤维细胞的生长曲线均正常,可传至12代,传代后染色体数目不变。[结论]采用组织块法及酶消化法培养鸡成纤维细胞均可获得ES细胞建系所需的饲养层细胞。该研究为ES细胞系的成功建立奠定了基础。     

牦牛子宫内膜腺上皮细胞分离培养方法比较

[目的]建立牦牛子宫内膜腺上皮细胞体外分离培养方法。[方法]分别采用组织块培养法和消化培养法分离、纯化牦牛子宫内膜腺上皮细胞。[结果]组织块培养约8d细胞可汇合成片,经胰蛋白酶分次消化,可得到纯化的子宫内膜上皮细胞;使用2g／L的胶原酶Ⅱ消化2．5h,更换新鲜消化液继续消化2．5h,消化悬液经74斗“滤网过滤,400r／rain离心5min,收集沉淀,重悬后自然沉降,可得到纯净的腺细胞团。免疫细胞化学显示所得细胞角蛋白染色阳性,阳性率达到95％以上。[结论]2种方法均可得到纯净的牦牛子宫内膜上皮细胞。     

小鼠子宫内膜上皮细胞体外培养方法比较

为探讨适用于小鼠子宫内膜上皮细胞的培养方法,对胰蛋白酶消化法、胰蛋白酶消化+刮取法、Ⅰ型胶原酶消化法、Ⅰ型胶原酶消化法+刮取法、子宫翻转组织块培养法5种方法进行了比较研究.结果表明,胰蛋白酶消化法获得的上皮细胞数量稀少,活力低,生长速度缓慢;刮取法+胰蛋白酶消化法、胶原酶消化法、刮取法+Ⅰ型胶原酶消化法获得的细胞数量较单纯胰蛋白酶消化法多,但达不到研究所需的要求;子宫翻转组织块培养法获得的上皮细胞活力强,生长速度快,纯度高,比较适宜小鼠子宫内膜上皮细胞的原代培养.     

大鼠骨骼肌卫星细胞培养的研究

[目的]探讨在体外条件下骨骼肌卫星细胞纯化、培养、鉴定的方法及确定其生物学特性。[方法]取新生大鼠的小腿肌肉,采用肌组织块和肌细胞培养两种方法。分别用胰蛋白酶对培养中的肌组织块和肌细胞进行消化,采用离心及差速贴壁法纯化,得到更高纯度的大鼠骨骼肌肌卫星细胞,进行体外原代骨骼肌和传代骨骼肌的细胞培养。传至第2代后,用分化培养基诱导分化,观察骨骼肌细胞各个阶段的形态特征并拍照。[结果]此方法分离的细胞成活率较高,体外生长、增殖良好。在分化培养基条件下,细胞分化良好,可融合成肌管。[结论]该实验成功探讨了新生大鼠骨骼肌卫星细胞的分化能力并建立了卫星细胞纯化方法,适用于开展细胞移植和肌组织工程方面的研究。     

家兔卵巢间质细胞的分离培养与形态观察

采用0.1% 型胶原酶和2.5g/L胰蛋白酶-0.2g/LEDTA,分别用热消化法和冷消化法消化分离家兔卵巢间质细胞,以探讨其体外培养条件和生长特点。结果表明,无论用热消化法还是冷消化法,0.1% 型胶原酶的消化效果均好于2.5g/L胰蛋白酶-0.2g/LEDTA的消化效果,前者的细胞活率在90%以上,可用于体外培养;经74μm滤网过滤后的卵巢组织分离培养出梭形和不规则形的间质细胞,且2种类型的细胞能在同一培养体系中贴壁生长。说明0.1% 型胶原酶可用于家兔卵巢间质细胞的分离。     

大口黑鲈肝细胞原代培养方法的建立

取材大口黑鲈肝脏组织,培养其原代细胞,比较研究了组织块法和酶消化法两种培养方法及不同的培养条件,以确定其最佳培养方法和条件,同时观察了长期培养过程中肝细胞的形态变化。结果表明:组织块方法不适于大口黑鲈肝细胞的培养,未见细胞从组织块中迁出。而胰蛋白酶消化法获得良好稳定的培养效果。胰蛋白酶浓度0.25%,消化时间20 min,分步收集肝细胞,经台盼蓝检测和血球计数板计数,平均活力>90%,每克肝重可获得3×106个分离肝细胞。在细胞活力和数量两方面达到最佳平衡。在含20%胎牛血清、10μg/mL胰岛素的M199/L15培养基中,于4%CO2,28℃培养箱中长期培养并传代。     

大口黑鲈肝细胞原代培养方法的建立

取材大口黑鲈肝脏组织,培养其原代细胞,比较研究了组织块法和酶消化法两种培养方法及不同的培养条件,以确定其最佳培养方法和条件,同时观察了长期培养过程中肝细胞的形态变化。结果表明:组织块方法不适于大口黑鲈肝细胞的培养,未见细胞从组织块中迁出。而胰蛋白酶消化法获得良好稳定的培养效果。胰蛋白酶浓度0.25%,消化时间20 min,分步收集肝细胞,经台盼蓝检测和血球计数板计数,平均活力>90%,每克肝重可获得3×106个分离肝细胞。在细胞活力和数量两方面达到最佳平衡。在含20%胎牛血清、10μg/mL胰岛素的M199/L15培养基中,于4%CO2,28℃培养箱中长期培养并传代。     

广西巴马香猪耳皮成纤维细胞的分离与培养

试验主要对广西巴马香猪耳皮成纤维细胞的分离和培养进行了研究.利用组织块法能够成功分离培养广西巴马香猪耳皮成纤维细胞,其大小范围在1～3 mm3,去除表皮有利于组织块贴壁和细胞的游出;而采用0.25%胰蛋白酶消化液4℃冷处理过夜,不仅有利于去表皮操作,减少取材处理时间,而且操作时间自由度大.在酶消化法中采用胰蛋白酶消化30 min,胶原酶继续消化30～40 min,能够成功分离培养广西巴马香猪耳皮成纤维细胞.广西巴马香猪皮肤成纤维细胞要经历滞留期、对数期、平台期,分别为0～2 d、2～8 d、8～12 d.     

小鼠睾丸支持细胞的分离培养与生物学研究

[目的]分离得到高纯度的小鼠睾丸支持细胞(Sertoli cell),用以研究它对精原干细胞(SSCs)生长的影响。[方法]取鼠龄3~7 d的雄性ICR小鼠睾丸,采用胶原酶、透明质酸酶、胰蛋白酶和DNA酶消化分离Sertoli细胞及SSCs,经多次差异离心贴壁及低渗处理法进行纯化,用Sertoli细胞作饲养层观察SSCs的生长情况。[结果]Sertoli细胞纯度达90%,且以Sertoli细胞作饲养层培养SSCs,与对照相比,能明显促进SSCs的增殖。[结论]四酶消化低渗处理法可获得高纯度的Sertoli细胞,且Sertoli细胞能明显促进SSCs的增殖。     

金钗石斛的离体快繁体系研究

[目的]研究金钗石斛的离体快繁体系。[方法]以金钗石斛的种子为材料,采用组培法进行离体培养。[结果]适宜于金钗石斛圆球茎诱导增殖及芽分化的培养基为:MS+1 mg/L BA+0.02 mg/L NAA+浓度2%马铃薯+浓度3%白糖,增殖系数为7～10。生根培养基为1/2MS+0.2 mg/L BA+0.2 mg/L NAA+0.2 mg/L GA+浓度2%香蕉+浓度2%马铃薯+浓度2%白糖;生根率达98%以上,移栽成活率在90%左右。[结论]该方法对金钗石斛的离体快繁体系进行了研究,为组培繁殖金钗石斛种苗提供了参考。     

新疆军垦细毛羊肾小管上皮细胞的原代培养及鉴定

[目的]建立一种高效、实用的新疆军垦细毛羊肾小管上皮细胞原代培养方案,为肾脏损伤引起的疾病研究奠定基础.[方法]取5～8个月大的出栏细毛羊肾脏皮质,剪成1～2 mm3大小组块,分别采用传统组织块法和改良组织块法,在含15;～ 20;新生小牛血清的DMEM的培养基中进行原代培养,无需研磨或使用酶和化学试剂,根据上皮细胞自身的生长特性,首次结合刮除法,相差消化法和差速贴壁法,分离纯化上皮细胞,再选用0.037 mm孔径网筛过滤除去肾小球上皮细胞,分离纯化培养肾小管上皮细胞,细胞免疫组化进行鉴定.[结果]改良方法与传统方法相比,细胞贴壁早,生长快,处理时间短,减少了污染机率,提高了细胞培养效率,分离培养的肾小管上皮细胞,纯度达90;以上,细胞呈多角形,鹅卵石状,折光性强,连接紧密,可传至第9代,免疫细胞化学(CK - 18)染色鉴定为阳性.[结论]改良的组织块培养与传统的组织块培养以及常用的酶消化培养相比,经济、简单、不易污染,分离培养的肾小管上皮细胞,活性高,纯度高,是一种高效、实用的细毛羊肾小管上皮细胞培养方法.     

铁皮石斛种子无菌萌发

[目的]研究铁皮石斛种子的无菌萌发方法。[方法]以改良MS+土豆熟汁液2.0%+蔗糖2.0%+琼脂0.65%+0.1 mg/L NAA为种子萌发培养基,将铁皮石斛种子播种后统计萌发率。[结果]铁皮石斛种子萌发率达90%以上,继代培养后组培苗生长正常。[结论]该研究建立了铁皮石斛种子的无菌萌发体系,为铁皮石斛实生苗的大批量生产奠定了基础。     

二色补血草的组织培养和离体快繁研究

[目的]为二色补血草的快速繁殖技术提供科学指导。[方法]以二色补血草的子叶与胚轴作为外植体,建立快速繁殖体系,研究不同激素浓度对诱导愈伤组织、不定芽以及生根率的影响。[结果]不同激素浓度的培养基均能使外植体不同程度地生成愈伤组织及不定芽;生根培养基中只有A、B、H、I组有不定根产生,其余组均无不定根产生。[结论]以子叶为外植体,愈伤组织和不定芽的最佳诱导培养基分别为：Ms＋O．7mg/L6-BA＋0.1mg/L NAA、MS＋0．5mg／L6-BA＋0．1mg／LNAA;以胚轴为外植体,愈伤组织和不定芽的最佳诱导培养基为：MS＋0．3mg／L6-BA＋0．5mg／LNAA。诱导不定根的最佳培养基为：MS0。     

青海茶卡盐湖中极端嗜盐碱真菌分离的研究

[目的]为了从青海茶卡盐湖中分离极端嗜盐碱真菌。[方法]采用平板涂布、划线分离法。[结果]分离得到可培养真菌2株、细菌5株、放线菌3株。2株真菌均在第8天达到最大生长量。同时,对2株真菌的嗜盐碱性进行了研究。[结论]CF12-1在15%盐度时能生长,为极端啫盐菌;CF12-2在12%和15%盐度时停止生长,为中度啫盐菌;CF12-1与CF12-2在pH 10时均能生长,为极端啫碱菌。     

不同营养液对3种观叶植物的水培效应

[目的]筛选出效果最佳、价格低廉的营养液配方。[方法]在传统组培配方的基础上,精减配制3种水培营养液。选择袖珍椰子、吊兰、吉祥草3种观叶植物,采用水培技术,观察比较3种水培营养液对3种观叶植物的生长影响。[结果]3种观叶植物在不同的营养液中生长情况不一样,每种观叶植物均有一种最适宜其生长的营养液。营养液C中的吉祥草、吊兰均生长良好;营养液A中的袖珍椰子生长良好,吊兰在营养液A中生长较差,吉祥草在营养液B中生长较差。[结论]在营养液浓度的适当范围内,含有矿质营养元素Fe螯合态的营养液较利于植物的吸收,有利于观叶植物的生长。     

接种方法对胭脂虫生长的影响

[目的]为胭脂虫的人工养殖提供一定的理论依据。[方法]以胭脂虫为供试昆虫,分别采用三角纸袋接种法、切片接种法、毛刷法和靠接法将其接种到仙人掌上进行悬挂培养,研究不同接种方法对其雌成虫数量、单体重和总重的影响。[结果]靠接法接种的仙人掌上胭脂虫数量最多,为223个,毛刷法接种的仙人掌上胭脂虫数量最少,为46个,三角纸袋法和切片接种法接种的仙人掌上胭脂虫数量分别为182和156个;4种接种方法接种的仙人掌上胭脂虫雌成虫的单体重分别为0.012、0.011、0.010、0.008g,总重分别为2.002、2.230、0.368、1.716g。[结论]胭脂虫人工养殖的最佳接种方法为靠接法。     

次氯酸钠防治组培苗污染的研究

[目的]探讨次氯酸钠对植物组培苗污染的防治效果。[方法]以马铃薯和切花菊组培苗为试验材料,在MS培养基中分别加入5、10、20、30和40 mg/L次氯酸钠,分析抑菌剂次氯酸钠对组培苗枯草杆菌污染的防治效果。[结果]经过2～3次转接后,5和10 mg/L次氯酸钠对马铃薯和切花菊组培苗的抑菌效果较好,该浓度处理组2种组培苗均未出现污染,且苗木生长较好,但随着浓度的升高次氯酸钠防治效果明显下降。综合分析认为,次氯酸钠浓度在5～10 mg/L之间是防治马铃薯和切花菊组培苗污染的适宜浓度,可达到消除污染目的,其中适宜的转接周期为5～6 d。[结论]该研究结果为利用次氯酸钠消除枯草杆菌、防治马铃薯及切花菊组培苗污染提供了试验依据。     

膜荚黄芪不定根组织培养的研究

[目的]建立黄芪不定根培养的无性繁殖体系。[方法]以膜荚黄芪无菌苗的胚根为外植体,诱导了不定根。将长约1 cm的不定根切段接种于4种培养基(B5、MS、LS和White)以筛选培养基。然后以B5为基本培养基附加不同浓度IBA(1~6 mg/L)、不同种类糖(蔗糖、葡萄糖、果糖和食用白糖)和不同浓度白糖(20~50 g),研究IBA浓度和糖的种类及浓度对黄芪不定根组织培养的影响。[结果]4种培养基中,B5培养基效果最好,切段可分化大量不定根,且生长良好。IBA浓度为2 mg/L时,黄芪不定根生长旺盛。在B5+IBA 2.0 mg/L培养基上,附加30 g/L蔗糖或白糖时不定根生长良好,白糖与蔗糖的效果差异不明显。[结论]在黄芪不定根规模化生产中可用白糖代替培养基中蔗糖,降低培养基成本。