DELLA家族蛋白研究进展

在已发现的植物GA信号传递分子中,有一类N端具有高度保守的DELLA结构域,称之为DELLA家族蛋白。介绍了DELLA蛋白的保守结构域和降解途径,并综述了其对多种植物激素信号的调控作用,以期提示植物生长发育和植物激素信号转导的奥秘。     

棉花GhRGL基因克隆及其原核表达研究

GA信号转导途径是通过DEUA蛋白来抑止的.通过对Genbank进行Blast比较,首次克隆了棉花DELLA蛋白基因,长度为1644bp,分离的棉花DELLA蛋白进行生物信息学分析显示,该蛋白具有与拟南芥中的DEUA蛋白一样的保守结构域,对克隆的基因进行原核表达研究,将克隆的基因转化原核表达载体pET22b,在E.coli BL21(DE3)菌株中成功表达了与标签蛋白融合的GhRGL蛋白,大小约为64kDa.首次实现了棉花DELLA蛋白基因在原核系统中的表达,为棉花DELLA蛋白的抗体制备及其表达定位研究奠定了基础.     

木薯赤霉素途径DELLA蛋白基因克隆及其对干旱胁迫的响应

赤霉素(GA)信号转导途径是通过DELLA抑制蛋白来调控的.笔者利用拟南芥DELLA蛋白基因序列,通过电子克隆方法首次克隆了1个木薯DELLA蛋白基因,长度为1 857 bp,具有完整的蛋白编码框的cDNA序列,命名为MeGAI.生物信息学分析显示,该蛋白具有与拟南芥DELLA蛋白一样的保守结构域,如DELLA结构域、VHYNP结构域、POLY(S/T)结构域、核定位信号、VHVID结构域、亮氨酸结构域、GRAS结构域;该基因在干旱胁迫下的表达模式研究结果表明,该基因在干旱胁迫下是下调表达的;GA生物合成重要基因GA20-氧化酶基因在干旱胁迫下的表达模式研究结果表明,两者在干旱胁迫下的表达模式具有良好的相关性,这说明GA途径可能参与木薯抗旱机制.     

葡萄全基因组DELLA蛋白基因家族鉴定及其应答外源赤霉素调控葡萄果实发育的特征

【目的】明确DELLA蛋白基因在葡萄基因组数据库中的数量、结构和组织表达差异,探究DELLA蛋白在葡萄赤霉素(GA)信号传导及葡萄无核果实发育机理中的作用机制。【方法】基于拟南芥、水稻等植物中的DELLA蛋白基因,利用HMMER程序和NCBI的CDD程序鉴定葡萄基因组中的DELLA蛋白基因;以‘白罗莎里奥’葡萄品种为试材,采用PCR技术克隆3个DELLA蛋白基因的c DNA全长序列;通过启动子作用元件分析预测其潜在功能;利用生物信息学软件对其染色体定位、基因结构、系统进化、理化特性、亚细胞定位及蛋白互作等进行分析;利用农杆菌介导的烟草瞬时表达技术分析DELLA蛋白的亚细胞定位情况;采用q RT-PCR方法检测葡萄DELLA蛋白基因应答GA在果皮、果肉、种子(或种子区)的时空表达特征。【结果】鉴定得到3个葡萄DELLA蛋白基因,克隆并验证其精确序列,分别命名为Vv GAI1(VIT_201s0011g05260)、Vv RGA(VIT_214s0006g00640)及Vv SLR1(VIT_211s0016g04630),其染色体定位、开放阅读框(ORF)大小、编码氨基酸数量分别为:Chr1、1 773 bp、590个;Chr14、1 710 bp、569个;Chr11、1 599 bp、532个。基因结构分析表明其DNA序列均无内含子,只有1个外显子,基因结构高度保守。进化分析显示Vv GAI1与Vv RGA亲缘关系较近,被聚类为一组,而Vv SLR1为另一组。3个基因的启动子均含有响应赤霉素和胚乳发育相关的作用元件,表明它们可能参与响应GA信号传导和胚乳发育过程。亚细胞定位结果显示3个DELLA蛋白均定位于细胞核。q RT-PCR结果显示除果皮中Vv SLR1在近成熟期具有表达高峰外,其余均在幼果期高表达,且外源GA处理均不同程度降低了3个DELLA蛋白基因在葡萄果皮、果肉和种子区的表达,尤以种子区下调水平最为显著。蛋白互作分析表明3个DELLA蛋白均为葡萄GA信号传导的核心作用元件,均可能与GIDI1和SLY1互作参与葡萄GA信号传导。【结论】葡萄基因组中含有3个DELLA蛋白基因家族成员;不同物种间DELLA蛋白结构高度保守;GA可能通过负调控这3个成员参与葡萄果皮、果肉和种子区的发育,且3个成员均可能通过应答GA信号调控葡萄无核果实的发育。     

棉花DELLA蛋白GhGAI4b基因的克隆及功能初步分析

[目的]DELLA蛋白已在不同的物种中被广泛鉴定,并且功能区高度保守,是GA信号通路中的负调控因子,在棉花纤维细胞起始和发育中起重要的作用.研究棉花中DELLA基因的功能.[方法]从棉花中克隆DELLA蛋白的同源基因GhGAI4b,构建35S:GhGAI4b植物过量表达载体,通过农杆菌侵染花序的方法转入野生型拟南芥中,观察转基因植株的表型.[结果]序列分析表明GhGAI4b全长开放阅读框1 617 bp,编码538个氨基酸,具有DELLA蛋白的典型结构域.采用Clustal X将GhGAI4b的氨基酸序列与其他已知的DELLA蛋白氨基酸序列进行相似性比对,发现GhGAI4b氨基酸序列与陆地棉、拟南芥的相似性较高,达到47;以上.转基因株系表现出叶片颜色深绿,叶片缩小且肥厚,叶片细长呈锯齿状;有些株系会出现多重莲座叶,雄蕊发育不全,晚花,株高变矮等赤霉素不敏感突变体的表型.[结论]过表达GhGAI4b能够抑制拟南芥莲座叶的生长和发育,影响转基因拟南芥花器官的发育,严重时引起转基因拟南芥的不育.     

核桃GAI基因的克隆和序列分析

DELLA蛋白是赤霉素信号传导通路中一类重要的负调节因子。利用RT-PCR技术以香玲核桃叶片为试材,克隆得到核桃DELLA蛋白基因JrGAI。对基因和编码蛋白序列进行分析,结果表明,JrGAI基因开放阅读框(ORF)为1 837 bp,编码612个氨基酸;生物信息学分析表明,JrGAI编码蛋白具有DELLA蛋白的典型结构域;利用BLASTx和DNAMAN软件进行相似性分析发现JrGAI编码蛋白氨基酸序列与其它植物的DELLA蛋白具有较高的同源性,其中与辽宁2号核桃同源性最高,达到99%。核桃JrGAI基因的克隆为其进一步研究应用奠定了基础。     

百脉根起始结瘤相关转录因子间相互作用的鉴定

以模式豆科植物百脉根为材料,利用酵母双杂交和双分子荧光互补（bimolecular fluorescence complementation ,BiFC）技术,研究调控起始结瘤基因表达的转录因子IPN2、NSP2、CYCLOPS、DELLA间的相互作用。结果显示,百脉根IPN2与DELLA、NSP2与DELLA、CYCLOPS与DELLA均有相互作用。表明IPN2、DELLA可能参与并形成一个大的蛋白复合物,网络调控豆科植物起始结瘤基因的时空表达。     

油松JAZ基因家族特征及其与DELLA蛋白互作的功能域鉴定

  目的  对油松JAZ基因家族特征及其与赤霉素负调控因子DELLA蛋白互作的功能域深入分析，旨在为解析针叶树以JAZ-DELLA为核心模块、茉莉酸（JA）-赤霉素（GA）介导的生长/防御平衡策略奠定基础。  方法  以油松全基因组数据为基础，筛选鉴定油松全部的JAZ家族基因成员，并分析其基本特征；构建多物种JAZ基因家族系统发育进化树，解析油松JAZ基因家族在系统进化过程中的特点；利用酵母双杂交技术，明确油松中JAZ与DELLA蛋白互作的功能域。  结果  油松中共鉴定得到53个JAZ基因家族成员，均具有TIFY和Jas保守结构，而且在degron序列中进化出了更丰富的变异。多个油松JAZ基因家族成员启动子区域包含响应JA和GA的顺式作用元件，并与模式植物中多个JAZ蛋白有着较近的进化距离。进一步实验发现，油松中5个JAZ蛋白（TIFY4、TIFY11、TIFY16、TIFY25、TIFY59）的Jas结构域与油松DPL（DELLA-like）蛋白存在相互作用，明确了油松中Jas结构域是JAZ蛋白与DELLA蛋白互作的功能域。  结论  明确了油松JAZ基因家族的基本序列特征，确定了油松中JAZ与DELLA蛋白互作的Jas功能域，为针叶树JAZ基因家族及JA-GA信号转导通路的深入研究提供了重要依据。      

海棠‘比利时垂枝’McRGL1a基因的克隆与分析

[目的]DELLA蛋白是赤霉素信号转导通路一类重要的调节因子,具有抑制植物生长的生理功能.本研究从海棠品种‘比利时垂枝’中分离得到一个海棠DELLA蛋白家族基因McRGL 1a,并对其基因进行生物信息学分析,为进一步研究McRGL 1a在调控植物株高的生物学功能奠定基础.[方法]通过RT-PCR技术获得McRGL 1a基因的cDNA.应用多种生物学工具分析其序列特征.[结果]序列分析表明,McRGL 1a的cDNA长度为1 920 bp,编码639个氨基酸;McRGL1a蛋白具有亲水性,主要定位于细胞质;海棠McRGL1a与苹果DELLA蛋白同源性极高,都具有DELLA、TVHYNP等典型结构;系统进化分析结果表明McRGL1a可能在植物株高调控过程中发挥重要功能.     

花生GAIP-B基因的生物信息学分析及表达研究

为研究DELLA蛋白在花生生长、育种过程中的功能,利用RT-PCR技术从花生栽培种品系花2014中克隆得到一个花生DELLA蛋白编码基因AhGAIP-B(GenBank登录号:XP_016191184)。序列分析结果表明,AhGAIP-B开放阅读框(ORF)全长1 812 bp,只有一个外显子,可编码603个氨基酸。生物信息学分析发现,AhGAIP-B编码的产物是一类典型DELLA蛋白,其三级结构与拟南芥GAI相似,亲缘关系与大豆GmGAI1最近。进一步qRT-PCR结果显示,AhGAIP-B基因呈组成型表达,其中在茎中表达量最高;同时,本研究还发现,外源GA_3可以诱导AhGAIP-B基因上调表达,其表达量在处理后12 h最高。本结果将为进一步的花生DELLA功能研究提供理论基础。     

‘辽宁2号’DELLA蛋白编码基因的克隆及表达分析

以‘辽宁2号’核桃的叶片为试材,通过同源克隆和RACE技术克隆DELLA家族蛋白的编码基因,并进行了同源性分析和氨基酸序列的多重比对;通过实时荧光定量PCR分析了该基因在‘辽宁2号’核桃中的组织特异性表达情况。主要研究结果如下:获得了DELLA蛋白编码基因的cDNA全长,命名为JrGAI(Genebank:JF766606),cDNA全长为2 361bp,包含1 842bp编码区序列,推测其编码的蛋白包含613个氨基酸,分子量为66.78kDa。同源性分析及氨基酸序列的多重比对结果表明该蛋白与其他物种的DELLA蛋白高度相似,并且具有完整的DELLA、TVHYN、VHIID、RVER和SAW等结构域;实时荧光定量PCR结果显示JrGAI基因在‘辽宁2号’核桃的叶芽、混合花芽、叶片、雄花、茎段和果实中普遍表达,并且在休眠期组织中具有较高的表达量,其中以休眠期的混合花芽中的表达量最高。     

紫花苜蓿MsGAI的克隆、表达及遗传转化

【目的】 DELLA蛋白属于GRAS家族,是赤霉素信号转导途径中重要的转录因子,负向调节GA转导途径。克隆获得紫花苜蓿GAI,分析其基因生物信息学特征并预测蛋白结构域。明确紫花苜蓿GAI组织表达特征及不同处理下的表达模式,构建该基因超表达载体并转入紫花苜蓿,以探究DELLA蛋白基因在紫花苜蓿赤霉素（GA）信号转导途径及胁迫条件下的作用机理。【方法】 利用同源克隆的方法,从紫花苜蓿中克隆得到MsGAI。利用生物信息学方法分析该基因的序列特征,使用MEGA7.0对MsGAI蛋白序列及同源序列进行多序列比对,构建同源物种间的系统发育树。利用实时荧光定量PCR检测紫花苜蓿各组织GAI表达量以及在PEG、NaCl、GA、ABA和黑暗处理下,GAI的表达变化。同时对转基因GAI株系表达水平进行分析,选择表达量高、中、低株系（L5、L8、L11）分别进行PEG和NaCl处理,分析GAI的表达变化。以pBI121为基础载体,采用双酶切-连接的方法构建植物超表达载体35S:MsGAI-gus。将重组载体转入农杆菌GV3101菌株中,以紫花苜蓿叶片为外植体,采用农杆菌介导的愈伤组织转化法转化紫花苜蓿,经PCR检测和GUS组织化学染色,得到转基因阳性苗。【结果】 该基因序列包含有一个1 818 bp的开放阅读框,编码605个氨基酸。生物信息学分析结果显示,MsGAI蛋白具有GRAS家族的典型结构域和保守区,其中包含N端保守结构域DELLA和TVHYNP,C端保守结构域SAW。多序列比对及系统进化树分析表明,该序列与其他物种的DELLA蛋白序列相似度均高达80%以上,将其命名为MsGAI。该基因与蒺藜苜蓿GAI亲缘关系最近,其次与鹰嘴豆、红三叶等双子叶豆科植物亲缘关系较近,与大麦等单子叶植物较远。实时荧光定量PCR分析表明,MsGAI在紫花苜蓿各组织中均有表达,根中的表达量最高。经PEG、NaCl、GA以及ABA处理后,均有明显响应;黑暗处理显著抑制MsGAI的表达。转基因株系经PEG、NaCl处理后,GAI表达量均上调。对构建完善的35S:MsGAI-gus植物超表达载体进行双酶切检测,琼脂糖凝胶电泳显示,条带大小与预期一致。对转基因植株进行GUS组织染色验证,结果表明,阳性植株呈现蓝色,对照组为白色。对超表达载体携带的MsGAI和GUS序列进行PCR检测均呈阳性。【结论】 紫花苜蓿DELLA蛋白基因的克隆和超表达载体构建成功,MsGAI对逆境胁迫有响应。     

苹果MdRGL1a基因对烟草遗传转化研究

植物DELLA蛋白是赤霉素信号传导途径的反向调节因子,DELLA蛋白突变体导致植株矮化。苹果MdRGL1a是编码苹果DELLA蛋白家族的基因之一,为了研究该基因的生理功能,用从‘威赛克’苹果中克隆的MdRGL1a基因,分别构建GFP瞬时表达载体和植物表达载体。通过基因枪法轰击洋葱表皮细胞,激光共聚焦显微镜下观察MdRGL1a基因的亚细胞定位。利用农杆菌EHA105介导的叶盘法转化烟草(Nicotianna tabacumL.),对转基因烟草进行PCR扩增和GUS染色法检测,观察转基因烟草的形态学性状,利用ELISA方法测定烟草的内源激素水平。结果表明,MdRGL1a-GFP融合蛋白定位在细胞核内。转MdRGL1a基因的烟草组培苗根短粗、根系小,田间生长表现为植株矮化,75%转基因烟草提早开花。50%以上转基因植株的內源生长素和细胞分裂素水平显著低于对照非转基因烟草,而內源ABA水平显著高于对照。过量表达MdRGL1a导致转基因烟草植株的矮化和花期改变与內源激素生长素、细胞分裂素水平降低和ABA水平提高相关。     

苹果砧木‘SH6’中RGLs基因的克隆及生物信息学分析

【目的】从苹果砧木‘SH6’中分离出三个DELLA家族基因RGL1b,RGL2a,RGL2b,为探究苹果DELLA蛋白家族对植株生长发育的调控机理,对这三个基因进行了生物信息学分析。【方法】通过克隆技术从苹果砧木‘SH6’中分离得到RGL1b,RGL2a,RGL2b的编码序列,利用生物学工具分析其序列特征,采用实时荧光定量PCR方法分析其基因表达水平。【结果】序列分析表明,苹果砧木‘SH6’的3种RGLs序列具有较高相似性,均存在DELLA蛋白和GRAS家族的结构特征。但序列也存在部分差异,预测其编码的蛋白都具有亲水性能,RGL1b,RGL2a蛋白大部分定位在细胞质,而RGL2b主要分布在细胞核。用实时荧光定量PCR方法,检测了‘SH6’及其亲本‘国光’中这3种RGLs基因的相对表达水平,结果显示,RGL1b,RGL2a,RGL2b在‘SH6’中的表达量均明显高于‘国光’中的表达。【结论】苹果砧木‘SH6’中RGL1b,RGL2a,RGL2b基因可能在果树矮化中发挥重要作用。     

蚕豆VfGASA1基因的异源过表达延迟拟南芥开花

GASA(Gibberellic acid-stimulated in Arabidopsis)蛋白是一类受赤霉素调控的小分子蛋白质,参与植物生长发育的多条途径.本研究在蚕豆(Vicia faba)中同源克隆了VfGASA1基因,该基因的开放阅读框全长为363 bp,编码1个包含120个氨基酸残基的蛋白质,VfGASA1在蚕豆叶片和嫩荚中高表达,亚细胞定位结果显示,VfGASA1是一个定位于质外体的分泌蛋白.异源过表达VfGASA1导致转基因拟南芥开花延迟、莲座叶数量增多,外施赤霉素能够恢复这一现象.实时荧光定量结果显示,转基因拟南芥植株中FT基因显著下调,而DELLA基因中的GAI基因显著上调,说明VfGASA1可能是通过间接抑制DELLA蛋白的表达从而调控植物开花.本研究结果为蚕豆的开花调控育种提供了理论依据.     

核桃JrGRAS基因家族鉴定与响应低温胁迫基因筛选

为深入解析核桃GRAS基因家族在低温胁迫中的生物学功能,本研究根据生物信息学模型搜索核桃基因组中GRAS基因,采用ExPASy、MEME、GSDS、MEGA6.0、String和Plantcare等软件分析该家族成员理化性质、基因结构、保守基序、进化关系、启动子区域结合位点及蛋白功能互作等,分析GRAS基因家族在低温胁迫下表达模式。聚类分析发现,据拟南芥分类将核桃GRAS基因家族分为9个亚族,分别为HAM、DELLA、SCR、SCL、LISCL、LS、SHR、PAT1和NEWCLASS;每个成员蛋白磷酸化和糖基化的位点和数目各异,均存在丰富的激素信号和胁迫应答调控元件;蛋白互作预测发现JrGRAS和其他响应非生物胁迫蛋白可以发生互作。在低温胁迫48 h后经转录表达分析,JrGRAS8、JrGRAS14、JrGRAS15、JrGRAS20、JrGRAS33、JrGRAS39、JrGRAS41、JrGRAS48、JrGRAS49、JrGRAS51、JrGRAS59、JrGRAS63为差异表达基因,推测可能响应低温胁迫。本研究结果将为深入研究核桃GRAS基因功能奠定基础。     

短枝型苹果MdRGL基因的克隆及原核表达分析

【目的】克隆短枝型苹果（Malus domestica Borkh.）的MdRGL基因,并对其进行生物信息学分析,构建该基因的原核表达载体,在大肠杆菌中诱导表达融合蛋白,为明确短枝型苹果MdRGL基因与短枝芽变特性之间的关系奠定基础。【方法】采用同源克隆法,以短枝型苹果叶片总RNA为模板,通过RT-PCR获得短枝型苹果MdRGL的cDNA片段,T/A克隆后进行序列测定。将克隆到的短枝型苹果MdRGL克隆到表达载体pGEX-4T-1上,构建融合表达载体pGEX-4T-MdRGL,转化到大肠杆菌BL21（DE3）并诱导表达。【结果】从短枝型苹果中克隆到5条MdRGL基因：MdRGL1a/b、MdRGL2a/b和MdRGL3b。序列分析表明,除MdRGL3b外,另外4条序列都具有DELLA和VHYNP结构域。利用所构建的原核表达载体,经IPTG诱导和SDS-PAGE电泳检测结果表明,表达蛋白与预期蛋白大小一致。【结论】短枝型苹果中DELLA蛋白的克隆和原核表达的成功,为进一步纯化和鉴定目的蛋白及研究其功能奠定了试验基础。     

5种苹果属植物GAI基因的克隆及生物信息学分析

【目的】研究DELLA家族的成员GAI在调控植物株型形成方面的生物学功能。【方法】从5种苹果属植物(‘国光’、‘武乡海棠’、‘SH6’、‘比利时垂枝’、‘比利时直立’)中分离得到GAI基因,应用多种生物学工具分析其序列特征。【结果】序列分析表明,GAI的CDS序列长度为1 875bp,编码624个氨基酸;GAI的基因组序列长度与其对应CDS序列长度相同;GAI蛋白具有亲水性,主要定位于细胞质;5种苹果属植物的GAI序列相似性极高,都具有DELLA家族和GRAS家族特有的典型结构。【结论】试验结果暗示这5种苹果属GAI基因可能在苹果株型形成方面发挥重要功能。     

前沿动态

<正>植物激素ABA和GA拮抗新机制脱落酸(ABA)是一种应激反应植物激素,它通过抑制种子萌芽及幼苗生长来适应不利的环境条件。前人研究发现,GA和ABA对立地调控植物的许多发育过程及植物对生物或非生物胁迫的响应。ABA通过拮抗GA依赖的DELLA蛋白的降解过程来抑制GA信号途径,但GA如     

针叶树G ID1同源基因分离鉴定与功能预测

GID1作为赤霉素(GA)受体蛋白,是GA信号通路的重要组成部分,其编码基因GID1在被子植物中已经被广泛克隆,但在针叶树种中的研究十分滞后。为了分离针叶树GA受体GID1基因并推测其功能,本研究以拟南芥GID1s序列为探针,在油松高质量参考转录组内筛选并鉴别出了油松GID1直系同源基因;基于该基因序列同源克隆了樟子松、白皮松、赤松GID1基因,通过BLAST获得了日本落叶松、火炬松、白云杉与挪威云杉的GID1-like基因;对针叶树GID1基因进行序列保守性、蛋白结构和组织表达活性分析。结果表明:针叶树种很可能只含有一个GID1基因,该基因在针叶树中具有很高的保守性;虽然与被子植物GID1之间的序列一致性较低,但其保持GA亲和活性所必需的氨基酸残基十分保守,与其下游DELLA蛋白相互作用的功能域与结构同样十分保守,推测其在针叶树GA信号转导中具有受体功能;表达分析显示GID1在挪威云杉不同组织和油松雌雄球花不同发育阶段间表达较为稳定,表明GID1可能广泛参与这些组织的发育过程,针叶树GA信号调控通路中GA受体的转录调控可能并不是核心调控机制。研究结果为GID1基因在针叶树生长发育过程中的分子调控机制研究奠定了基础。