海棠‘比利时垂枝’McRGL1a基因的克隆与分析

[目的]DELLA蛋白是赤霉素信号转导通路一类重要的调节因子,具有抑制植物生长的生理功能.本研究从海棠品种‘比利时垂枝’中分离得到一个海棠DELLA蛋白家族基因McRGL 1a,并对其基因进行生物信息学分析,为进一步研究McRGL 1a在调控植物株高的生物学功能奠定基础.[方法]通过RT-PCR技术获得McRGL 1a基因的cDNA.应用多种生物学工具分析其序列特征.[结果]序列分析表明,McRGL 1a的cDNA长度为1 920 bp,编码639个氨基酸;McRGL1a蛋白具有亲水性,主要定位于细胞质;海棠McRGL1a与苹果DELLA蛋白同源性极高,都具有DELLA、TVHYNP等典型结构;系统进化分析结果表明McRGL1a可能在植物株高调控过程中发挥重要功能.     

苹果砧木‘SH6’中RGLs基因的克隆及生物信息学分析

【目的】从苹果砧木‘SH6’中分离出三个DELLA家族基因RGL1b,RGL2a,RGL2b,为探究苹果DELLA蛋白家族对植株生长发育的调控机理,对这三个基因进行了生物信息学分析。【方法】通过克隆技术从苹果砧木‘SH6’中分离得到RGL1b,RGL2a,RGL2b的编码序列,利用生物学工具分析其序列特征,采用实时荧光定量PCR方法分析其基因表达水平。【结果】序列分析表明,苹果砧木‘SH6’的3种RGLs序列具有较高相似性,均存在DELLA蛋白和GRAS家族的结构特征。但序列也存在部分差异,预测其编码的蛋白都具有亲水性能,RGL1b,RGL2a蛋白大部分定位在细胞质,而RGL2b主要分布在细胞核。用实时荧光定量PCR方法,检测了‘SH6’及其亲本‘国光’中这3种RGLs基因的相对表达水平,结果显示,RGL1b,RGL2a,RGL2b在‘SH6’中的表达量均明显高于‘国光’中的表达。【结论】苹果砧木‘SH6’中RGL1b,RGL2a,RGL2b基因可能在果树矮化中发挥重要作用。     

4种苹果属植物线粒体基因组的组装与比较分析

【目的】深入了解苹果属不同品种线粒体基因组之间的差异,并阐明其物种特异性。【方法】通过3代测序技术对4种苹果属植物进行测序,得到基因组原始数据,进而提取出线粒体基因组数据。通过生物信息技术手段进行组装和注释,分别从基因组组成和结构特征进行多方面比较分析。【结果】组装出了‘富士’、‘SH6’、‘火焰’、‘王族’4个品种的线粒体基因组,并且注释了其基因结构。另外对线粒体基因组的特征、重复序列、ORFs以及系统发育方面进行对比分析。【结论】苹果属线粒体基因组组装结果均在400 kb左右,并且在已经组装出的线粒体基因组中‘SH6’线粒体基因组最大。通过线粒体基因组特征比较发现,‘富士’的蛋白质编码基因区域最大并且注释到的基因最多。另外在‘火焰’中预测到的分散重复序列和简单重复序列数量最多,但是其中预测到的ORFs数量最少。4个供试品种与已发表的4个种或品种相比,其线粒体基因组大小、蛋白质编码基因区域具有特异性,且进化关系不同,为苹果属植物进化及新种质创制提供了理论依据。     

葡萄全基因组DELLA蛋白基因家族鉴定及其应答外源赤霉素调控葡萄果实发育的特征

【目的】明确DELLA蛋白基因在葡萄基因组数据库中的数量、结构和组织表达差异,探究DELLA蛋白在葡萄赤霉素(GA)信号传导及葡萄无核果实发育机理中的作用机制。【方法】基于拟南芥、水稻等植物中的DELLA蛋白基因,利用HMMER程序和NCBI的CDD程序鉴定葡萄基因组中的DELLA蛋白基因;以‘白罗莎里奥’葡萄品种为试材,采用PCR技术克隆3个DELLA蛋白基因的c DNA全长序列;通过启动子作用元件分析预测其潜在功能;利用生物信息学软件对其染色体定位、基因结构、系统进化、理化特性、亚细胞定位及蛋白互作等进行分析;利用农杆菌介导的烟草瞬时表达技术分析DELLA蛋白的亚细胞定位情况;采用q RT-PCR方法检测葡萄DELLA蛋白基因应答GA在果皮、果肉、种子(或种子区)的时空表达特征。【结果】鉴定得到3个葡萄DELLA蛋白基因,克隆并验证其精确序列,分别命名为Vv GAI1(VIT_201s0011g05260)、Vv RGA(VIT_214s0006g00640)及Vv SLR1(VIT_211s0016g04630),其染色体定位、开放阅读框(ORF)大小、编码氨基酸数量分别为:Chr1、1 773 bp、590个;Chr14、1 710 bp、569个;Chr11、1 599 bp、532个。基因结构分析表明其DNA序列均无内含子,只有1个外显子,基因结构高度保守。进化分析显示Vv GAI1与Vv RGA亲缘关系较近,被聚类为一组,而Vv SLR1为另一组。3个基因的启动子均含有响应赤霉素和胚乳发育相关的作用元件,表明它们可能参与响应GA信号传导和胚乳发育过程。亚细胞定位结果显示3个DELLA蛋白均定位于细胞核。q RT-PCR结果显示除果皮中Vv SLR1在近成熟期具有表达高峰外,其余均在幼果期高表达,且外源GA处理均不同程度降低了3个DELLA蛋白基因在葡萄果皮、果肉和种子区的表达,尤以种子区下调水平最为显著。蛋白互作分析表明3个DELLA蛋白均为葡萄GA信号传导的核心作用元件,均可能与GIDI1和SLY1互作参与葡萄GA信号传导。【结论】葡萄基因组中含有3个DELLA蛋白基因家族成员;不同物种间DELLA蛋白结构高度保守;GA可能通过负调控这3个成员参与葡萄果皮、果肉和种子区的发育,且3个成员均可能通过应答GA信号调控葡萄无核果实的发育。     

"SH6"苹果矮化中间砧SnRK2基因的克隆及生物信息学分析

[目的]研究SnRK2基因在调控非生物胁迫方面的生物学功能.[方法]从苹果矮化中间砧"SH6"中分离得到3种SnRK2基因,运用多种生物学工具分析其序列特征.[结果]序列分析表明,SnRK2的CDS序列长度:SnRK2.6为956 bp,SnRK2.7为1013 bp,SnRK2.8为1072 bp,分别编码318、337和357个氨基酸的蛋白质;SnRK2蛋白无明显的疏水性,主要定位于细胞质;3种SnRK2序列相似性较高,都具有PKc_like超级家族和S_TKc家族特有的结构.[结论]这3种SnRK2基因可能在苹果非生物胁迫方面发挥重要作用.     

‘金冠’苹果PP2C基因克隆及低温胁迫下的表达

【目的】为了鉴定并探究苹果MdPP2C基因对低温胁迫的响应机制。【方法】利用基因克隆技术，从苹果‘金冠’cDNA中克隆得到3个苹果MdPP2C基因，利用生物信息学技术对3个基因的理化性质、系统进化及保守基序等进行分析，并采用real time-qPCR技术检测其在4℃低温处理下的表达情况。【结果】序列分析结果表明，克隆得到的MdHAB1、MdHAI2和MdAHG3分别编码544、405和432个氨基酸，其预测的表观相对分子质量分别为58.26 kDa、44.29 kDa和45.80 kDa,理论等电点分别为5.03、6.63和5.01,均属于酸性蛋白；3个蛋白均属于不稳定蛋白和亲水蛋白，3个蛋白均无跨膜结构，主要定位于细胞核和叶绿体，且3个基因编码的氨基酸序列均具有PP2C超家族保守结构域；real time-qPCR结果表明，低温处理后，MdHAB1、MdHAI2和MdAHG3转录水平均呈现持续上调的趋势。【结论】从‘金冠’中克隆的3个PP2C家族基因均参与苹果‘金冠’对低温胁迫的响应，以上结果为探究苹果PP2C家族基因在苹果属植物对低温胁迫的响应过程及调控机制提供理论基础，为使用分...     

葡萄铁蛋白基因Ferritin的鉴定、克隆及其在果实发育不同时期对氨基酸铁复合肥喷施的响应

【目的】铁蛋白Ferritin在植物生长发育过程中发挥重要作用，其在果树中的生物学功能尚未见报道。克隆葡萄Ferritin家族基因并揭示其在果实发育不同时期的表达模式及其对叶面喷施氨基酸-铁（Fe）复合肥处理的响应差异，可为研究果树铁素营养与代谢的分子机制提供理论依据。【方法】通过同源克隆法从‘马瑟兰’中克隆Ferritin家族基因，利用生物信息学手段分析葡萄Ferritin及其编码蛋白的详细特征；设置叶面喷施氨基酸-Fe复合肥处理，利用荧光实时定量PCR技术分析Ferritin在葡萄果实发育不同时期的表达特征及其对叶面喷施处理的差异响应。【结果】在葡萄基因组中检索并克隆获得4个Ferritin家族基因，命名为VvFer1—VvFer4，分布于第6、8和13号三条染色体上，均含有7个长度不一的内含子，且主要定位于叶绿体和细胞核。本文所选16种植物Ferritin蛋白序列的一致性高达61.48%，系统发育树分析表明同一属的Ferritin同源蛋白如十字花科的拟南芥和芜菁，茄科的烟草和马铃薯，豆科的大豆、落花生和鹰嘴豆，大戟科的橡胶树、木薯和蓖麻，蔷薇科的苹果、桃和草莓，遗传进化关系较近，...     

‘合作猪’TDRP1基因的克隆及生物信息学分析

【目的】丰富猪TDRP1基因研究的基础数据.【方法】以猪NM_001198925序列为参考,设计特异性引物,通过克隆测序获得‘合作猪’TDRP1基因完整CDS序列,并进行生物信息学分析,同时采用实时荧光定量PCR方法检测TDRP1基因在不同组织中的表达特性.【结果】获得了TDRP1基因完整的CDS序列(GenBank登录号:KU743254),共684bp,其编码186个氨基酸多肽.与参考序列相比,在编码区第33、348位点处发生了同义突变(C→G、C→T).TDRP1基因分子式为C_(897)H_(1421)N_(259)O_(287)S_2,理论等电点(PI)为5.86,不稳定系数为62.66,疏水指数为64.03,平均亲水性为-0.939,属不稳定可溶性酸性蛋白质.二级结构以无规则卷曲和α-螺旋为主,属混合类蛋白质.亚细胞定位结果显示,TDRP1编码的蛋白质在遗传物质复制和转录、翻译过程中发挥功能的可能性分别为26.3%、14.3%,明显高于发挥其它功能的可能性.mRNA表达分析表明,TDRP1基因在垂体和睾丸中高表达,肺、肾、小脑、卵巢中度表达,肝、脾、大脑、胃、小肠中低表达,心脏组织中不表达.【结论】成功克隆了‘合作猪’TDRP1基因的完整CDS区序列,并发现了2个SNP位点;多组织转录表达分析表明TDRP1在垂体和睾丸中表达较高,可为深入研究TDRP1基因的功能提供参考.     

苹果属S-RNase基因的进化研究

【目的】通过分析苹果属植物自交不亲合性位点S-RNase基因的序列,研究S-RNase基因在苹果属的进化历史,序列分歧特点和遗传多态性。【方法】利用栽培苹果的S-RNase基因序列在GenBank数据库中检索和鉴定所有已知的苹果属植物的S-RNase基因,同时利用S-RNase基因的保守引物获得陇东海棠和变叶海棠的S-RNase基因序列。通过系统发育分析研究S-RNase基因的进化历史,进而计算dN/dS比值揭示S-RNase基因序列分歧的特点,最后估计并比较苹果属不同类群S-RNase基因的遗传多态性及其遗传分化。【结果】苹果属植物的S-RNase基因可以分为16个亚类,同一亚类S-RNase基因的序列分歧较小,亚类之间的分歧很大。S-RNase基因的成对dN/dS比值中有50%的大于1,并且滑动窗分析显示S-RNase基因具有多个dN/dS比值显著大于1的区域。栽培苹果和野生苹果在S-RNase基因的遗传多态性上没有明显差异。在所涉及的苹果属野生类群中,栽培苹果与塞威士苹果在S-RNase基因上的遗传分化最小。【结论】适应性氨基酸替换在苹果属植物S-RNase基因的序列分歧上发挥了重要作用。现有的S-RNase基因数据显示栽培驯化没有导致栽培苹果S-RNase基因遗传多态性的降低,基于S-RNase基因的遗传分化支持栽培苹果是由塞威士苹果驯化而来的观点。     

葡萄VviSEP2基因的克隆及表达分析

【目的】克隆葡萄VviSEP2基因的完整开放阅读框(ORF)序列,明确其与胚珠败育型无核葡萄胚珠败育的关系。【方法】通过RT-PCR技术在‘无核白’葡萄中克隆葡萄VviSEP2基因的完整ORF序列,并对该序列及其编码产物进行生物信息学分析,采用半定量RT-PCR和实时荧光定量PCR技术分析VviSEP2的表达模式。【结果】克隆得到一个无核葡萄胚珠发育相关基因,该基因cDNA序列长度为1 132bp,ORF为741bp,编码246个氨基酸。氨基酸多序列比对和进化树分析确认,该基因是E类MADS-box基因家族成员,命名为VviSEP2。表达分析结果表明,VviSEP2只在花蕾、花和胚珠中有表达,而在根、茎、叶中无表达,并且该基因在有核葡萄‘黑比诺’花与花蕾中的相对表达水平明显高于无核葡萄‘无核白’,同时VviSEP2基因在‘黑比诺’胚珠发育各时期的相对表达水平均高于‘无核白’,为后者的3~5倍。【结论】VviSEP2基因与无核葡萄的胚败育可能存在一定关系。     

短枝型苹果MdRGL基因的克隆及原核表达分析

【目的】克隆短枝型苹果（Malus domestica Borkh.）的MdRGL基因,并对其进行生物信息学分析,构建该基因的原核表达载体,在大肠杆菌中诱导表达融合蛋白,为明确短枝型苹果MdRGL基因与短枝芽变特性之间的关系奠定基础。【方法】采用同源克隆法,以短枝型苹果叶片总RNA为模板,通过RT-PCR获得短枝型苹果MdRGL的cDNA片段,T/A克隆后进行序列测定。将克隆到的短枝型苹果MdRGL克隆到表达载体pGEX-4T-1上,构建融合表达载体pGEX-4T-MdRGL,转化到大肠杆菌BL21（DE3）并诱导表达。【结果】从短枝型苹果中克隆到5条MdRGL基因：MdRGL1a/b、MdRGL2a/b和MdRGL3b。序列分析表明,除MdRGL3b外,另外4条序列都具有DELLA和VHYNP结构域。利用所构建的原核表达载体,经IPTG诱导和SDS-PAGE电泳检测结果表明,表达蛋白与预期蛋白大小一致。【结论】短枝型苹果中DELLA蛋白的克隆和原核表达的成功,为进一步纯化和鉴定目的蛋白及研究其功能奠定了试验基础。     

利用PAGE鉴定石榴种质资源的研究

[目的]通过对5个石榴品种的蛋白质的聚丙烯酰胺凝胶电泳(Polyacrylamide gel electrophoresis,PAGE)分析,为石榴种质资源的鉴定提供科学依据。[方法]以5个石榴品种(大红袍、冰糖籽、大青皮、软籽石榴、谢花甜)为试验材料,分别提取其总蛋白、盐溶蛋白、水溶蛋白,并进行PAGE电泳检测。[结果]蛋白质的PAGE电泳具有条带的多样性,不仅能很好的鉴定区分不同品种,还能通过相似度指数进行聚类分析,探究品种间的亲缘关系。石榴的总蛋白与盐溶蛋白电泳分析结果基本一致,大青皮与谢花甜,软籽石榴与冰糖籽亲缘关系较近;其水溶蛋白聚类分析中,5个品种间无明显分组聚合现象。[结论]该研究结果表明PAGE技术能较好的揭示品种间的遗传变异,可用于分析石榴种质的遗传多样性和亲缘关系,其结果为石榴种质资源的保存和良种培育提供了科学依据。     

木薯赤霉素途径DELLA蛋白基因克隆及其对干旱胁迫的响应

赤霉素(GA)信号转导途径是通过DELLA抑制蛋白来调控的.笔者利用拟南芥DELLA蛋白基因序列,通过电子克隆方法首次克隆了1个木薯DELLA蛋白基因,长度为1 857 bp,具有完整的蛋白编码框的cDNA序列,命名为MeGAI.生物信息学分析显示,该蛋白具有与拟南芥DELLA蛋白一样的保守结构域,如DELLA结构域、VHYNP结构域、POLY(S/T)结构域、核定位信号、VHVID结构域、亮氨酸结构域、GRAS结构域;该基因在干旱胁迫下的表达模式研究结果表明,该基因在干旱胁迫下是下调表达的;GA生物合成重要基因GA20-氧化酶基因在干旱胁迫下的表达模式研究结果表明,两者在干旱胁迫下的表达模式具有良好的相关性,这说明GA途径可能参与木薯抗旱机制.     

苹果山梨醇转运子cDNA的克隆及其序列分析

[目的]为进一步研究糖运输蛋白的功能、作用机理奠定基础。[方法]以嘎啦苹果叶片总RNA为模板,根据报道的山梨醇转运子的保守区设计引物,对山梨醇转运子cDNA片段的PCR扩增,PCR产物的克隆和测序和序列分析。[结果]经RT-PCR获得一条长度为581bp的片段,回收并进行测序,该片断编码181个氨基酸。应用B lastn和B lastx软件,通过与GenBank蛋白数据库比对分析发现其蛋白序列与MdSOT4、MdSOT6、MDSOT1 3种苹果(Malusx domestica)同源性分别为95%、92%、92%;酸樱桃(Prunus cerasus)78%;大豆(Glycinemax)77%;应用SMART软件分析,含有4个AgrB结构域,为一种跨膜蛋白结构。[结论]克隆得到的片段确定为苹果山梨醇转运子基因。     

观赏海棠不同品种MYB10启动子结构分析

[目的]观赏海棠叶片色泽类型多样,为了研究McMYB10基因对不同叶色观赏海棠品种呈色的影响.[方法]利用PCR克隆的方法,从两个极端叶色观赏海棠品种中克隆得到两个McMYB10启动子,同时对这两个启动子在5个不同叶色类型的观赏海棠分布进行检测.[结果]McMYB10启动子在不同观赏海棠品种中存在两种不同的类型,即R1型和R6型;在McMYB10启动子中存在逆境、激素、光等多种顺式作用元件,同时在变色类观赏海棠品种中,R1和R6型启动子都存在.[结论]R1和R6型启动子在不同叶色的观赏海棠品种中,可能对叶片的呈色起较为重要的作用.     

干旱对苹果属植物叶绿素荧光参数的影响

[目的]研究干旱对苹果属植物砧木荧光参数的影响。[方法]以1年生抗旱能力较强的八棱海棠和抗旱性较弱的平邑甜茶实生幼苗为试验材料,采用营养液水培法培养幼苗,用20%聚乙二醇(PEG6000)模拟干旱胁迫,对这2种幼苗根系进行处理。[结果]在干旱胁迫下,2个苹果属植物品种叶绿素荧光动力学曲线发生了明显变化,随着干旱胁迫时间的延长,八棱海棠和平邑甜茶的Yield、ETR、Fv/Fm、qP均下降,且随着水分胁迫的加强,降低越明显,F0上升,qN先上升后下降,但八棱海棠F0上升幅度比平邑甜茶小,而qN上升幅度比平邑甜茶大,说明八棱海棠PSⅡ抵御干旱的能力比平邑甜茶强。[结论]干旱胁迫不仅直接引发苹果属植物光合结构的变化,而且也影响光合电子的传递。     

8个云南主要栽培梨品种亲缘关系的ISSR分析

[目的]探索利用简单序列重复间区（ISSR）分子标记研究供试栽培梨品种的分类和系统发育。[方法]利用ISSR分子标记技术对8种云南主要栽培梨品种的亲缘关系进行分析。[结果]ISSR—PCR反应体系优化结果表明,20μl ISSR．PCR反应体系中各因素的最佳浓度分别为：1×PCR buffer、100μmol／L dNTP、0．3μmol／L引物、20ng的模板DNA和1．5U Taq DNA聚合酶,并在此基础上建立了梨ISSR—PCR反应体系。从24个引物中筛选出9个能扩增出清晰带并具多态性的引物,共扩增出了135条DNA片段,其中102个DNA片段呈现多态性,占总扩增片段的75．5％。利用NTSYS—pc2．10t软件计算8种梨品种间的Jaccard遗传相似系数。结果显示梨品种间的相似性系数为0．186～0．750,平均遗传相似性系数为0．476。UPGMA聚类分析表明,8种梨品种可以聚为2类：第一类群包括日本水晶梨、早95-2、四川火把和西子绿;第二类群由早酥、金花、旱黄酥和砀山梨4个品种组成,这与传统分类结果一致。[结论]该研究为梨资源的开发利用及新品种的选育提供科学依据。     

棉花GhRGL基因克隆及其原核表达研究

GA信号转导途径是通过DEUA蛋白来抑止的.通过对Genbank进行Blast比较,首次克隆了棉花DELLA蛋白基因,长度为1644bp,分离的棉花DELLA蛋白进行生物信息学分析显示,该蛋白具有与拟南芥中的DEUA蛋白一样的保守结构域,对克隆的基因进行原核表达研究,将克隆的基因转化原核表达载体pET22b,在E.coli BL21(DE3)菌株中成功表达了与标签蛋白融合的GhRGL蛋白,大小约为64kDa.首次实现了棉花DELLA蛋白基因在原核系统中的表达,为棉花DELLA蛋白的抗体制备及其表达定位研究奠定了基础.     

长果桑与桑树栽培品种远缘杂交F1代的植物学性状表现分析

[目的]分析长果桑与桑树栽培品种远缘杂交F_1代的植物学性状表现,为桑树远缘杂交的亲本选择提供参考。[方法]按照长果桑×桑树栽培品种和桑树栽培品种×长果桑2种远缘杂交类型配置杂交组合,每种杂交类型配置5个杂交组合,授粉、采种、育苗后栽植,调查叶片、枝条的主要植物学性状表现。[结果]在长果桑×桑树栽培品种和桑树栽培品种×长果桑2种远缘杂交类型中,各组合亲本均无椭圆形叶,F_1代均有椭圆形叶植株,平均比例分别为13.28%和10.48%;亲本无短尾叶尖的杂交组合,F_1代出现短尾叶尖植株的平均比例分别为29.88%和24.94%;亲本无钝头叶尖的杂交组合,F_1代出现钝头叶尖植株的平均比例分别为14.16%和11.86%。亲本无弯曲枝条的杂交组合,F_1代出现弯曲枝条植株的平均比例分别为26.83%和32.66%;亲本无折曲节间的杂交组合,F_1代出现折曲节间植株的平均比例分别为23.72%和18.28%。[结论]长果桑与桑树栽培品种远缘杂交F_1代的植物学性状表现丰富,出现了很多亲本中没有的性状,可以从中选择符合需要的植株开展材料创新和品种选育。     

枇杷核基因组DNA提取方法的改良及其SSR分析

[目的]获得高质量基因组DNA,探讨并改进快速提取枇杷基因组DNA的方法。[方法]比较了3种传统的基因组DNA提取方法并对CTAB法进行改良,同时以27对适用苹果属扩增的SSR特异引物,对15种枇杷品种和2个组合的杂交后代进行PCR扩增,分析品种扩增片断多态性构建聚类关系树,统计了杂种后代等位性位点。[结果]改良CTAB法所提取的DNA具有良好的质量;27对引物15个品种中扩增出33个多态性片段,用NTYST软件进行分析聚为6类;一个杂种杂交后代扩增出32条片段,确定22个等位位点。[结论]改良CTAB适合于快速提取枇杷基因组DNA,SSR在枇杷基因组中具有多态性。