液相色谱-二极管阵列检测器测定大蒜制品中的蒜氨酸

建立了液相色谱-二极管阵列检测器测定大蒜制品中蒜氨酸的分析方法。用甲醇＋水提取试样中的蒜氨酸,经HLB固相萃取柱净化后,以C18柱分离、二极管阵列检测器扫描检测,以保留时间和蒜氨酸的二阶导数光谱图定性,以215nm波长下蒜氨酸峰面积定量。方法的线性范围：5．0—500．0μg／ml;加标回收率：89．0％-105．4％。     

高效液相色谱法同时测定黑蒜中蒜氨酸、脱氧蒜氨酸及γ-谷氨酰半胱氨酸含量

黑蒜中蒜氨酸及相关硫化物具有较强抗氧化性和多种药理活性。建立同时测定黑蒜中蒜氨酸、脱氧蒜氨酸和γ-谷氨酰半胱氨酸含量高效液相色谱法。黑蒜样品用榨汁机粉碎,超声提取后过滤离心,以甲醇+0.1%磷酸(19)为流动相,经ZORBAX-Eclipse XDB-C18 Analytical色谱柱(4.6 mm×250 mm,5μm)分离,220 nm下检测。结果表明,蒜氨酸、脱氧蒜氨酸和γ-谷氨酰半胱氨酸分别在27.20～275.00μg·mL~(-1)(R~2=0.9992)、22.40～280.00μg·mL~(-1)(R~2=0.9991)、36.80～368.00μg·mL~(-1)(R~2=0.9988)范围内,线性关系良好;3种物质加标回收率分别为94.61%、96.39%和92.56%;相对标准偏差RSD分别为2.87%、1.07%和0.98%。该方法样品前处理简单,测定快速,回收率高,精密度高,适用于黑蒜中蒜氨酸、脱氧蒜氨酸和γ-谷氨酰半胱氨酸含量同时测定。     

HPLC测定独头蒜和大蒜中的蒜氨酸和大蒜素

为准确、快速、方便地测定大蒜中的蒜氨酸和大蒜素,采用反相高效液相色谱法(RP-HPLC),Waters symmetry C18(4.6mmi.d.150mm,5μm)色谱柱,蒜氨酸检测波长214nm、大蒜素检测波长254nm,流动相甲醇水(3070),流速0.8ml/min,结果蒜氨酸在0.01～0.35mg/ml,呈良好的线性关系,相关系数=99.6,平均回收率(99.85±1.53)%。     

大蒜生理活性物质对几种植物病原真菌的体外抑菌活性

利用蒜汁和从鲜蒜中提取的蒜氨酸、蒜氨酸酶和蒜素,对交格链孢菌、指状青霉、灰霉、稻瘟病菌和意大利青霉进行了体外抑菌实验。采用平板打孔法和液体2倍稀释法。结果显示蒜汁和蒜氨酸酶、蒜氨酸+蒜氨酸酶、蒜素对5种试验菌都有明显的抑制作用。蒜氨酸+蒜氨酸酶对供试的五种植物病原真菌的抑菌效果最为显著,且抑菌效果与未经稀释的农药亮碘相当或是亮碘的1.4~2.4倍。蒜氨酸+蒜氨酸酶和蒜素对指状青霉、灰霉和意大利青霉具有很强的抑菌作用,其最小抑菌浓度(MIC)分别是0.09和0.5 mg/mL。     

大蒜生理活性物持质对几种植物病原真菌的体外抑菌活性

利用蒜汁和从鲜蒜中提取的蒜氨酸、蒜氨酸酶和蒜素,对交格链孢菌、指状青霉、灰霉、稻瘟病菌和意大利青霉进行了体外抑菌实验.采用平板打孔法和液体2倍稀释法.结果显示蒜汁和蒜氨酸酶、蒜氨酸+蒜氨酸酶、蒜素对5种试验菌都有明显的抑制作用.蒜氨酸+蒜氨酸酶对供试的五种植物病原真菌的抑菌效果最为显著,且抑菌效果与未经稀释的农药亮碘相当或是亮碘的1.4～2.4倍.蒜氨酸+蒜氨酸酶和蒜素对指状青霉、灰霉和意大利青霉具有很强的抑菌作用,其最小抑菌浓度(MIC)分别是0.09和0.5 mg/mL.     

蒜氨酸酶动力学性质研究

大蒜中含有一类被称之为大蒜素的含硫化合物,主要由蒜氨酸酶与蒜氨酸发生酶解反应生成,但蒜氨酸酶含量低,对环境较敏感,因而活性表现不稳定,加之目前的生产条件常导致该酶活性被破坏,使得蒜类产品的药理作用不显著。因此,研究蒜氨酸酶的理化性质对于开发应用蒜类药用产品具有重要的指导作用。     

蒜氨酸酶动力学性质研究

大蒜中含有一类被称之为大蒜素的含硫化合物,主要由蒜氨酸酶与蒜氨酸发生酶解反应生成,但蒜氨酸酶含量低,对环境较敏感,因而活性表现不稳定,加之目前的生产条件常导致该酶活性被破坏,使得蒜类产品的药理作用不显著。因此,研究蒜氨酸酶的理化性质对于开发应用蒜类药用产品具有重     

洋葱γ-谷氨酰转肽酶AcGGT的克隆与鉴定

【目的】葱属植物代谢产生的蒜氨酸具有重要的药学价值,γ-谷氨酰转肽酶是蒜氨酸合成中作为脱谷氨酰化步骤的关键酶。研究洋葱γ-谷氨酰转肽酶基因的功能,揭示γ-谷氨酰转肽酶在洋葱蒜氨酸合成途径中的作用,为体外合成蒜氨酸提供理论依据,为进一步深入研究洋葱蒜氨酸合成机制奠定基础。【方法】以洋葱为材料,依据洋葱RNA-seq数据库设计引物,利用RT-PCR从洋葱中克隆γ-谷氨酰转肽酶基因,并进行生物信息学分析;构建CaMV 35S-AcGGT-GFP载体,利用微粒轰击技术,以金粉-质粒微载体轰击洋葱内表皮细胞,构建带有AcGGT的酿酒酵母表达载体,转化并诱导表达AcGGT,利用γ-谷氨酰转肽酶催化谷氨酰对硝基苯胺生成对硝基苯胺的方法测定转入AcGGT的酿酒酵母总蛋白的谷氨酰转肽酶活性;利用实时荧光定量PCR方法分析该基因在洋葱组织间差异表达模式;利用γ-谷氨酰转肽酶催化谷氨酰对硝基苯胺生成对硝基苯胺的方法测定组织间内源性转肽酶酶活性。【结果】克隆获得AcGGT,长度为1 869 bp;生物学信息学分析显示,洋葱AcGGT编码622个氨基酸,蛋白保守结构域预测显示具有谷氨酰转肽酶结构域,二级结构主要以α-螺旋为主,跨膜区分析推测GGT蛋白具有跨膜区,氨基酸多重比对结果显示植物中的GGT具有一定的保守性,进化分析表明AcGGT与大蒜AsGGT2亲缘关系最接近。CaMV 35S-AcGGT-GFP融合蛋白的荧光信号位于液泡中,表明该基因编码蛋白位于液泡。外源表达AcGGT蛋白的谷氨酰转肽酶活性测定结果显示,转入AcGGT的酵母谷氨酰转肽酶活性显著高于对照,表明AcGGT编码的蛋白具有转肽酶活性。AcGGT组织差异表达结果分析显示,该基因的表达主要在叶鞘,鳞茎和叶鞘次之;不同组织谷氨酰转肽酶活性显示,在叶中活性最高,叶鞘次之。相关性分析显示组织间谷氨酰转肽酶活性与AcGGT表达相关性不显著。【结论】克隆了洋葱AcGGT。洋葱蒜氨酸合成途径中脱谷氨酰化先于S-加氧。AcGGT的表达与洋葱内源性的谷氨酰转肽酶活性相关性不显著,洋葱中可能存在多个谷氨酰转肽酶基因。     

大蒜蒜氨酸酶基因克隆与序列分析及毕赤酵母表达质粒的构建

根据GenBank登录的蒜氨酸酶序列(S73324)设计上下游引物,利用RT-PCR技术从浙江大蒜鳞茎中扩增蒜氨酸酶基因,获得了长度为1523bp的cDNA序列,提交GenBank(登录号:FJ786257,命名为浙江蒜氨酸酶)。利用生物信息学相关软件对该序列进行同源性比较、进化分析、蛋白质的结构和酶活性中心预测,引用pPICZaC载体构建蒜氨酸酶毕赤酵母真核表达重组质粒。结果表明:浙江蒜氨酸酶与其他葱属植物如大蒜、洋葱、冬葱、火葱和细香葱蒜氨酸酶具有高度同源性,进化关系比较接近,目的基因可以成功构建到毕赤酵母表达载体。浙江蒜氨酸酶三维结构呈树枝状,蛋白质分子的N端含有一个类似表皮生长因子结构域,酶的中心含一个天冬氨酸氨基转移酶超家族结构域;蛋白质结构中Lys-277可能是磷酸吡哆醛的结合位点,Lys-277周围区域可能是酶活性中心部位。重组质粒经鉴定构建正确。     

蒜氨酸酶动力学性质研究

[目的]研究蒜氨酸酶的动力学性质。[方法]分别测定温度、pH值、底物浓度及金属离子对蒜氨酸酶活性的影响,并计算最大反应速度及米氏常数。[结果]蒜氨酸酶为热不稳定性酶,其最适反应温度为29℃,最适pH值为6.1;以其天然抽提物为底物测得最大反应速度及米氏常数分别0.492IU/mg、0.483mmol/L;K+、Mg2+、Ca2+、Na+和Cd2+对蒜氨酸酶活性有一定的激活作用,Cu2+对酶活性有抑制作用。[结论]该研究可为开发应用蒜类药用产品提供依据。