鰤鱼诺卡氏菌感染卵形鲳鲹的组织病理学研究

从阳江闸坡海水网箱养殖的患病卵形鲳鲹(Trachinotus ovatus)病灶中分离出病原鰤鱼诺卡氏菌(Nocardia seriolae),并人工回接感染卵形鲳鲹,病鱼的脾脏、肾脏、肝脏、鳃、心脏等器官出现直径为0.1-0.3 cm的白色结节,对患病卵形鲳鲹进行病理组织学观察,发现脾脏出血,淋巴细胞增生;肾小管上皮细胞变性、坏死,淋巴细胞增生;肝脂肪变性;鳃小片上皮细胞增生,相互融合在一起棒状化;心肌细胞肿胀,断裂,溶解。     

七带石斑鱼神经坏死病毒的RT-LAMP检测方法

报道了一种可以快速、灵敏地检测七带石斑鱼神经坏死病毒(NNV)的逆转录环介导等温扩增方法(RT-LAMP)。该方法参考赤点石斑鱼NNV病毒的主衣壳蛋白(MCP)基因的保守序列,设计1对引物克隆出七带石斑鱼NNV的基因序列,利用Primer Explorer V4软件设计了3对针对所克隆NNV基因序列的特异性引物,建立了RT-LAMP的反应体系,并分别对反应系统的引物浓度、反应温度和时间进行了优化,形成了七带石斑鱼NNV病毒RT-LAMP检测技术。实践应用结果表明,在63℃的最佳反应温度下,采用RT-LAMP检测技术经过45 min就能完成一次检测,准确率达到100%。本研究建立的RT-LAMP检测NNV技术设备要求简单,为七带石斑鱼等石斑鱼无NNV受精卵和仔稚鱼的生产现场检测和筛选提供了一种方便、灵敏的检测方法。     

6株鱼类病毒性神经坏死病病毒cp基因的分子特征和遗传发生分析

根据已报道的鱼类病毒性神经坏死病毒(viral nervous necrosis virus, VNNV)衣壳蛋白基因(coat protein gene, cp基因)设计引物,对2006年从我国沿海养殖石斑鱼中分离到的6株鱼类神经坏死病毒进行RTPCR扩增,特异性扩增出6株病毒的完整衣壳蛋白基因,分别连接到pMD18-T载体中,并进行序列测定和分析.结果发现,6个VNNV分离株的cp基因核苷酸序列的同源性在97.3%以上;推导的氨基酸序列同源性在79.6%～99.1%之间.根据cp基因核苷酸序列绘制分子进化树,发现6个VNNV分离株在进化树同一分枝上,属于RGNNV基因型,与已报道的点带石斑鱼神经坏死病病毒(ECNNV)、巨石斑鱼神经坏死病病毒(ETNNV)及玛拉巴石斑鱼神经坏死病病毒(MGNNV)亲缘关系较近.试验结果表明,目前我国沿海养殖场发生的鱼类病毒性神经坏死病均由同一来源的病毒引起,该基因型的鱼类神经坏死病毒在我国沿海养殖的石斑鱼中广泛传播流行.     

卵形鲳鲹基因组调研及其SSR分子标记的开发应用

[目的]通过高通量测序技术调研卵形鲳鲹基因组数据并开发SSR分子标记,为卵形鲳鲹全基因组测序与组装、种质资源保护利用及良种选育提供技术支撑.[方法]通过Illumina Hiseq 2500测序平台对卵形鲳鲹基因组进行调研,采用K-mer方法对基因组大小、杂合率、G+C含量及序列重复性等进行分析,从调研数据中分析SSR的分布特征,筛选出多态性SSR位点,并对卵形鲳鲹养殖群体进行遗传多样性分析.[结果]卵形鲳鲹基因组大小为642.68 Mb,杂合率为0.31%,重复序列比例为30.19%,G+C含量为41.45%,提示卵形鲳鲹基因组为简单基因组.基因组初步组装结果显示,Contig总长度为627.23 Mb,N50、N90分别为8.21和1.71 Mb;Scalffold总长度为628.19 Mb,N50、N90分别为10.19和2.04 Mb.从卵形鲳鲹基因组调研数据中共检测出190121条SSR序列,SSR序列分布密度为295.8条/Mb.在所有SSR序列中,以二核苷酸重复基元最多(115557条),占60.78%;其次是三核苷酸重复基元(54839条),占28.84%;六核苷酸重复基元最少(1172条),占0.62%.在二核苷酸重复基元中以TG和AC的重复数较多,分别占二核苷酸重复基元总数的22.99%和21.76%.从合成的50对SSR引物中筛选获得29对多态性SSR引物,采用这29对SSR引物对卵形鲳鲹群体进行遗传多样性分析,结果发现29个SSR位点共检测到98个等位基因,其有效等位基因数(Ne)为1.3998~3.9123(平均为2.6690),期望杂合度(He)为0.2856~0.7444(平均为0.5965),多态信息含量(PIC)为0.2647~0.6968(平均为0.5195);在29个SSR位点中,高度多态性位点(PIC>0.50)有15个,其余14个为中度多态性位点(0.25相似文献   

卵形鲳鲹线粒体COI基因全长序列的克隆与分析

根据近源物种线粒体序列的同源比对,在C0I基因上下游保守区域设计一对通用引物COF/COR.以卵形鲳鲹肌肉总DNA为模板,PCR扩增获得特异的DNA片段,经克隆、测序和比对证实该片段包含了卵形鲳鲹线粒体COI基因完整编码区1551bp.对5个个体分别测序后比对,发现卵形鲳鲹COI基因DNA序列在钦州湾种群个体间至少存在7个变异位点,使5个个体分别具有5种不同的单倍型.将卵形鲳鲹种内不同个体及鲹科其他物种的COI核酸序列进行比较分析,根据比对结果构建鲳鲹科各物种的系统进化树,支持鲹科下设四个亚科(鲹亚科,(师)亚科,鲳鲹亚科,鲹亚科)的分类系统.通过COI基因遗传距离计算发现,卵形鲳鲹种内不同地理种群个体间遗传距离为0.001 ～0.005,显著低于Hebert等所推荐的物种鉴定最小种间遗传距离2％,而鲹科不同物种间遗传距离大于0.044,与形态学分类一致,说明COI作为卵形鲳鲹DNA条形码应用是可行的.     

石斑鱼神经坏死病毒RNA干扰的

克隆了石斑鱼神经坏死病毒(Nervous necrosis virus,NNV)的衣壳蛋白(Major capsid protein,MCP)基因序列并构建了绿色荧光蛋白(EGFP)基因与MCP基因的融合真核表达载体pEGFP-MCP,设计了3对针对MCP基因序列的小片段干扰性RNA(Small interrering...     

卵形鲳鲹性腺组织学观察及简易性别判定方法建立

卵形鲳鲹雌雄鱼不具备性别特异的外形特征,发展一种可以简便鉴定卵形鲳鲹性别的技术是产业发展的迫切需要。通过一龄商品规格鱼性腺解剖学观察,发现商品规格鱼性腺已出现形态学上的明显差异,根据其形态学差异,建立了一种卵形鲳鲹早期的性别判定方法。进一步对性腺切片进行HE染色观察,发现上述形态学判定方法判断性别准确率达100%。形态学判定为雌鱼的性腺为典型的卵巢组织结构,有大量卵母细胞分布,而形态学判定为雄鱼的性腺观察到精小囊和精小叶等精巢典型结构。研究建立并验证的基于性腺解剖形态的卵形鲳鲹早期性别判定简易方法,可为下一步卵形鲳鲹性别决定机制研究和基于分子标记的早期性别鉴定方法建立提供参考材料。     

草鱼呼肠孤病毒RT-PCR检测方法的建立及临床应用

为了解草鱼呼肠孤病毒(Grass carp reovirus,GCRV)的感染流行情况及早期临床诊断的需要,研究并建立了该病毒的RT-PCR检测方法。根据GenBank中GCRV VP6蛋白基因保守序列设计引物,以GCRV弱毒疫苗株GCHV-892总RNA为模板,RT-PCR反应扩增出712 bp的目的条带,并对PCR反应体系和反应程序进行了优化,测定了该方法的敏感性和特异性。敏感性试验结果表明以含VP6蛋白基因的重组质粒为模板,该PCR方法的最低检测限为102copies.μL-1,特异性试验表明该引物仅能扩增GCRV核酸,而与白斑综合征病毒(WSSV)、嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)、病毒性神经坏死病毒(VNNV)无交叉反应性。应用所建立的RT-PCR方法检测了7份疑似出血病草鱼病样,3份病料获得了阳性扩增,随机挑选其中的1份阳性样品经克隆后测序,结果显示与GenBank中已知序列最高有99%的相似性。     

卵形鲳鲹(Trachinotus ovatus)热休克蛋白HSP30基因的克隆与组织表达

[目的]获得卵形鲳鲹(Trachinotus ovatus)HSP30基因并探讨其组织表达.[方法]采用RACE的方法从卵形鲳鲹脾组织克隆HSP30基因的cDNA全序列,并用荧光定量PCR分析在健康鱼及哈维氏弧菌感染后HSP30基因的组织表达.[结果]HSP30基因cDNA序列全长913 bp,包含5′非编码区(5′UTR)89 bp、3′非编码区(3′UTR)188 bp,开放阅读框(ORF)636 bp,编码211个氨基酸.预测其氨基酸序列成熟肽的蛋白分子质量为24.1 kD,理论等电点为5.62.HSP30包括N-末端序列(NTS)、α-晶状体蛋白结构域(ACD)、C-末端序列(CTS)和C-末端延伸(CTE).系统进化分析结果显示卵形鲳鲹HSP30与高体鰤(Seriola dumerili)HSP30聚为一支.卵形鲳鲹HSP30基因在各组织中均有不同程度的表达,其中肝组织中表达量最高,其次为皮肤、肌肉、脾、心、肾,其他组织的表达量较低.哈维弧菌侵染卵形鲳鲹后,肝、脾和肾组织中HSP30基因mRNA表达量均升高,肝组织中变化最显著.[结论]成功克隆了卵形鲳鲹HSP30基因,为进一步揭示卵形鲳鲹HSP30的抗菌免疫应答机制提供了理论依据.     

多重RT-PCR方法在凡纳滨对虾病毒检测中的应用

病毒检测在预防和控制对虾病毒性疫病实践中具有重要的作用和意义.为了提高对虾病毒检测的快速性和简便性,建立了一种可同时检测6种对虾病毒的RT-PCR方法,并利用该方法对来自广西沿海地区的130份病虾样品中的黄头病毒(YHV)、白斑综合征病毒(WSSV)、桃拉病毒(TSV)、肝胰腺坏死病毒(HPV)、传染性皮下组织坏死病毒(IHHNV)以及杆状病毒(MBV)进行了检测.检测结果:白斑综合征病毒发病率最高,检出率高达73.8 %;传染性皮下组织坏死病毒发病率为18.5 %;桃拉病毒检出率为3.1 %;未检出黄头病毒、肝胰腺坏死病毒和杆状病毒.该RT-PCR方法扩增得到的片段经测序,结果与标准毒株的核酸数据高度吻合.实践证明,该实验建立的RT-PCR方法具有高度的准确性,与其他检测方法相比具有快速、简便的特点,在对虾病毒检疫、流行病学调查等方面具有重要的应用价值.     

太平洋鳕神经坏死病毒衣壳蛋白(CP)的原核表达及条件优化

为深入研究太平洋鳕Gadus macrocephalus神经坏死病毒(Pacific cod nervous necrosis virus,PCNNV)衣壳蛋白(capsid protein,CP)的功能,将PCNNV cp基因连接到p ET-32a原核表达载体中,构建原核表达重组载体p EVCP,将其转化至大肠杆菌E.coli BL21(DE3)表达系统中进行融合表达,对诱导剂IPTG浓度、诱导时间和温度等诱导表达条件进行优化,采用SDS-PAGE及质谱技术鉴定表达产物。结果表明:本研究中成功构建了重组载体p EVCP,表达的目的蛋白相对分子质量约为55 000;目的蛋白经质谱鉴定,有6个肽段的氨基酸序列与预期一致;对重组菌株p EVCP/BL21的最佳诱导条件为IPTG浓度0.1 mmol/L、最佳诱导时间3 h、温度30℃。本研究结果可为后续冷水鱼类病毒疫苗的研制及病毒快速检测试剂盒的研发奠定基础。     

卵形鲳鲹组织蛋白酶L基因的克隆及其表达分析

[目的]明确卵形鲳鲹组织蛋白酶L基因(TroCatL)的遗传进化规律及其组织表达水平,为研究CatL生物学功能及其对病原的抗病机理提供理论依据.[方法]应用RT-PCR和RACE技术克隆TroCatL基因全长cDNA,采用生物信息学方法对其序列特征进行分析;并以实时荧光定量PCR(qPCR)检测TroCatL基因在健康组织中的表达情况及其表达与溶藻弧菌感染的关联性.[结果]TroCatL基因全长cDNA为1492 bp(GenBank登录号MH036350),包括开放阅读框(ORF)1011 bp、5'端非翻译区(5'-UTR)120 bp和3'端非翻译区(3'-UTR)361 bp. TroCatL基因编码336个氨基酸残基,其理论等电点(pI)5.7,预测分子质量37.93 kD,且存在CatL特有的保守结构域(ERFNIN、GNFD和GCXGG基序)及由139Cys、279His和303Asn组成的半胱氨酸蛋白酶保守活性位点.TroCatL氨基酸序列与其他鱼类CatL氨基酸序列的同源性高达83.9%~95.2%,尤其与鲈形目鰤鱼的亲缘关系最近. TroCatL基因mRNA在健康卵形鲳鲹组织中均有表达,以在肝脏中的表达最高,在脑组织中的表达最低.经溶藻弧菌感染后,TroCatL基因mRNA在肝脏、脾脏和血液中的表达水平均上调,肝脏和脾脏中的TroCatL基因mRNA在攻毒后24 h达峰值,血液中的TroCatL基因mRNA在感染后12 h达最高值.[结论]TroCatL蛋白结构域及其催化活性位点在遗传进化过程中较保守,通过参与机体的免疫应答反应,在卵形鲳鲹抵御细菌或病毒侵染的过程中扮演重要角色.     

延庆地区侵染百合的病毒检测与序列分析

利用DAS-ELISA和RT-PCR等检测方法,对北京市延庆地区疑似感染病毒的百合植株进行了检测,并将RT-PCR扩增到的产物进行克隆及序列分析验证。DAS-ELISA结果表明：百合叶片的粗汁液与TuBV的抗体呈现阳性,初步确定北京市延庆地区百合感染郁金香杂色病毒（TuBV）。RT-PCR检测结合克隆测序结果表明：郁金香碎色病毒CP基因的核苷酸序列与GenBank上已登录的（AB090385.1,AB078007.1和S44147.1）郁金香碎色病毒的核苷酸序列的同源性均为100%,与已登录的（qb｜AAB19407.1｜,dbj｜BAD02938.1｜和dbj｜BAB83899.1｜）氨基酸序列同源性均在95%以上,同源性较高,进一步证明北京市延庆地区百合感染有郁金香杂色病毒（TuBV）。     

养殖密度对卵形鲳鲹离岸大型抗风浪网箱养殖效果的影响

在海南临高后水湾海域的抗风浪网箱养殖基地,采用60 m周长的高密度聚乙烯(HDPE)圆形双浮式抗风浪网箱,分别设置40,45,50,55,60尾·m~(-3)水体5个密度梯度养殖卵形鲳鲹,研究了养殖密度对大型网箱养殖卵形鲳鲹养殖效果的影响。结果表明,在40~50尾·m~(-3)密度范围内,养殖密度对成活率和利润率影响不明显(P0.05),成活率高达80%以上,利润率也达到了45%以上,而后,随密度增加均显著降低;饵料系数随密度增加而升高,最低40尾·m~(-3)组(1.72),最高60尾·m~(-3)组(1.93);商品鱼a级比率随密度增加而下降,b,c级则上升;单位成本在40~45尾·m~(-3)间随密度增加而下降(P0.05),之后呈现上升趋势(P0.01),最高为60尾·m~(-3)(18.08元·kg~(-1)),最低为45尾·m~(-3)(16.43元·kg~(-1));利润在40~50尾·m~(-3)间随密度增大而增加(P0.01),而在50~60尾·m~(-3)间随密度增大快速下降(P0.01),最高利润为50尾·m~(-3),高达185.49元·m~(-3),最低为60尾·m~(-3),仅123.85元·m~(-3)。因此,为了控制养殖风险,获得最好的经济效益,建议养殖密度控制在45~50尾·m~(-3)水体。     

地黄病毒病的检测与初步鉴定

利用DAS-ELISA和RT-PCR等检测方法,对感染地黄病毒病的地黄进行检测和初步鉴定,并结合该病毒地黄分离物CP基因的克隆及序列分析进行验证。结果表明,烟草花叶病毒（TMV）为侵染地黄的主要病毒;扩增产物序列测定结果表明：TMV地黄分离物CP基因的核苷酸序列与GenBank上已登录的TMV其他株系CP基因核苷酸序列的同源性在85％～98％之间,氨基酸序列同源性在84％～98％之间,同源性较高。根据不同株系CP基因氨基酸序列进化树分析,推测该分离物可能为TMV的已有株系。     

卵形鲳鲹遗传多样性研究中AFLP技术优化及引物筛选

以卵形鲳鲹为材料,采用醋酸铵法提取高质量的基因组DNA,通过对双酶切?连接?电泳、染色等因素进行优化,建立了适用于卵形鲳鲹的AFLP反应体系。同时以卵形鲳鲹野生群体和养殖群体为材料,采用新建立AFLP反应体系从256对引物组合中筛选出10对多态性高的AFLP引物组合,获得了清晰的指纹图谱,证明建立的AFLP优化体系可用于卵形鲳鲹的AFLP分析。     

卵形鲳鲹养殖群体与野生群体遗传多样性的AFLP分析

利用AFLP技术对北部湾卵形鲳鲹野生群体和养殖群体进行遗传多样性分析和比较,可为卵形鲳鲹种质优化提供基础依据.研究采用10对引物组合在2个群体中共扩增出513个位点,其中多态位点数为133个,占总位点数的25.93％,两个群体平均多态位点比率为23.59％和18.32％,遗传多样性相对贫乏.养殖群体中低频位点明显减少而隐性纯合基因位点显著增加表明养殖群体丢失了低频基因.群体遗传结构分析表明,两群体间的遗传距离比较小,群体遗传结构相似.     

鱼类神经坏死病毒衣壳蛋白MCP和鮰爱德华氏菌外膜蛋白ompN1融合基因的原核表达

目前在针对鱼类神经坏死病毒的疫苗研究中，主要是将神经坏死病毒某些蛋白作为抗原进行注射免疫，但是传统的注射免疫并不能有效地激发黏膜免疫。笔者将鱼类神经坏死病毒的衣壳蛋白（MCP）与鮰爱德华氏菌的跨粘膜蛋白ompN1融合表达，拟制备能够抵抗神经坏死病毒的粘膜疫苗；利用从NCBI GenBank库里获得的鱼类神经坏死病毒的外壳蛋白MCP和鮰爱德华氏菌的外膜蛋白ompN1的基因序列，将两者进行序列优化与全基因合成，分别构建原核表达载体:MCP-ompN1 pET28a和MCP pET28a和ompN1 pET28a，并在大肠杆菌内分别诱导表达融合蛋白MCP-ompN1，MCP，ompN1后，再利用包涵体纯化及透析复性获得MCP-ompN1，MCP，ompN1蛋白。SDS-PAGE结果显示，原核表达纯化得到了较纯的MCP-ompN1 融合蛋白，Western Blotting结果表明，纯化得到的MCP-ompN1 融合蛋白不仅具有MCP抗原性，还具有ompN1抗原性。本实验通过原核表达纯化得到了鱼类神经坏死病毒衣壳蛋白MCP和鮰爱德华氏菌外膜蛋白ompN1的融合蛋白MCP-ompN1，为进一步验证融合蛋白MCP-ompN1能否作为抵抗神经坏死病毒的粘膜疫苗奠定了基础。