AFLP技术流程的改进及其在种子研究中的应用

概述了扩增片段长度多态性（AFLP）在模板、酶切、扩增体系、检测和分析方法等方面的技术流程,并探讨了近年来AFLP在种子研究中的应用。     

2种方法银染的AFLP片段再扩增效果比较及改进

Bassam银染法和Sanguinetti银染法是AFLP标记最常用的检测方法.本研究比较这2种方法银染的AFLP条带再扩增效果的差异,发现Bassam法银染的AFLP片段再扩增效率达到100%,而用同样的PCR条件,sanguinetti法银染的AFLP片段不能被扩增,限制了Sanguinetti法在AFLP标记分析中的应用.为提高Sanguinetti法银染的AFLP片段再扩增效率,对Sanguinetti法银染的AFLP片段回收和再扩增条件进行了改进.通过增加Sanguinetti法显色后的胶板漂洗次数、延长漂洗时间、改变AFLP条带浸泡溶液、增加浸泡液体积和增加PCR循环次数,成功地将Sanguinetti法银染的AFLP条带的再扩增效率提高到100%,从而解决了San-guinetti银染法应用的限制因素.     

厚朴AFLP分子标记体系的建立

以厚朴 Magnolia officinalis为材料,通过对扩增片段长度多态性（AFLP）反应体系中的酶切模板用量、扩增条件等几个方面进行优化,建立了较为理想的厚朴AFLP反应体系。结果表明：①采用十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）硅珠法提取的DNA质量较好,适用于AFLP分析。②酶切的基因组DNA以400 ng为宜;预扩增产物的稀释倍数以30倍为宜;20.00 μL选扩反应体系中Mg²⁺最佳浓度为2.00 mmol·L^－1,三磷酸脱氧核苷酸（dNTPs）最佳浓度为0.225 mmol·L^－1,Taq DNA 聚合酶最佳用量为16.67 nkat时,扩增带清晰且稳定,扩增效果较好。旨在为研究厚朴天然种群的遗传多样性及遗传结构分析、新品种选育及鉴定和遗传图谱构建等奠定理论基础。图7表1参12     

山核桃AFLP实验技术体系的建立

以充分展开的山核桃Carya cathayensis嫩叶为材料、利用改良CTAB（十六烷基三甲基溴化铵）法与CTAB裂解一硅珠吸附法提取山核桃总DNA,对适合于山核桃叶片的AFLP（扩增片段长度多态性）分析体系进行了摸索。结果表明：①改良CTAB法适用于从山核桃叶中提取高质量的DNA,提取的DNA可用于AFLP的分析;②采用EcoR I/Mse I 酶切组合,酶切连接一步法与两步法的效果没有明显的差异,但一步法操作更为简便;③适合于山核桃叶AFLP分析的引物组合为E-ACT＋M-CAT,E-ACT＋M-CTG,E-ACG＋M-CAT,E-ACG＋M-CTG。扩增产物经60g·L^-1变性聚丙烯酰胺凝胶电泳后进行银染,条带信号强度一致性好,条带分布均匀、清晰,分辨率较高。     

茶树AFLP--银染技术体系与品种指纹图谱的建立

通过对影响茶树AFLP—银染技术体系的关键因素作对比研究，建立了一套优化的茶树AFLP分子标记体系．应用该体系研究不同茶树品种的AFLP指纹，结果同一引物对不同品种扩增及不同引物对同一品种扩增都呈现出十分丰富的多态性，图谱清晰，分辨率高。     

甘薯AFLP扩增产物的PAGE胶快速银染方法

对目前6种常用的PAGE银染方法的成本、时间及染色效果等进行比较.结合笔者所在实验室的具体情况,用简易强碱法对甘薯AFLP扩增产物进行银染,分析银染过程中漂洗时间、次数,银染用水对银染效果的影响,建立了甘薯AFLP扩增产物的PAGE胶快速银染方法,可以批量生产银染AFLP扩增产物,银染效果较好.     

黄瓜基因组DNA提取及AFLP体系优化研究

［目的］提取黄瓜基因组DNA,并对AFLP体系进行优化。［方法］以黄瓜嫩叶为材料,利用改进的CTAB法提取高质量的黄瓜叶片总DNA,通过优化酶切连接、预扩增、选择性扩增等试验条件建立适合黄瓜的AFLP银染体系,得到清晰的黄瓜AFLP指纹图谱。［结果］DNA 模板的质量影响酶切以及后续的连接扩增反应,改良的CTAB 提取法可用于黄瓜AFLP 分析,形成清晰的AFLP 指纹。优化的酶切连接体系为：以37 ℃酶切连接12 h为宜,酶切连接的基因组DNA用量为200 ng,预扩增时Taq酶用量为0.5 U/20 μl体系,预扩增产物稀释40倍作为选择性扩增的模板。在此优化的体系下引物E41M47扩增出清晰的条带。［结论］为黄瓜品种的分子标记和黄瓜品种间亲缘关系等研究奠定了基础。     

栓皮栎AFLP反应体系的建立

以栓皮栎叶片为材料,研究了AFLP反应体系中酶切-连接反应的方法与时间、预扩增反应和选择性扩增反应等几个关键因素。建立一套适于栓皮栎基因组的AFLP反应体系:基因组DNA的提取宜采用改良的CTAB法;酶切-连接反应体系采用一步法,其中DNA模板用量为200ng,酶切-连接反应4h;酶切-连接产物用于预扩增反应的最佳稀释倍数为20倍;预扩增产物不需要进行稀释直接用作选择性扩增反应。对各环节的效果检测与引物筛选验证表明该体系适合栓皮栎的AFLP分析。     

花生DNA分子标记的研究 III 不同限制酶组合AFLP分析效果比较

 采用了28对EcoR I/Mse I AFLP选择性扩增引物、64对Pst I /Taq I AFLP选择性扩增引物，对作图亲本24-3、B4及其杂种F1进行了分析，统计了两种限制酶组合的扩增总带数、多态性带数及多态性率。秩和检验结果说明，两种限制酶组合AFLP每对引物扩增出的总带数无显著差异，而多态性条带数目以及多态性率均有极显著的差异。证明尝试不同的限制酶组合可望揭示出花生品系材料间更为丰富的遗传变异性。     

基于毛细管电泳的柳树AFLP分子标记研究

为构建柳树遗传图谱、进行分子育种等奠定基础,以柳树为材料,基于毛细管电泳技术体系建立并优化了AFLP分子标记技术,简化了AFLP分析流程。首先提取高质量的柳树基因组DNA,对基因组进行酶切与接头连接、预扩增和选择性扩增,最后通过毛细管电泳分析各因素的影响。基因组DNA提取采用改进的CTAB法,酶切模板DNA用量450 ng,EcoRⅠ酶切2 h,MseⅠ酶切2 h,接头过夜连接,选择性扩增时dNTP浓度0.3 mmol/L,Mg 2+ 浓度1.5 mmol/L,引物浓度0.125 μmol/L,DNA聚合酶浓度0.025 U/μL,预扩增产物最适稀释倍数20倍。经过重复实验,证明建立的AFLP 毛细管反应体系适用于柳树AFLP分析。      

苹果AFLP分析体系的建立

以１２个苹果砧枯木基因型为试材,建立了扩增酶切片段长度多态性（ＡＦＬＰ）分析体系,对其分析过程中ＤＮＡ提取、双酶切、连接、预扩增、标记和选择性扩增的效果进行了检测。用Ｐ３２Ｍ６４引物构建了供试苹果砧木基因型的ＡＦＬＰ指纹图谱。该指纹图谱拥有扩增条带１０５条,多态性带６７条（占６３．８％）,条带清晰可辨,扩增信号强,无背景干扰。讨论了ＡＦＬＰ分析的影响因素。     

核桃AFLP银染技术体系的建立

为了建立准确、高效、实用的核桃AFLP体系,应用于核桃品种鉴别、优异基因的分子标记,本试验针对核桃叶片中多糖、酚类等次生代谢物比较多的特点,采用改良CTAB法,通过添加抗氧化物质,得到了适合核桃AFLP分析的基因组DNA提取方法;在此基础上进行了AFLP体系中主要参数的优化研究,比较了两种银染方法的效果,并从64对选择性扩增引物中筛选出了18对适合核桃AFLP分析的引物,建立了能得到清晰指纹分析图像的核桃AFLP技术体系。     

不同猕猴桃品种雌雄植株的AFLP分析

以猕猴桃(Actinidiaspp.)幼叶为材料提取基因组DNA,从64个引物组合中选取12对引物进行雌、雄集群DNA样品的扩增片段长度多态性(Amplified fragment length polymorphism,AFLP)扩增,再从中选取4对引物进行6对雌、雄DNA样品的AFLP扩增.4对引物共扩增出74个AFLP标记,其中多态性标记为58,多态性标记百分比为78.4%.遗传相似性分析表明,同一品种雌雄样品之间的AFLP电泳图谱表现出一定的差异,但小于不同品种间的差异,而品种间的差异又小于不同种间的差异.同时AFLP多态性初步检测出猕猴桃不同性别在DNA水平上的差异.     

薏苡AFLP体系的建立与优化

以30个不同薏苡种质为试验材料,利用AFLP分子标记技术进行遗传多样性及亲缘关系的研究。通过对AFLP常规流程中（基因组提取、酶切、连接、预扩增、选择性扩增、电泳及银染检测）关键因素进行优化,建立适合薏苡的AFLP扩增检测体系。结果表明,采用酶切与连接分开的两步法,酶切完全,每步反应时间4 h并附加15 min的酶失活时间;连接产物稀释10倍;预扩增产物稀释50倍,试验效果最佳。应用优化后体系,从64对引物中筛选出14对多态性较好的薏苡AFLP选择性扩增引物。     

黄瓜叶片DNA的提取及AFLP分析体系的建立

以黄瓜叶片为研究材料提取基因组DNA并进行了AFLP扩增。对影响AFLP分析体系的关键因素进行了比较和优化,探索出适宜黄瓜的DNA提取方法,并建立了AFLP分析体系,得到了较为清晰可辨的AFLP指纹图谱,为进行黄瓜的遗传多样性分析、遗传图谱构建和基因定位等研究奠定基础。     

新疆野猪mtDNA控制区序列遗传多样性分析

[目的]为研究猪种起源和遗传分化提供依据。[方法]从6个新疆野猪样本中提取基因组DNA,克隆线粒体DNA控制区序列并进行测序。在测定新疆野猪与其他20个国内外猪种间的遗传距离的基础上,对其进行聚类分析。[结果]通过PCR扩增克隆到大小为1398bp的DNA片段,其A+T含量为59.87%,有明显的碱基偏向性。控制区内存在大量的ACACGTGCGT串联重复序列。在6个新疆野猪样本中检测到3个单倍型。群体平均单倍型多样度(H)为0.600,核苷酸多样度(π)为0.00086。聚类分析结果表明新疆野猪与滇南小耳猪、泰国野猪和藏猪具有较近的遗传关系。[结论]新疆野猪与亚洲野猪和中国地方猪种有较近的遗传关系。     

苹果基因组AFLP分析的DNA模板的制备及技术体系的建立

AFLP对模板的质量要求较高。在苹果上用常规的SDS法提取基因组DNA，若加以适当纯化，也可达到AFLP分析的要求，另外，在AFLP分析体系中，应注意选择性扩增模板的浓度，以及选用适当的引物组合，同时也应掌握好变性的条件。     

节瓜基因组AFLP体系建立的研究

以节瓜雌性系K36和强雄系G为材料,从DNA提取、酶切连接、预扩和选扩等方面进行选择优化,建立高效稳定的AFLP分析体系,同时从64对AFLP引物组合筛选出多态性好的引物组合6对,并以该体系开展节瓜雌性性状分子标记和图谱构建等遗传分析研究。     

基于棉花逆转座子的SSAP标记的开发

从棉花BAC序列中鉴定了1个Tyl-copia类逆转座子,根据RNAseH-LTR连接区序列信息设计了特异引物,通过优化试验条件建立了一套经济、高效的SSAP(Sequence-specific amplification polymorphjsm)标记体系.分析棉属不同种的SSAP发现,SSAP在棉属不同种中均有丰富的扩增位点,而且棉花中SSAP多态性位点远高于AFLP(Fragment length poiymorphic markers).这一标记系统可增加棉花染色体端粒区域的标记密度,促进棉花高密度遗传图谱的构建.