黄瓜基因组DNA提取及AFLP体系优化研究

［目的］提取黄瓜基因组DNA,并对AFLP体系进行优化。［方法］以黄瓜嫩叶为材料,利用改进的CTAB法提取高质量的黄瓜叶片总DNA,通过优化酶切连接、预扩增、选择性扩增等试验条件建立适合黄瓜的AFLP银染体系,得到清晰的黄瓜AFLP指纹图谱。［结果］DNA 模板的质量影响酶切以及后续的连接扩增反应,改良的CTAB 提取法可用于黄瓜AFLP 分析,形成清晰的AFLP 指纹。优化的酶切连接体系为：以37 ℃酶切连接12 h为宜,酶切连接的基因组DNA用量为200 ng,预扩增时Taq酶用量为0.5 U/20 μl体系,预扩增产物稀释40倍作为选择性扩增的模板。在此优化的体系下引物E41M47扩增出清晰的条带。［结论］为黄瓜品种的分子标记和黄瓜品种间亲缘关系等研究奠定了基础。     

柱花草AFLP反应体系的建立与引物筛选

以柱花草奥克雷品种为材料,采用改良的CTAB法提取基因组DNA,对影响AFLP反应体系的主要因素进行了优化,建立了柱花草的AFLP反应体系。结果表明:20μL为最佳反应体系,酶切体系中DNA模板量为1000ng,用5 U EcoR I 37℃酶切2 h、5 U Mse I 65℃酶切2 h效果最佳;分别取5μL酶切液、1μL T4连接酶(5μL/L)、1μL EcoR I接头、1μL Mse I接头、2μL缓冲液(T4DNA酶自带),于22℃下连接10 min效果最佳;预扩增体系中模板稀释15倍、Mg2+浓度为0.75 mmol/L、Taq酶用量为1 U、dNTPs浓度为0.2 mmol/L、引物浓度为2 ng/μL效果最佳;选择扩增体系中模板稀释20倍、Mg2+浓度为1.25 mmol/L、Taq酶为1 U、dNTPs浓度为0.225 mmol/L、引物浓度为0.4 ng/μL效果最佳。利用热研5号、奥克雷2个品种对8对引物组合进行筛选,筛选出46对引物组合,为利用AFLP标记对柱花草进行分子生物学研究及分子育种奠定基础。     

蒙古黄芪AFLP分子标记反应体系的建立与优化

以内蒙古特色药用植物黄芪为试验材料,建立并优化1套适用于黄芪的扩增片段长度多态性(amplified fragment length polymorphism,简称AFLP)反应体系。对AFLP反应体系的影响因素基因组DNA的提取、内切酶的确定及酶切时间、预扩增、选择性扩增反应等关键因素进行优化,并对AFLP适宜引物进行筛选。结果表明,黄芪基因组DNA的模板以50 ng/μL为宜,采用EcoRⅠ/MseⅠ进行双酶切,酶切连接采用一步法完成;最佳酶连时间为16 h;预扩增反应产物稀释20倍作为选扩模板,筛选出适用于黄芪AFLP分析的引物组合5对:E-AG/M-CGT、E-AT/MCTG、E-GA/M-CAA、E-TC/M-CAA、E-GT/M-CTG,为黄芪的分子标记辅助育种、遗传图谱构建、种质资源研究奠定了基础。     

隐性核不育芝麻AFLP反应体系的优化

以芝麻细胞核雄性不育系95ms-5为材料,对AFLP反应体系中的酶切连接、预扩增和选择性扩增中的关键性因素进行了优化。结果表明,在模板DNA质量浓度为200ng/μL、37℃酶切连接6h的情况下,预扩增中最佳Mg2+浓度为1.0mmol/L,dNTP最佳浓度为0.3mmol/L,Taq酶量以0.5U为宜,预扩增引物终浓度为0.4mmol/L;选择性扩增中,预扩增产物稀释10倍后,以Mg2+0.8mmol/L、dNTP 0.2mmol/L、Taq酶1.0U、选扩引物0.6mmol/L为宜。     

青稞AFLP体系的建立及优化

本文以青稞为材料,对AFLP酶切连接、预扩增、选择性扩增过程进行优化。结果表明,酶切反应条件为DNA模板200 ng、限制性内切酶Eco RI/Mse I 4U、酶切时间4h;连接反应条件为连接温度16℃,T4连接酶3 U,连接时间12 h以上;预扩增反应条件为r Taq聚合酶3 U、dNTP 4 mmol/L、镁离子浓度1.00 mmol/L;选择性扩增反应条件为r Taq聚合酶4 U、d NTP 4 mmol/L、镁离子浓度1.25 mmol/L及预扩产物稀释10倍。利用优化后的AFLP体系,以藏青2000、冬青18这2个供试材料的基因组为模板,从100对引物组合中筛选出10对重复性好、稳定性强、扩增条带清晰、分布均匀、多态性高的引物组合,为青稞种质资源鉴定及遗传多样性分析提供了基础。     

克氏原螯虾AFLP反应体系的建立

以克氏原螯虾DNA为材料,对AFLP分析中的基因组酶切时间、选择性扩增中预扩增产物稀释倍数、Mg~(2+)浓度等3个因素进行了比较.结果表明,基因组用EcoR I和MseI双酶切5h,选择性扩增的PCR反应体系中Mg~(2+)1.5 mmol/L是进行克氏原螯虾AFLP分析的最佳反应条件,能够得到丰富稳定的带纹.而预扩增产物稀释倍数对选择性扩增没有明显影响.该体系的构建为AFLP技术在克氏原螯虾相关研究中的应用奠定了基础.     

药用植物草珊瑚AFLP反应体系的建立

从草珊瑚(Sarcandra glabra)的幼嫩叶片中提取基因组DNA,建立草珊瑚AFLP反应体系,对AFLP反应体系中模板DNA的浓度、基因组DNA的双酶切时间、预扩增产物的稀释倍数和引物组合的筛选等关键因素进行摸索.优化的草珊瑚AFLP反应体系为模板DNA的用量20 ng/μL、酶切反应时间4h、预扩增产物稀释15倍,初步筛选出8对较为适合草珊瑚AFLP分析的引物组合.     

栓皮栎AFLP反应体系的建立

以栓皮栎叶片为材料,研究了AFLP反应体系中酶切-连接反应的方法与时间、预扩增反应和选择性扩增反应等几个关键因素。建立一套适于栓皮栎基因组的AFLP反应体系:基因组DNA的提取宜采用改良的CTAB法;酶切-连接反应体系采用一步法,其中DNA模板用量为200ng,酶切-连接反应4h;酶切-连接产物用于预扩增反应的最佳稀释倍数为20倍;预扩增产物不需要进行稀释直接用作选择性扩增反应。对各环节的效果检测与引物筛选验证表明该体系适合栓皮栎的AFLP分析。     

小麦基因组AFLP反应体系的建立

利用小麦抗叶锈近等基因系研究了小麦基因组AFLP反应体系,建立了适于小麦基因组的AFLP反应体系:40μL酶切体系中采用7.5UPstⅠ和5UMseⅠ37℃3h,65℃3h双酶切0.1～0.2μgDNA,然后加入10μL接头、T4连接酶混合液,16℃连接过夜;吸取未稀释的酶切连接液4μL,加入75ng预扩增引物,10mmol/LdNTP,1.5UTaq酶,1×buffer,加PCR水至40μL进行预扩,将预扩产物稀释20倍,吸取5μL,加入40ng选择性引物,1.25UTaq酶,7.5mmol/LdNTP,2%去离子甲酰胺,1×buffer,加PCR水至25μL进行选择性扩增。本研究为小麦抗叶锈基因的分子标记克隆及抗病育种的辅助选择提供有力的工具。     

油茶AFLP分子标记体系的建立

以油茶DNA为材料,对AFLP分析中的基因组DNA酶切用量、连接液稀释倍数、预扩增产物稀释倍数、Mg(2+)浓度等4个因素进行优化比较.结果表明,用EcoR I和Mse I双酶切500ng基因组DNA效果最好,酶切产物加接头后稀释10倍进行预扩增效果较好.在Mg(2+)浓度为50μmol/L时,预扩增产物稀释90倍作为...     

杞柳AFLP反应体系的建立与引物筛选

以杞柳F1群体为试验材料,采用改良的CTAB法提取基因组DNA,经过酶切、连接、预扩增和选择性扩增,建立杞柳AFLP的反应体系,筛选EcoRI和MseI各16条选择性扩增引物组成256对引物组合。结果表明:320 ng基因组DNA采用5U EcoRI和MseI双酶切6 h,20℃连接12 h,连接产物稀释10倍进行预扩增,预扩增产物稀释15倍进行选择性扩增,选择性扩增产物采用ABI-3130检测,可获得条带清晰的指纹图;从256对引物组合中共筛选出98对多态性较高的引物组合。     

柿AFLP银染技术体系的建立

通过对各主要影响因素的研究,建立了适于柿AFLP分析的银染技术体系:酶切体系20μL总体积中含纯化后的DNA450ng,EcoRI和MseI各3U,37℃酶切4h;酶切完成后加入连接液,37℃连接10h(或过夜),然后65℃变性10min;连接产物稀释5倍用于预扩增,预扩增体系中EcoRI和MseI引物均不含选择性碱基;预扩增产物稀释5倍用于选择性扩增,选择性扩增体系中EcoRI和MseI引物均含3个选择性碱基,选择性扩增完成后,加入10μLLoadingbuffer,95℃变性10min,立即冰浴;取6 5μL变性后的选择性扩增产物在6%变性聚丙烯酰胺凝胶上电泳,电泳完毕后,对胶板进行固定、脱色、水洗、银染、冲洗、显影、定影及干燥等银染程序。     

菠菜AFLP反应体系研究(英文)

[目的]该研究旨在初步建立适合于菠菜作物的AFLP反应体系。[方法]运用改良CTAB法提取6份菠菜品种的DNA,对AFLP反应体系中酶切连接、预扩、选扩等实验条件进行了优化分析。[结果]研究结果如下:(1)在PCR仪中酶切的效果比水浴的要好,酶切反应对酶切时间和DNA的浓度要求不敏感。(2)菠菜AFLP预扩选扩体系的反应体积为20μl,Mg2+(25mmol/L)1.2μl,dNTPs(2.5mmol/L)1.6μl,Taq-polymerase(5U/μl)0.2μl最佳。[结论]该研究建立的AFLP反应体系对与菠菜基因组分析时稳定有效的,该技术体系为菠菜品种亲缘关系的AFLP分子标记分析和遗传育种等提供一定的理论基础。     

大白菜基因组DNA的提取及AFLP反应体系的建立

1材料与方法1．1材料供试大白菜种质材料32份,分别由北京市农林科学院蔬菜研究中心品种资源库及蔬菜研究中心大白菜育种课题组和中国农业科学院蔬菜花卉研究所国家种质资源中期库提供。材料编号、品种名称、来源地见表1。     

厚朴AFLP分子标记体系的建立

以厚朴 Magnolia officinalis为材料,通过对扩增片段长度多态性（AFLP）反应体系中的酶切模板用量、扩增条件等几个方面进行优化,建立了较为理想的厚朴AFLP反应体系。结果表明：①采用十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）硅珠法提取的DNA质量较好,适用于AFLP分析。②酶切的基因组DNA以400 ng为宜;预扩增产物的稀释倍数以30倍为宜;20.00 μL选扩反应体系中Mg²⁺最佳浓度为2.00 mmol·L^－1,三磷酸脱氧核苷酸（dNTPs）最佳浓度为0.225 mmol·L^－1,Taq DNA 聚合酶最佳用量为16.67 nkat时,扩增带清晰且稳定,扩增效果较好。旨在为研究厚朴天然种群的遗传多样性及遗传结构分析、新品种选育及鉴定和遗传图谱构建等奠定理论基础。图7表1参12     

披碱草属物种AFLP体系优化

试验对内切酶EcoRⅠ和MseⅠ的用量和酶切时间、预扩和选扩过程中模板稀释倍数以及扩增引物浓度分别进行了优化,并采用了Bassam法和Sanguinetti银染法进行了比较分析。结果表明:采用3UEcoRⅠ和MseⅠ这两种酶在37℃下酶切3 h,预扩模板稀释10倍和1.5 ng/μL引物进行预扩,选扩模板稀释20倍和2 ng/μL引物进行选扩,采用Bassam法进行银染,能够得到较好的试验结果,为AFLP进一步在披碱草属中的应用提供了参考。     

大竹蛏AFLP分子标记反应体系的建立与优化

[目的]建立一套适合大竹蛏的AFLP分子标记反应体系,为大竹蛏的遗传多样性研究提供技术支持。[方法]采用比较实验法,以大竹蛏基因组DNA为模板,对其AFLP体系中的酶切时间、预扩产物稀释倍数及选扩引物E＋3/M＋3的配比等进行优化。[结果]优化的AFLP体系为：酶切时的DNA模板浓度为100 ng/μl,双酶切2 h;预扩模板最佳用量1.0μl;预扩产物的最适稀释倍数为40倍;选扩引物浓度配比为1∶4。同时,筛选出12对引物组合,可用于大竹蛏的AFLP分析。[结论]采用优化的AFLP反应体系及筛选后的引物,对大竹蛏群体进行了初步扩增,得到了清晰的电泳图谱。     

沙棘木蠹蛾AFLP引物筛选及反应体系的建立

该文以沙棘木蠹蛾幼虫为材料,用改进的SDS-蛋白酶K法获得了高质量的符合AFLP分析要求的基因组DNA。通过对AFLP试验过程中的酶切 连接、预扩增、选择性扩增等各关键因素的比较研究,建立了一套优化的沙棘木蠹蛾AFLP分子标记体系,获得了清晰的指纹图谱。研究结果表明:利用EcoRⅠ/MseⅠ双酶切系统以酶切 连接2～4 h, 预扩增产物稀释20倍、Mg 2+浓度为1.5 mol/mL的选择性扩增效果最好。进一步利用该反应体系从80对E+3 /M+3选择性引物中筛选出10对多态性丰富、分辨率高、谱带清晰的引物组合。该研究结果为利用AFLP标记技术开展沙棘木蠹蛾的种群遗传结构、遗传分化等方面的研究奠定了基础。      

木霉AFLP分子标记技术体系的建立

以摇床培养的木霉菌丝为材料,采用液氮研磨等方法提取到高质量的基因组DNA,能够用于AFLP实验分析,探索和优化酶切-连接反应、预扩增和选择性扩增反应过程中的关键因素,建立了适合木霉AFLP的最佳试验体系和反应条件。利用该技术体系对不同时期保存的菌株及融合子进行AFLP指纹分析,发现不同时期保存的同一菌株指纹相同,融合子指纹兼有亲本菌株的特性。通过对木霉AFLP条件的探索和研究,建立了木霉基因组AFLP反应体系,得到的扩增多态性条带完全能够用于木霉遗传稳定性和多样性分析。