应用种特异性ITS引物(SS-ITS)鉴别新菠萝灰粉蚧

[目的]研究新菠萝灰粉蚧的种特异性ITS引物,以快速准确鉴定该虫,可为口岸快速通关提供依据.[方法]采用PCR扩增方法,首次测定分析了11种粉蚧39个样品的新菠萝灰粉蚧及其他粉蚧的rDNA ITS全序列.基于ITS区序列差异设计了针对新菠萝灰粉蚧的特异性引物,通过筛选引物退火温度、优化PCR反应条件建立了新菠萝灰粉蚧的快速分子鉴定方法.[结果]种特异性ITS引物只对新菠萝灰粉蚧有扩增条带,能有效扩增出约665 bp的DNA片段,其余种类均未有扩增条带.灵敏度试验结果显示该对引物灵敏度高,其检测限可达0.1 ng/μL.[结论]采用设计的ITS区种特异性引物可以对新菠萝灰粉蚧进行快速分子鉴定,该方法可为口岸一线检测鉴定提供参考.     

利用物种特异性PCR技术快速鉴定南瓜实蝇

【目的】快速鉴定我国进境植物检疫性害虫南瓜实蝇Bactrocera tau(Walker),防止该虫传入扩散。【方法】基于物种特异性PCR(SS-PCR)技术,选取20种形态近似的常见实蝇,将南瓜实蝇作为阳性对照,提取基因组DNA模板,选用mt DNA COⅠ序列,检查同源系列,设计筛选1对可快速准确鉴定南瓜实蝇的种特异性引物NF404和NR610,并进行PCR检测和验证,建立一种利用种特异性引物的快速鉴定方法。【结果】南瓜实蝇在207 bp的位置扩增出一条清晰且单一的目标条带,其余果实蝇未见条带。将截获的南瓜实蝇与其同亚属的近缘种具条实蝇、瓜实蝇的不同虫态和成虫部分虫体组织的虫样,采用本实验室建立的SS-PCR鉴定方法进行验证,结果一致。【结论】建立的南瓜实蝇的SS-PCR鉴定方法种特异性和稳定性强,能快速鉴定目标种类,解决口岸进境果蔬中截获实蝇幼虫、蛹等不同虫态和残体难于快速鉴定问题。     

马巴贝斯虫PCR检测方法的建立及应用

根据已发表的马巴贝斯虫18S rRNA基因序列,设计并合成一对特异性引物,通过聚合酶链式反应(PCR)扩增出一条约936 bp的基因片段,并成功地将该基因克隆于pGEM-Teasy载体,经PCR鉴定后进行序列测定.结果表明,所克隆的目的基因与GenBank中发表的序列同源性达到98.4%.并利用特异性引物初步建立了马巴贝斯虫病PCR检测技术.     

武汉单极虫巢式聚合酶链反应检测方法的建立与优化

应用巢式聚合酶链反应(nested PCR)建立了一种检测异育银鲫武汉单极虫(Thelohanellus wuhanensis)基因组DNA的方法,提取的DNA作为模板进行两次扩增,第一次扩增用单极虫18S rRNA序列通用引物:5'-CTGCGGACGGCTCAG TAAATCAGT-3'和5'-CCAGGACATCTTAGGGCATCACAGA-3',扩增长度为1 584 bp;第二次依据第一次扩增产物中武汉单极虫特有的高度保守区设计特异性引物:5'-ACCCACTTCTGTGGC CTTTC-3'和5'-AATCCGACCTACAACGCTGG-3',扩增长度为853 bp。结果表明,通过PCR反应体系中退火温度、dNTP、Mg2+、延伸时间、扩增循环数和模板浓度的优化,优化后的巢式PCR最低DNA检测量达10 fg,优化后比常规PCR检测的灵敏度高104倍。因此,本文所建立的巢式PCR检测方法适合于水环境或水生动物中武汉单极虫的微量检测,也为异育银鲫武汉单极虫病的诊断和流行病调查提供了一种高灵敏的检测技术。     

牛环形泰勒虫病PCR诊断方法的建立及其应用研究

[目的]建立快速检测牛环形泰勒病的PCR诊断方法.[方法]根据牛环形泰勒虫裂殖子的表面抗原(Tams1)基因,设计一对特异性引物,以地方阳性病例提取的DNA为模板,用PCR扩增出目的条带,经克隆、测序分析后,通过优化反应体系,建立牛环形泰勒虫病的PCR检测方法,并对该方法的特异性、敏感性进行验证试验.[结果]测序结果表明,扩增的目的片段与已知基因序列相似性为99;;该方法检测与牛的其他血液原虫无交叉反应,其最低检出限量为1.6×102 copies/μL.应用所建立的PCR检测方法对新疆吐鲁番市周边疑似地区419份牛全血进行了检测,结果阳性率为52.3; (219/419),而血液涂片检出率为43.7;(183/419).[结论]建立的牛环形泰勒虫PCR快速诊断方法具有有一定的特异性和敏感性,可用于牛环形泰勒虫病的分子诊断和流行病学调查.     

3种牡蛎原虫的流行情况调查及多重PCR检测方法

应用聚合酶链式反应(PCR)方法对福建、广东和海南等地沿海的养殖牡蛎进行包拉米虫、派琴虫和单孢子虫检测.结果表明,这些地区的牡蛎均不同程度地感染这些原虫,经鉴定病原为牡蛎包拉米虫、奥尔森派琴虫和尼氏单孢子虫.根据基因库中奥尔森派琴虫和尼氏单孢子虫的基因序列设计多对特异性引物,检测包拉米虫的引物采用世界动物卫生组织推荐引物,通过对多重PCR反应条件的优化,建立可同时检测这3种原虫的多重PCR方法.运用该方法对样品中的牡蛎包拉米虫、奥尔森派琴虫和尼氏单孢子虫进行扩增,结果得到与试验设计相符的303、480和749 bp 3条特异性扩增条带,对其他贝类病原核酸的扩增均为阴性.多重PCR方法最低能检测到10 pg牡蛎包拉米虫、奥尔森派琴虫和尼氏单孢子虫DNA,表明该方法适用于这3种原虫的快速检测和鉴别诊断.     

甘蔗黑穗病菌DNA提取及PCR检测

本研究利用尿素混合液直接从甘蔗黑穗病菌孢子提取基因组DNA进行PCR检测鉴定,经过反复试验,建立了一种简便、快速的检测鉴定方法。利用建立的方法对12个甘蔗黑穗病样品进行病菌基因组DNA提取,将甘蔗黑穗病菌特异性引物进行PCR检测,均扩增出大小为420 bp的预期DNA片段条带。PCR扩增产物经克隆测序,与GenBank数据库中的甘蔗黑穗病病原菌序列比对,同源性达99%。     

一种适用于PCR的环境友好型植物DNA提取方法(英文)

改进DNA提取方法,利用含2%CTAB、1%SDS、2%PVP、100mmol/LTris-Cl(pH8.0)、20mmol/LEDTA(pH8.0)和1.4mol/LNaCl的DNA提取缓冲液,提取了不同种属12种植物的DNA,并对其进行了PCR检测.结果显示,所提取的DNA符合PCR试验要求,用真核生物ITS4/ITS5通用引物均能扩增出清晰的条带.该方法无需酚仿抽提,简单、高效、环保,特别适合大规模植物DNA的提取.     

我国南方常见的6种寡毛实蝇PCR-RFLP快速鉴定研究

应用PCR—RFLP技术，对我国南方发生和诱捕到的6种寡毛实蝇开展了快速鉴定方法研究，结果表明，设计出的2组引物对6种供试实蝇线粒体DNA(mtDNA)的PCR扩增片断大小分别约为350bp和450bp。用限制性内切酶MSEI和DRAI对PCR扩增产物进行酶切，得到的酶切位点可将供试的6种实蝇区分开来。该方法不受供试实蝇食物源的影响，对各种虫态(卵、幼虫、蛹)和不同性别的成虫均适用，可用于实蝇的快速鉴定。     

副猪嗜血杆菌PCR检测方法的建立与初步应用

针对副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis,HPS)16 S rRNA序列设计1对特异性引物,能扩增出821 bp的特异性DNA片段,并据此建立了快速准确鉴定副猪嗜血杆菌PCR方法,临床试验证明该方法具有很好的特异性和敏感性.13份疑似病料检测结果表明,PCR检测结果与传统生化鉴定结果符合率为100％.结果表明已成功建立了副猪嗜血杆菌PCR检测方法,并可应用于临床副猪嗜血杆菌的检测.     

小麦种子规模化DNA提取及检测体系的优化

以小麦种子分子检测农业行业标准(NY/T 2859-2015)为基础,开发小麦种子快速、规模化提取DNA方法,优化反应体系中各组分含量,为小麦真实性快速执法提供技术支撑。通过对SDS、CTAB、高盐低p H、快速提取和试剂盒5种方法提取的DNA质量、浓度和PCR扩增效果进行比较,发现改进的高盐低p H方法提取种子的DNA质量、浓度能够满足小麦真实性鉴定中42对SSR引物重复鉴定的需求,是利用96孔深孔板和自动化移液工作站规模化、高通量提取DNA的较优方法。进一步优化结果显示该方法在65℃温浴条件下比室温的浓度高出25%,但两种温度条件下提取的DNA质量及浓度均能够满足品种鉴定的需求;沉淀时用0.5倍提取液体积的预冷异丙醇沉淀浓度最高,用室温的异丙醇沉淀的最佳体积是提取液体积的0.6倍。对标准中42对引物的最佳引物浓度和模板浓度均进行了优化,综合所有42对引物的优化结果发现,反应体系为20μL时,引物终浓度为0.437 5μmol/L,模板终浓度为10 ng/μL时扩增效率相对较高,扩增产物稳定,能够满足多重电泳的需求。     

1种适用于转基因玉米PCR检测的DNA快速提取方法

[目的]建立一种快速提取玉米基因组DNA的方法。[方法]对改良CTAB法进行进一步简化,不需要进行沉淀、洗涤、溶解和RNA消化等步骤,建立一种快速提取玉米基因组DNA的方法。[结果]该方法获得的DNA完整性及PCR扩增效果与试剂盒提取方法相比无明显差异;经过对样品ELISA检验可知,该方法得到的DNA用于PCR检测结果准确。[结论]该方法能够满足转基因玉米PCR检测中快速、高效、准确、高通量的要求。     

膜吸附法结合可视化环介导等温扩增技术检测柑橘黄龙病菌

【背景】柑橘黄龙病（Huanglongbing,HLB）是由候选韧皮部杆菌亚洲种（‘Candidatus Liberibacter asiaticus’,CLas）侵染引起的一种柑橘病害。对于该病害的防治主要采取综合措施,包括实施检疫、种植无病苗木、及时挖除病树和集中大面积联防联控柑橘木虱等。前3种方法都需要依靠准确的柑橘黄龙病诊断技术。【目的】利用环介导等温扩增技术（loop-mediated isothermal amplification, LAMP）,结合膜吸附法DNA快速提取和Gelgreen荧光染料可视化,建立黄龙病田间核酸快速检测方法。【方法】以黄龙病菌β-操纵子与原噬菌体DNA聚合酶基因为模板设计LAMP特异性引物,包括外引物F3/B3、内引物FIP/BIP、环引物LoopF/LoopB和茎引物StemF/StemB。通过对环引物和茎引物设定不同的用量组合,对LAMP引物体系进行优化,确定合适的引物浓度。用优化后的LAMP引物体系对188份田间柑橘叶片进行检测,并构建受试者工作特征（receiver operating characteristic,ROC）曲线分析实时荧光LAMP（qLAMP）在CLas检测上的准确性。对qLAMP预混反应液进行两步的常温干燥,分别设定不同的存放条件,评估LAMP常温干燥试剂的稳定性。用本研究建立的CLas可视化LAMP快速检测方法,对田间71个柑橘叶片样品和35个柑橘果实样品进行检测,与实时荧光定量PCR（qPCR）比较两者的符合率。【结果】在LAMP体系中加入环引物、茎引物或增加其浓度都能促进反应速率的提升,并且同时加入终浓度均为1.6 μmol·L^-1的环引物和茎引物能进一步提高LAMP反应速率。LAMP预混液通过两步法干燥在不同温度存放1—4周均能保持反应活性基本不变,表明制备的两步法干燥LAMP试剂检测性能较好,在低温和常温环境下的稳定性尚可,仅35℃高温存放会略微增加LAMP试剂的反应时间。使用孔径0.1 μm尼龙膜代替纤维素滤纸作为核酸吸附材料能提升CLas快速诊断技术的灵敏度。结合DNA快速提取和可视化LAMP建立的CLas快速核酸诊断方法最低能检测到浓度为10² copies/μL的重组质粒样品,总体准确率高。经配对卡方检验,该方法的诊断结果与qPCR无显著差异。可视化LAMP快速检测相较常规检测有着更低的成本和耗时,而且可视化LAMP快速检测无需离心机和PCR仪等昂贵的仪器,仅需一台65℃恒温设备即可。【结论】建立的CLas快速核酸检测方法成本低,30 min即可观察到检测结果,操作简便,准确性高,可替代qPCR在田间进行黄龙病的快速鉴定。     

从活性污泥中提取微生物总DNA的方法比较

[目的]探索适宜的畜禽废水中活性污泥微生物总DNA提取的方法。[方法]采用2种方法提取畜禽废水中活性污泥微生物总DNA,即"提取缓冲液+蛋白酶K+SDS"提取法以及"溶菌酶-SDS-蛋白酶"提取法。通过对这2种方法进行比较,以确定最佳试验方案。[结果]紫外分光光度法分析表明,"提取缓冲液+蛋白酶K+SDS"提取法所得的OD260/OD280大于1.81。电泳结果显示,"提取缓冲液+蛋白酶K+SDS"提取法提取DNA亮度高,有大片断DNA的存在且拖带较少,条带集中,能成功进行16S rDNA的PCR扩增;通过PCR扩增所得的DNA的纯度检测结果显示,扩增出了条带分子约为1 500 bp的特异性条带"。溶菌酶-SDS-蛋白酶"提取法所提取的DNA没有得到较好的效果,点样孔较亮则可能存在一定的蛋白质残留,或其他杂质等,通过PCR扩增没有扩出特异性条带。[结论]"提取缓冲液+蛋白酶K+SDS"提取法为畜禽废水中微生物群落在分子水平上的研究提供了1种简便、可靠的DNA提取方法,为分析畜禽废水中细菌多样性提供了条件。     

天牛基因组DNA的提取方法

通过试验探索出3种可以快速、简便地从天牛干标本、液浸标本和新鲜标本中提取DNA模板的方法。对所获得的基因组扩增分析表明,经过PCR之后的DNA能呈现明显的多态性,同种天牛用同一引物扩增幼虫和成虫所获得的结果相同,可以认为,RAPD技术可以应用于天牛成虫干标本及幼虫浸渍标本的鉴定及系统发育研究中,也证明了这3种方法用于提取不同保存时间、不同种天牛基因组的DNA是切实可行的。     

褐拟谷盗的快速分子鉴定方法

文中应用PCR法和PCR-RFLP法建立了褐拟谷盗的快速分子鉴定方法.结果表明：①PCR法中,采用依据褐拟谷盗COI基因设计的特异性引物进行PCR扩增,其产物经电泳检测证实,能快速准确地鉴定褐拟谷盗;②PCR-RFLP法利用2组简并引物对目标拟谷盗的COI基因进行PCR扩增,并借助HindⅢ限制性内切酶对扩增产物进行酶切后,进行电泳检测,该法也可用于检疫工作中对褐拟谷盗的快速鉴定.     

生鲜猪肉中含扩增内标的沙门氏菌Real-time PCR检测方法的建立

建立含扩增内标的生鲜猪肉中沙门氏菌Real-time PCR检测方法,以提高检测的准确性。根据沙门氏菌ttrBCA基因设计引物和探针,利用犬瘟热病毒核衣壳蛋白基因构建和目标基因相同引物的扩增内标,并对退火温度和引物、探针的浓度进行优化,建立含扩增内标的Real-time PCR检测方法,用该方法对人工污染生鲜猪肉样品进行检测。结果显示,该方法对19株非沙门氏菌检测结果均为阴性,对36株沙门氏菌检测结果均为阳性,特异性较好,热学裂解制备DNA模板法检测灵敏度达100 CFU/ml,试剂盒提取DNA制备模板法检测灵敏度达1μl2.66拷贝。在25μl反应体系中加入扩增内标103拷贝不影响目标基因的扩增,该方法能在12 h内对人工污染沙门氏菌的肉样做出检测。该方法不仅可快速检测生鲜猪肉中的沙门氏菌,同时避免了假阳性现象的产生。     

用于Real-time PCR检测的牛肉组织DNA提取方法探索

使用Chelex-100提取牛肉组织DNA,并用紫外分光光度法检测所提取的DNA浓度和纯度,结果表明所提取的DNA A260 nm/A280 nm在1.662～1.826之间,纯度较高。Real-time PCR扩增提取的DNA模板,表现出较高的敏感性。该DNA提取方法效率较高,操作简便,能够获得较高质量的DNA,适合检疫部门的快速检测需要。     

一种适于PCR扩增的蓖麻基因组DNA提取方法

报道了一种从蓖麻叶片中提取DNA的改良SDS方法,该方法提取的DNA经琼脂糖凝胶电泳检测,获得的DNA条带较亮且无明显拖尾现象。利用ISSR引物对提取的蓖麻基因组DNA进行PCR检测,能够获得清晰稳定的条带。说明该方法提取的蓖麻基因组DNA能够满足PCR反应的需要。     

桑树SRAP-PCR反应体系的建立与优化

以广西地方桑树种质资源＂平武1号＂为材料,以引物组合Me8/Em3对其SRAP反应体系的模板DNA、引物、dNTPs和Taq DNA聚合酶等条件进行优化。结果表明,最优反应体系为：在25.0μL反应体系中含模板DNA 45.0 ng,引物1.0μmol/L,dNTPs 0.3 mmol/L,Taq酶1.0 U。用42个引物组合对6份桑树二倍体品系（农桑8号、璜桑37号、湖桑197号、湖桑32号、湖桑199号、育711、桐乡青、国桑20号）及其同源四倍体进行扩增,其中引物组合Me6/Em2的扩增条带清晰,品种间有不同程度的多态性。该研究建立的反应体系应用于桑树遗传多样性研究,重复性好,稳定性强,结果可靠,可用于下一步研究。