‘黄花梨’2个CYP707A基因的克隆和序列分析

[目的]探讨脱落酸(Abscisic acid,简称ABA)分解途径关键酶基因(CYP707A)的特性,以期为揭示ABA调控梨花芽休眠进程的分子机制奠定基础.[方法]根据已公布的梨基因组数据库,通过本地blast的方法获得梨基因组CYP707A序列,运用DNAMAN软件设计引物,获得‘黄花梨’的2个脱落酸8’-羟化酶基因的CDS序列,分别命名为PpCYP707A4(Genbank登录号:KP279630)和PpCYP707A5(Genbank登录号:KP279631),并利用在线分析平台和生物软件进行生物信息学分析.[结果]PpCYP707A4的CDS序列全长分别为1 431 bp,编码476个氨基酸;PpCYP707A5的CDS序列全长为1425 bp,编码474个氨基酸,两者同源性94.27％,氨基酸相似性94.96％,两者与苹果的2个基因在系统发育树上分别独自聚为一小支.[结论] PpCYP707A4和PpCYP707A5为同属于梨PpCYP7074家族2个相似度较高的基因,它们可能发源于苹果和梨的共同祖先.     

番茄采后成熟过程种子和果皮中脱落酸与乙烯代谢的关系

以番茄中杂101为材料，研究采后果实成熟过程种子和果皮中脱落酸（ABA）含量与乙烯生物合成的关系，以及外源ABA及其生物合成抑制剂（fluridone）处理对果实ABA含量和乙烯释放量的影响。结果表明：采后番茄果实成熟过程中．种子的乙烯释放量、1-氨基环丙烷-1-羧酸（ACC）含量和ABA含量均高于同时期果皮；种子和果皮中ABA和ACC含量的峰值都出现在乙烯跃变之前；ACC氧化酶（ACO）活性变化趋势与ABA含量及乙烯释放量的变化趋势相一致；外源ABA处理使果皮和种子中ABA含量显著增加，促进了果实乙烯的生成；fluridone处理则相反。以上证据表明，番茄果实中的ABA通过刺激乙烯的生成促进果实成熟，种子可能通过调控果实内ABA含量和乙烯释放量而影响果实的成熟。     

两种砂梨果实香气成分分析及其相关基因PpAAT的克隆与表达分析

梨（Pyrus spp）是深受国内外消费者喜爱的水果,果实香气是果实品质的重要指标,也是吸引消费者和增强市场竞争力的主要因素之一。本文以砂梨品种‘二十世纪’及其芽变品种‘金二十世纪’为试材,研究了其果实不同发育时期香气成分的差异,克隆获得了梨果实香气成分合成相关的醇酰基转移酶基因（PpAAT）,分析了该基因在梨果实不同发育时期及不同部位中的时空表达规律,结果表明：‘二十世纪’绿熟期、商熟期和完熟期果实的主要香气成分均为己醛,‘金二十世纪’绿熟期果实的主要香气成分同样是己醛,但商熟期果实中己酸乙酯的含量迅速增加,成为主要香气成分,完熟期时含量进一步增加,高含量的酯类化合物可能是‘金二十世纪’具有浓郁香气的主要原因;随着果实的成熟,PpAAT基因在‘金二十世纪’果皮中的表达量呈逐渐下降的趋势,绿熟期表达量最高,商熟期表达量开始降低,完熟期表达量非常弱;PpAAT在果肉中的表达量呈先升高后降低的趋势,在商熟期果肉中表达量最高,绿熟期果肉中次之,完熟期果肉中的表达量最低。总体上,PpAAT基因在商熟期的表达量高于绿熟期和完熟期,在果皮中的表达量高于果肉。     

柑橘砧木对砂糖橘果实糖积累的影响

【目的】分析不同砧木对砂糖橘果实糖积累、相关酶活性与基因表达水平的影响,以及激素在其中发挥的作用,揭示不同砧木影响砂糖橘果实糖积累的生理与分子机制,为生产上柑橘砧木的使用提供理论依据。【方法】以砂糖橘为接穗,枳壳和红黎檬为砧木,测定果实成熟过程中糖含量及蔗糖代谢相关酶活性变化,并利用实时荧光定量 PCR对蔗糖代谢相关酶及蔗糖转运蛋白的基因表达模式进行分析;同时测定果实中脱落酸（ABA）水平和ABA生物合成中的限速酶9-顺式-环氧类胡萝卜素双加氧酶（NCED）的基因表达变化。【结果】砂糖橘果皮以积累还原糖为主,而果肉以积累蔗糖为主。在果实成熟期,枳壳砧砂糖橘果皮和果肉中可溶性总糖及蔗糖含量皆显著高于红黎檬砧的。枳壳砧砂糖橘果实中蔗糖合成酶（SS）活性更高。荧光定量PCR分析显示,在成熟期枳壳砧砂糖橘果皮与果肉中蔗糖合成酶基因SS2的表达量显著高于红黎檬砧的,而酸性转化酶基因CWINV1表达明显低于红黎檬砧的,且CWINV1表达量与蔗糖积累呈显著负相关（r=-0.648*）。同时,果皮与果肉中蔗糖转运蛋白基因SUC3表达随果实成熟呈上升趋势,且与可溶性总糖含量呈显著正相关（r=0.87*）,后期都为枳壳砧的显著高于红黎檬砧的。此外,随着果实的成熟两种砧木砂糖橘果皮中ABA含量逐渐升高,且与SS2、SUC3表达呈显著正相关,后期枳壳砧的果皮ABA含量显著高于红黎檬砧的;果肉中ABA含量变化波动不大,同样是枳壳砧的ABA水平更高。在果皮中,ABA生物合成中的限速酶NCED的基因NCED1表达趋势与ABA含量变化相似,呈上升趋势,后期枳壳砧的表达量明显高于红黎檬砧的;果肉中,枳壳砧的NCED1表达在后期明显上调,其表达量也显著高于红黎檬砧的。【结论】不同砧木对砂糖橘果实糖积累产生显著的影响。柑橘砧木主要通过影响砂糖橘果实蔗糖代谢酶的活性及其相关基因表达如SS2和CWINV1等来调节糖的代谢从而调控果实糖的积累;不同砧木也影响砂糖橘果实中内源激素ABA水平及果实糖的转运,从而影响果实糖积累。     

西葫芦果实CpNCED1基因3''端的克隆及其表达分析

采用RT-PCR和RACE-PCR的方法从西葫芦果实中克隆了ABA生物合成关键酶NCED基因保守片段及其3'端,命名为CpNCED1,并通过Real time RT-PCR方法分析了CpNCED1基因在果实发育和成熟过程中的表达。结果表明:CpNCED1基因的DNA序列及其推导的蛋白质序列与番茄、鳄梨及柑橘果实相同基因的同源性分别为61.90%(LeNCED1)、62.15%(PaNCED1)、62.55%(PaNCED3)、54.67%(CsNCED1)、56.23%(CsNCED2)和69.75%、65.74%、66.67%、68.75%、71.76%。果肉中CpNCED1基因表达共出现了3个高峰,分别在花后5 d,花后20 d及花后35 d,并分别与ABA积累相对应;果皮中CpNCED1表达在花后25 d达到最大值,而瓤和种子中CpNCED1的表达没有显著变化。果皮和种子中ABA含量与其CpNCED1的表达基本一致。西葫芦果实在生长发育过程中乙烯产生量很低,为非跃变型果实;呼吸高峰出现在花后20 d。上述结果说明,西葫芦果实的成熟主要和ABA调控有关,而乙烯对果实成熟的贡献很小。     

葡萄成熟过程中生理特征与β-葡萄糖苷酶基因的表达分析

为了解β-葡萄糖苷酶基因是否与葡萄果实成熟有关,从基因库中分离出了3个β-葡萄糖苷酶基因,分别命名为VυBG1,VυBG2和VυBG3,并对其表达进行了分析.结果显示:所获得的3个基因在葡萄浆果成熟过程中均有表达.果皮中,随着果实的成熟,VυBG1变化较平稳;VυBG2在转色期时略有降低,之后不断升高,在完熟期时达到最大值;VυBG3在成熟过程中先升高后降低,在转色期时达到高峰.果肉中,VυBG1和VBG2分别与果皮VυBG2和VυBG3变化趋势相似;VυBG3在转色前期和成熟期时表达较低,在完熟期达到最大值.种子中,VυBG1在转色前期出现最大值,之后迅速降低;随着果实的成熟,VυBG2不断上升;VυBG3在转色期时有个小峰,之后不断降低,在完熟期时表达量最低.综上,3个β-葡萄糖苷酶基因在葡萄成熟过程中的表达量和表达模式均不相同.其中果皮VυBG3和果肉VυBG2的变化趋势与ABA一致,可能在果实成熟过程中对ABA水平调节起作用.     

香蕉果实乙烯受体基因克隆及其表达特性

 【目的】分析香蕉果实成熟及贮藏冷害下乙烯受体基因的表达特性,探讨热处理（38℃,3 d）提高果实耐冷性与乙烯受体基因表达的关系。【方法】根据已报道的ETR基因的氨基酸保守序列设计引物,以香蕉果皮总RNA为模板,利用RT-PCR方法克隆香蕉的ETR cDNA,采用Northern杂交分析该基因的表达特征。【结果】香蕉果实在自然成熟进程中,两个基因在果皮和果肉中呈现不同的表达模式：果皮和果肉中Ma-ETR1的表达随果实成熟而逐渐减弱,而Ma-ERS3的表达仅在果实成熟后期略有增强;外源丙烯处理和38℃高温抑制果皮和果肉中Ma-ETR1的表达,却促进了Ma-ERS3的表达;低温促进果皮中Ma-ETR1和果肉中Ma-ERS3的表达,而38℃热处理3 d后则能抑制果皮中受低温诱导的Ma-ETR1表达的增强。【结论】外源丙烯和38℃高温正调控Ma-ERS3表达,负调控Ma-ETR1表达;38℃热处理3 d提高采后香蕉果实耐冷性与抑制低温诱导的果皮中Ma-ETR1表达的增强有关。     

番木瓜果实中芥子酶基因组织差异表达和酶活性研究

检测了番木瓜果实3个发育时期（Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ）的果皮（外果皮）、果肉（内果皮）及种子中芥子酶的活性,并通过RT-PCR分析CpTGG1、CpTGG2和CpTGG3三个番木瓜芥子酶基因在番木瓜果实各组织的差异性表达情况。结果表明,番木瓜果皮及种子中均有明显的芥子酶活性,但在果肉中无法检测出芥子酶活性;成熟后（Ⅲ期）番木瓜果皮的芥子酶活性相比未成熟前提高了6.6倍,而不同发育时期种子中的芥子酶并不表现出显著差异性。RT-PCR分析结果表明,番木瓜芥子酶基因在番木瓜果实中的表达存在显著时空差异性。其中,CpTGG1在番木瓜果皮及种子中均有表达,且表达量无明显差异,在果肉中完全无表达;CpTGG2在番木瓜果实的各个组织中均无表达;CpTGG3在果皮及种子中也均有表达,成熟果皮（Ⅲ期）和Ⅰ期种子中表达量比较强,并随着果实的发育成熟而呈现梯度变化。     

苹果果实GalDH和GalLDH基因的表达与AsA的关系

 【目的】进一步探明苹果果实是否具有抗坏血酸（AsA）合成的能力。【方法】从‘嘎拉’苹果果实中克隆AsA合成关键酶L-半乳糖脱氢酶（L-galactose dehydrogenase, GalDH）全长cDNA序列,检测它与另一合成酶L-半乳糖-1,4-内酯脱氢酶（L-galactono-1,4-lactone dehydrogenase, GalLDH）在苹果不同组织中的表达及酶活性与AsA含量的关系。【结果】克隆获得的苹果GalDH cDNA含有975 bp的完整开放阅读框,编码一条分子量为34.97kD、含324个氨基酸残基的蛋白质,登录号为GQ131419。在叶片和苹果果实不同组织中,均能检测到GalDH和GalLDH基因mRNA表达和活性,叶片高于果实,幼果高于成熟果,果皮高于果肉。同时,苹果果皮中的AsA含量受光的调控,二者在阳面果皮的表达和活性明显高于阴面果皮,而阳、阴面果肉间无明显差异。不同组织中的AsA含量与GalDH和GalLDH活性均呈显著正相关性。【结论】进一步证明了苹果果实自身具有经L-半乳糖途径合成AsA的能力,且合成可能是苹果果实AsA形成的主要决定因子。     

葡萄浆果发育期果皮、果肉和叶中內源激素含量的变化

为探讨葡萄浆果发育期间叶、果肉和果皮中内源激素的变化规律,以"巨峰"、"98-2"、"京亚"和"洛浦早生"为试材,采用酶联免疫吸附分析法(ELISA)测定了葡萄叶、果肉和果皮中IAA、GA3、ZR、ABA含量的变化。结果表明:4个葡萄品种在果实发育期叶中IAA、GA3、ZR、ABA的含量的变化差异较大;果肉IAA、GA3、ZR、ABA的含量变化趋势相似,都是一个单峰曲线,在花后30 d或40 d即果实缓慢生长期开始前后达到高峰,峰值的出现时期与成熟期的早晚无关;果皮中IAA、GA3、ZR的含量变化趋势相似,都有一明显的峰值,峰值的出现时期与果实发育期长短有关;果皮中ABA在果实发育的后期含量很高,但果实发育期长短不同高含量ABA所持续的时间不同。果皮中激素的变化与果实发育期长短比果肉中激素的变化与果实发育期长短的关系更密切。     

葡萄转色期乙醇处理对其成熟特性及内源激素含量的影响

以‘红地球’葡萄为试材,经1%氯化钙(CaCl_2)、15%乙醇(EtOH)中溶入1%氯化钙(CaCl_2)和15%乙醇(EtOH)处理后,检测乙醇处理对葡萄转色期果实成熟特性及葡萄果肉、种子和果皮中脱落酸(ABA)、生长素(IAA)、赤霉素(GA)、玉米素(ZR)和油菜素内酯(BR)五种内源激素含量的影响。结果表明:经15%乙醇(EtOH)中溶入1%氯化钙(CaCl_2)和15%乙醇(EtOH)处理后的‘红地球’葡萄果实,可溶性固形物含量(TSS)的积累被显著抑制,可滴定酸含量(TA)转色期后下降减缓,果皮的着色进程显著减缓,但可滴定酸含量成熟后期无明显变化。同时,种子ABA含量、BR含量和果皮ZR含量成熟后期峰值期延迟,果肉GA的含量显著降低,果实的成熟进程延缓。     

南国梨果实香气形成相关基因PuFS的克隆与表达分析

为挖掘我国特有的果实香气浓郁的梨资源,弄清其果实芳香成分及含量,并进而研究它们在梨果实中的代谢与调节机制。采用气相色谱质谱联用(GC-MS)技术,分析了我国部分秋子梨品种果实的香气成分,在基础上,以挖掘出的‘南果梨’为试材,采用RACE技术克隆了与其果实特异香气成分生物合成相关的α-法尼烯合成酶基因(PuFS),并采用半定量PCR(RT-PCR)技术分析了该基因在其果实不同发育时期和不同部位的时空表达规律。结果表明:‘荣香’、‘龙香’、‘香水’和‘晚香’的主要香气成分为醛类物质,‘南果’、‘大南果’和‘寒香’梨主要香气成分为酯类物质。在‘南果’梨中还检测出了高含量的α-法尼烯,而在其他品种中α-法尼烯相对含量较低或未检测到,这可能是‘南国’梨具有浓郁香气的主要原因;随着果实的成熟,PuFS基因在‘南果梨’果皮中的表达量呈逐渐下降的趋势,绿熟期表达量最高,商熟期表达量开始降低,完熟期表达量非常弱。而PuFS在3个时期果肉中的表达量均很弱,且差异不明显。总体上,PuFS基因在绿熟期的表达量高于商熟期和完熟期,在果皮中的表达量显著高于果肉。     

赤霉素对梨糖代谢及其关键酶基因表达的影响

为了研究赤霉素增强果实库强的机制,以‘翠冠’梨(Pyrus pyrifolia Nakai)为试材,研究了赤霉素(GA)处理下果实膨大过程中果糖、葡萄糖、蔗糖、山梨糖醇和可溶性总糖含量变化及山梨糖醇和蔗糖代谢关键酶基因转录水平的影响。结果表明,6-磷酸山梨糖醇脱氢酶基因(S6PDH)表达量前期较低,随着果实膨大逐渐升高,并且GA促进S6PDH在果实膨大中后期的表达;山梨糖醇代谢关键酶NAD-山梨糖醇脱氢酶基因(NAD-SDH)在果实膨大前期相对表达量很高,GA抑制了果实膨大前期NAD-SDH的表达。在蔗糖代谢中,酸性转化酶基因(SI)的表达量随着果实的膨大逐渐上升,在膨大中期达到高峰,然后开始下降,且果肉中SI表达量较果芯中的高,GA显著促进果实膨大期果实中SI的表达。果芯中蔗糖磷酸合成酶基因(SPS)表达量随着果实成熟而持续增加,果芯中表达水平较高于果肉中,GA显著提高果实膨大中后期SPS的表达水平。蔗糖合成酶基因(SS)在果实膨大前期和中期表达水平较高,GA处理抑制SS表达。GA处理显著提高梨果肉和果芯组织中的可溶性糖含量,GA诱导糖代谢相关酶的基因的表达,并在果芯和果肉中存在空间表达差异。     

油茶果实成熟过程中内源激素和矿质元素含量的变化特征

为了探明油茶果实发育成熟过程中内源激素和主要矿质元素的变化特征,以我国南方广泛栽培的普通油茶良种‘长林4号’为试材,对其果实发育后期成熟过程中内源激素ABA、IAA、GA3、ZR和矿质元素氮、磷、钾、锰含量进行了测定,明确其变化规律,并探讨其与油茶果实发育和种子油脂积累的相关性。结果表明:油茶果实发育后期果实质量的增长呈现‘S’型曲线,种子油脂的积累进程发生在果实迅速膨大生长之后。油茶果实中ABA和IAA含量较高,ZR和GA3的含量较低。盛花后255 d 之前,种子中的内源激素ABA、IAA和GA较高,随着果实的发育成熟,果皮中内源激素ABA、IAA和GA的含量则明显高于种子,而且其变化特征与果实的生长发育动态相吻合,油茶发育后期果实的膨大生长与果皮内源激素IAA、GA3和ZR的含量紧密相关。在油茶种子油脂积累之前(盛花后255 d),种子内源激素ABA含量出现高峰,ABA在油茶种子成熟和油脂积累过程中可能起到了重要的作用。此外,在油茶果实迅速膨大期,果皮中氮和磷元素的含量表现出上升趋势,种子中氮、磷、钾和锰元素的含量表现出迅速下降趋势,随着种仁含油率升高,果皮中氮、磷元素含量表现出下降趋势,钾和锰元素的含量升高,种子中钾和锰元素含量呈现出下降趋势,表明油茶果实发育后期成熟过程中,果皮和种子中矿质元素可能发生了相互转运。      

脱落酸(ABA)对苹果果实着色相关物质变化的影响

脱落酸（ABA）处理可以显著地提高寒光苹果果实的着色程度，同时使果实的一些重要品质提高。ABA处理促进了果皮花青苷合成和叶绿素降解，提高了果皮苯丙氨酸解氨酶（PAL）的活性。研究表明，ABA处理改变了果实成熟过程中内源激素含量之间的动态变化和平衡，即ABA处理降低了果实中赤霉素（GA3）的含量，改变了果实中生长素（IAA）与玉米素（ZR）之间的动态含量平衡。     

寒光苹果果实成熟期色素、糖、酸和激素含量的变化

以寒光苹果为试材,在果实成熟期对果皮几种色素及果实中可溶性糖、有机酸和几种内源激素含量进行测定。结果表明,寒光苹果果实在9月7～17日间果实中可溶性糖和果皮中花青素含量急剧增加,且两者在果实成熟期密切相关,同时果皮在花青素大量合成之前存在叶绿素的降解;果实着色和成熟受内源激素调控,成熟期果实中ZR呈下降趋势,成熟期前期果实中ABA含量持续上升,从而促进果实中乙烯的合成,促使果实着色和成熟。     

新疆红肉苹果果皮果肉呈色差异机理

【目的】比较新疆红肉苹果（Malus sieversii f.neidzwetzkyana(Dieck)Langenf）果皮、果肉花青苷成分、积累模式及花青苷合成相关基因的表达,以初步探明果皮、果肉呈色差异的机理。【方法】以新疆红肉苹果‘夏红肉’为试材,利用HPLC方法鉴定果皮和果肉的花青苷成分,通过QPCR测定果实着色过程中相关基因的表达,同时测定花青苷含量。【结果】果肉和果皮中花青苷的主要成分均为矢车菊素-3-半乳糖苷,但其积累模式明显不同,随着果实的发育,果皮中的花青苷含量呈下降趋势,果肉则呈相反趋势。与之对应的,花青苷合成结构基因的表达与花青苷积累模式基本一致。花青苷调控基因MsMYB10有其自身的表达特性,果皮中表达量逐渐升高,果肉中呈先升高后下降的趋势。【结论】新疆红肉苹果果皮果肉呈色差异主要与花青苷含量及其结构基因的转录表达水平有关,为进一步研究红肉苹果红色形成机理,培育具有观赏、鲜食与保健功能的苹果红肉新品种奠定了理论基础。     

桃PpNCED家族成员鉴定与表达特性分析

为探明不同NCED基因家族成员在桃果实成熟软化期间的表达特性,在桃基因组中鉴定出7个NCED成员。利用qRT-PCR的方法,检测出NCED成员的表达存在组织特异性。在不同耐贮性桃品种中, PpNCED2、 PpNCED3、 PpNCED4、 PpNCED5均表现出随着果实的膨大和成熟呈上调表达趋势,且在果实成熟期达到表达高峰。此外,外源ABA处理后,在贮藏早期显著促进PpNCED家族成员的表达,而在贮藏中后期显著抑制其表达。以上试验结果表明, PpNCED2、 PpNCED3、 PpNCED4、 PpNCED5可能参与桃果实成熟软化的调控,但因不同桃品种存在差异。