紫云英根瘤菌分子遗传学研究进展

总结了紫云英根瘤菌分子遗传学研究进展。这类根瘤菌的寄主范围较窄，早先根据互接种族概念将其定名为Rhizobium astragali。后来定名为Rhizobium huakuii。最近并入Mesorhizobium属，对大量菌株进行的16S和23SrDNAPCR-RFLP分析和代表菌株的部分16SrDNA碱基测序，揭示了7个不同基因型，表明这类菌具有遗传多样性。可以认为存在不同的种，它们都有质粒，数量1-5个，因菌株而异，可分为不同质粒型。共生基因常定位在最大的一个质粒上，即共生质粒，它们的结瘤基因具有独特结构。采用包括nodA,nodB。noC,nodD的苜蓿根瘤菌突变株进行基因互补，从紫云英根瘤蓖基因文库中获得了相应的转移接合子，这类结瘤基因的这种结构在7个基因型的菌株中都是一致的，说明结瘤基因的保守性。     

中国北方地区甘草根瘤菌表型及遗传多样性研究

【目的】了解中国北方地区甘草根瘤菌的生物多样性。【方法】采用表型数值分类、16S rDNA PCR-RFLP分析和BOX-PCR指纹图谱分析的方法对北方地区的甘草根瘤菌进行表型、遗传多样性分析。【结果】供试菌株在数值分类聚类分析中约85％的相似水平上产生2个表观群，有11株菌未与已知参比菌株聚群。16S rDNA PCR-RFLP分析表明，供试的20株菌共产生14种遗传型，表现出丰富的遗传多样性。BOX-PCR指纹图谱分析进一步证明与甘草共生的根瘤菌的基因组也具有多样性。【结论】在中国北方地区与甘草共生的根瘤菌在Sinorhizobium、Rhizobium和Mesorhizobium属中均有分布。     

紫云英根瘤菌的分离与鉴定

从采自福建各地紫云英的根瘤中分离出具有一般根瘤菌特征的菌株18株,在对其进行初步细菌学特性鉴定的基础上,利用16S rDNA进行序列分析,确定其系统发育地位.鉴定结果为:YX、Z3、GZ与ZK1为中慢生根瘤菌属Mesorhizobium菌种,B3、XZ、M6与百脉根中生根瘤菌Mesorhizobiumloti可能为同一菌属的不同变种;ZLH2为黄单孢菌属Xanthomonas菌种;M3、M10、ZK7、ZQH、B4、B7为土壤杆菌属Agrobacterium菌种;B6、B5、B1、Z1为根瘤菌属Rhizobium菌种.为了进一步考察各鉴定菌株的结瘤情况,利用琼脂试管法和水培法将部分菌株与紫云英闽紫品种(1号、5号、6号、7号)和80410411品系进行配对结瘤,研究结果不仅进一步阐明了紫云英根瘤菌的系统发育多样性,并且通过对比琼脂试管法和水培法在结瘤结果上的异同,为探究紫云英与不同根瘤菌结瘤能力的差异提供了一种简便可行的研究方法.     

辽宁营口地区锦鸡儿与树锦鸡儿根瘤菌遗传多样性研究

对锦鸡儿与树锦鸡儿根瘤菌进行研究,以了解其系统发育地位及遗传多样性。通过分离、纯化、回接结瘤测定共获得了31株待测菌,并采用16S rDNA PCR RFLP及BOX-PCR等方法对这些菌进行了研究。结果表明,31株待测菌的系统发育地位全部源于中间根瘤菌属（Mesorhizobium spp.）,并产生5种不同的rDNA图谱组合。BOX-PCR研究中,待测菌株呈现出较高的多样性,在80%相似性水平上,将待测菌归于17个不同的类型当中。     

外源共生基因对紫云英根瘤菌共生效率的影响

 将豌豆根瘤菌共生质粒pJB5JI、含紫云英根瘤菌共生基因的重组质粒pRaZ15及含苜蓿根瘤菌共生基因的重组质粒pRmSL26导入紫云英根瘤菌野生型菌株7653R，然后对3种转移接合子的共生固氮效率进行了比较全面的测定。结果表明：转移接合子7653R（pJB5JI）的共生固氮能力较出发菌株7653R大幅度提高，而且表现出较高的竞争结瘤能力，转移接合子7653R（pRmSL26）在固氮酶活性、植物干重及结瘤数方面亦显著高于对照菌株7653R；转移接合子7653R（pRaZ15）虽然在固氮酶活性及植物干重方面没有发现显著性差异，但结瘤数显著减少。     

柠条锦鸡儿根瘤菌及其共生固氮基因多样性

为研究西北干旱地区豆科植物柠条锦鸡儿(Caragana korshinskii)根瘤菌的系统发育地位及共生基因多样性,对从甘肃省分离得到的菌株进行16SrRNA PCR-RFLP和序列分析,构建系统发育树,确定其分类地位,并通过分析共生基因nodA和nifH,确定种群共生类型。结果表明:从柠条根瘤内分离到64株菌,共有7个PCR-RFLP 16SrRNA基因型,主要归属于Ensifer(占分离总数43.8%)、Mesorhizobium(31.2%)、Rhizobium(25%),其中,Ensifer为主要类群,约占34.4%。共生基因nodA和nifH与Ensifer和Mesorhizobium模式菌株同源性较高,与16SrRNA基因确定的根瘤菌分类地位相比,发现部分共生基因与16S rRNA基因确定的分类地位不同,揭示了共生基因横向转移现象的发生。     

紫云英根瘤菌结瘤因子过表达工程菌株的建构

将紫云英结瘤调节基因nodD1整合到多拷贝质粒PRK29O上，通过三亲株杂交导人紫云英根瘤菌Ra159中，利用根毛变形实验，检测重组菌株与野生菌株产生结瘤因子的差异，发现重组菌株产生的结瘤因子提高10倍，为分离、鉴定结瘤因子打下基础。     

郑州草坪白三叶草根瘤菌的分离与分子鉴定

【目的】为研究郑州市区草坪白三叶草根瘤菌的遗传多样性。【方法】实验采用包括16S rDNA及IGS PCR-RFLP和16S rDNA基因序列分析方法。【结果】该研究从郑州市4个不同采样地点的草坪中采集白三叶草根瘤,并分离得到根瘤菌40株;经16S rDNA PCR-RFLP分析,初步确定所有供试菌株属于同一个属。而IGS PCR-RFLP分析将供试菌株分为四个类群,且来自郑州大学的供试菌株具有更加丰富的遗传多样性。对不同IGS型代表菌株的16S rDNA基因序列分析结果与16S rDNA PCR-RFLP的结果一致,表明所有供试菌都属于根瘤菌属(Rhizobium)。【结论】一共分离得到根瘤菌40株,它们都属于根瘤菌属,且分离自郑州大学的根瘤菌具有更加丰富的多样性。     

枣庄地区豌豆根瘤菌遗传多样性分析

为揭示枣庄市山亭区豌豆种植基地的豌豆共生根瘤菌的遗传多样性,本研究采取了土壤样品采集、盆栽捕捉豌豆根瘤菌、分离、纯化等方法获得根瘤菌菌株,然后采用 IGS 基因的PCR-RFLP分析、16S rRNA 基因序列测定及系统发育分析、持家基因（atpD、recA、glnII）多位点序列分析,以及结瘤基因nodC系统发育分析等,对分离纯化得到的55株豌豆根瘤菌进行分类鉴定。结果表明,获得的根瘤菌共包含3种不同的IGS酶切类型,经过对代表菌株的16S rRNA 基因进行系统发育分析,分离获得的豌豆根瘤菌可以被鉴定属于根瘤菌属（Rhizobium）,进一步经持家基因多位点序列分析被鉴定为Rhizobium anhuiense和Rhizobium sophorae。该研究丰富了对该地区豌豆共生根瘤菌遗传多样性的认识。     

湖南益阳地区紫云英根瘤菌的遗传多样性研究

从湖南省益阳市南县和大通湖区的土壤样品中捕获紫云英根瘤菌。根据基因内间隔区(intergenic spacer,IGS)限制性片段长度多态性聚合酶链式反应(restriction fragment length polymorphism-polymerase chain reaction, PCR-RFLP),将分离菌株分组为不同的IGS类型,进一步对类型的代表菌株进行16S rRNA基因、持家基因(atpD、glnII)和共生基因(nodC、nifH)的系统发育分析。结果表明,分离获得的68株根瘤菌,区分为6种不同的IGS酶切类型,挑选出8株供试代表菌株通过16S rRNA基因序列的系统发育分析以及多位点序列分析(multilocus sequence analysis, MLSA),被鉴定为2个种群Mesorhizobium jarvisii和庆笙中慢生根瘤菌(Mesorhizobium qingshengii)。     

华癸中生根瘤菌的分离、回接及质粒检测

从华中农业大学的水稻田中采集的紫云英根瘤中分离到62株华癸中生根瘤菌,对其中的57株进行了回接结瘤试验,供试菌株均能正常结瘤.并对其中的44株进行质粒检测,13株含3个质粒,21株含2个质粒,7株含1个质粒,3株不合质粒,质粒分子量范围约为174～510kb,为研究华癸中生根瘤菌内源性质粒的相互作用及其共生固氮效应奠定了良好的基础.     

参与紫云英共生固氮的1个上调表达结瘤素基因AsB6的分离与鉴定

基于接种华癸中慢生根瘤菌(Mesorhizobiumhuakuii)7653R的紫云英(Astragalus sinicusL.)感染根与未接种对照根在转录水平上的差异,利用抑制差减杂交技术(suppression subtractive hybridization,SSH),建立了紫云英结瘤固氮过程中的差异表达cDNA文库,共获得527个有效克隆,其中增强或特异性表达的上调文库中包含341个克隆,抑制表达的下调文库包含186个克隆。对其中的1个上调表达cDNA克隆AsB6利用RACE(rapid amplification of cDNAends)方法获得了其基因全长序列,利用BLAST在线软件和GenBank,Gen-Bank EST和Tigr Porcine EST等数据库进行同源序列比较,表明AsB6与苜蓿的β-酮酯酰合成酶及依赖于SAM(S-adenosgl methiomine,S-腺苷蛋氨酸)的羧甲基转移酶具有66%的同源性,同时利用实时荧光定量PCR研究了该基因的时空表达特征。结果显示,接种根瘤菌7653R后,在紫云英感染根和根瘤中该基因的表达量显著增强,且在接种后根瘤形成早期和固氮中晚期表达...     

费氏中华根瘤菌(Sinorhizobium fredii)质粒复制基因repC序列多样性的研究

采用质粒快速检测法从供试33株费氏中华根瘤菌中分别检测出2～4个内源大质粒。用根据豌豆根瘤菌的repC基因设计1对引物RCI和RC3,从供试菌株及3株华癸中生根瘤菌和1株大豆慢生根瘤菌中扩增得到repC基因片段,证明在费氏中华根瘤菌中广泛存在repC基因。通过对扩增产物的测序,并与已报道的repC基因序列进行聚类分析,发现供试菌株可分为2个群,群a和群b,群内十分保守,但群间差异明显;其中群b的序列与已知类型的差异明显。     

华癸中慢生根瘤菌7653R SraG sRNA的共生固氮功能

基于前期对华癸中慢生根瘤菌(Mesorhizobium huakuii)7653RsRNA(small non-coding RNA,sRNA)的生物信息学预测,经Northern blot验证获得SraGsRNA。本研究采用RACE与转录组高通量深度测序确定了SraG全长,并分别利用RNAfold软件和TargetRNA软件预测了SraG二级结构和靶位点,进而构建了M.huakuii 7653R的SraG插入失活突变体(M.huakuii SraGmut),并对突变体接种紫云英的共生表型进行了检测。盆栽试验结果表明,与野生型菌株M.huakuii 7653R相比,接种突变株M.huakuii SraGmut的固氮能力显著下降,突变株固氮酶活性下降约40%,植株鲜质量和根瘤数目也显著降低。结果表明,SraG的功能与M.huakuii 7653R的共生固氮过程相关,作为sRNA可能参与根瘤菌的共生固氮调控过程。     

紫云英根瘤菌7653R基因文库的5个互补结瘤菌株的重组质粒分析

对紫云英根瘤菌７６５３Ｒ基因文库的５个重组质粒，即ｐＮＲ１０２，ｐＮＲ１０３，ｐＮＲ１０８、ｐＮＲ２０３，ｐＮＲ２１３进行各种内切酶的酶切分析。结果证实它们均含有１．７ｋｂ的ＥｃｏＲⅠ－ＢｇｌⅡ双酶切片段和１．９ｋｂ的ＥｃｏＲⅠ－ＳａｃⅠ双酶切片段，而ｐＮＲ２１３的外源片段最大，包含有其余质粒所具有的各种片段。以ｐＮＲ１０８的外源片段作探针，进行ＤＩＧ杂交，发现探针与其余４个重组质粒的外源片段有强     

华癸根瘤菌在非豆科植物根圈定殖能力的研究

本文首镒报道了华癸根瘤菌在水稻,小麦,油菜和棉花４种非豆科作物根圈定的定殖能力。分别通过盆栽试验并采用外源标记基因特异性检测技术进行检测,研究发现华癸根瘤菌不但可以在这４种非豆科植物根圈定殖,而且还能进入根内,其数量可达１０＾３个／ｇ以上。接种华癸根瘤菌对油菜和棉花根系的生长有一定影响,并能显著促进水稻的生长,为扩大华癸根瘤菌的应用范围展示了诱人的前景。     

华癸中生根瘤菌共生基因exo56的克隆和功能初步分析

利用Tn5-sacB转座子随机插入突变的方法,从Mesorhizobium huakuii 7653R的400个突变株中筛选获得1个共生缺失突变株HK56.使用热不对称交错PCR(TAIL-PCR)的方法从M.huakuii 7653R中克隆了exo56序列.exo56全长969 bp,编码322个氨基酸,其编码产物Exo56与糖基转移酶2个家族的成员有很高的相似性,糖基转移酶为胞外多糖合成所必需.盆栽结果表明,ezc56基因突变株只能形成少量的不固氮根瘤.     

用Tn5标记带发光酶基因的华癸根瘤菌(Mesorhizobium huakui)7653R质粒

在ｐＲＫ２０７３的辅助作用下,通过三亲本接合转移,将Ｔｎ５（ｓａｃＢ－ｌｕｘＡＢ）插入华癸根瘤菌７６５３Ｒ菌株基因组中。将３２００个Ｔｎ５标记菌株影印到含有８％蔗糖的ＹＭＡ平板,检测这些菌株的发光酶活性和新霉素抗性。共获得８个菌株,其选择标记消失。质粒检测发现其共生质粒有不同程度的缺失甚至消除。结瘤实验证明,所有共生质粒部分缺失（有的缺失达１／３）的菌株依然结瘤。经用ｌｕｘＡＢ探针的分子杂交证实,８个菌株中有３个对应的标记菌株其Ｔｎ５插在共生质粒上。