紫云英根瘤菌结瘤因子的生物学功能

利用紫云英种子浸提物诱导紫云英根瘤菌野生型菌株７６５３Ｒ产生结瘤因子（ＮｏｄＲｈ）。根毛卷曲试验表明，ＮｏｄＲｈ能诱导产生各种形式的根毛变形、卷曲和分枝，并且能诱导形成典型的“牧羊拐”状卷曲，与菌体正常侵染所引起的变化相同。同时发现，相对较高浓度的结瘤因子ＮｏｄＲｈ能抑制根的生长，形成粗短根。在制备紫云英根瘤菌接种剂的过程中，利用种子浸提物诱导产生结瘤因子，能显著提高根瘤菌的侵染结瘤能力。     

华癸中生根瘤菌(Mesorhizobium huakuii)研究进展

综述了华癸中生根瘤菌(Mesorhizobium huakuii)遗传多样性、质粒多样性、质粒的功能、结瘤因子、结瘤基因、胞外多糖等方面的研究进展。这类菌只能在紫云英上结瘤,1997年并入Mesorhizobium。选取大量菌株进行REP-PCR、16S和23S rDNAPCR-RFLP等分析,揭示其分为16种16S rDNA基因型。选用不同16S rDNA基因型的部分代表菌株进行部分16S rDNA测序。能够在紫云英上结瘤的根瘤菌可以分为2个类群。表明这类菌具有遗传多样性,存在不同的种。它们多数含共生质粒,共生质粒定位于最大或次大质粒上,质粒数1~5个不等,其分子量范围在53~906 kb之间。质粒缺失菌株表现为不结瘤(Nod-)和结瘤而不固氮(Nod ,Nif-)。某些质粒缺失还影响LPS合成、抗酸性、竞争结瘤能力。其结瘤因子能诱导紫云英根毛变形,它们的结瘤因子结构类似于苜蓿根瘤菌的结瘤因子。它们的结瘤基因具独特性,nodA与nodBC分隔一定距离,且具有保守性。它们产生的胞外多糖在侵染结瘤过程中发挥重要作用。     

外源共生基因对紫云英根瘤菌共生效率的影响

 将豌豆根瘤菌共生质粒pJB5JI、含紫云英根瘤菌共生基因的重组质粒pRaZ15及含苜蓿根瘤菌共生基因的重组质粒pRmSL26导入紫云英根瘤菌野生型菌株7653R，然后对3种转移接合子的共生固氮效率进行了比较全面的测定。结果表明：转移接合子7653R（pJB5JI）的共生固氮能力较出发菌株7653R大幅度提高，而且表现出较高的竞争结瘤能力，转移接合子7653R（pRmSL26）在固氮酶活性、植物干重及结瘤数方面亦显著高于对照菌株7653R；转移接合子7653R（pRaZ15）虽然在固氮酶活性及植物干重方面没有发现显著性差异，但结瘤数显著减少。     

紫云英根瘤菌高效固氮菌株的选育

用常规方法选育出紫云英根瘤高效固氮菌株２４号，２５号，１３０号，它们具有结瘤早，结瘤能力强，固氮量高的优点，与紫云英拌种可提高产量１８．６％－２２．６％比现行菌株３８Ｄ增产９．４％－１３．２％。     

紫云英根瘤菌不同菌株间结瘤竞争能力的比较

通过竞争结瘤试验研究紫云英根瘤菌不同菌株间的竞争结瘤能力,以紫云英宁波大桥品系为宿主植物,7株分离自不同生境紫云英根部瘤体内的菌株与中慢生华癸根瘤菌7653R为研究对象,采用单独接种、与7653R菌株1∶1混合接种方式,在30 d时采样,统计根瘤数量、根瘤质量、不同菌株的占瘤率、定殖能力等。结果发现,紫云英根瘤菌2号菌株的竞争能力与7653R相当,其他菌株的竞争性都不同程度地弱于7653R,尤其是1号菌株的定殖能力最弱,仅是7653R占瘤率的9%。在同时含有2种根瘤菌的瘤体内,7653R和竞争菌株的数量比例相近。不同生境根瘤菌的竞争结瘤能力存在差异,试验同时获得了1株与经典菌株7653R竞争能力相当的紫云英根瘤菌菌株。     

紫云英根瘤菌分子遗传学研究进展

总结了紫云英根瘤菌分子遗传学研究进展。这类根瘤菌的寄主范围较窄，早先根据互接种族概念将其定名为Rhizobium astragali。后来定名为Rhizobium huakuii。最近并入Mesorhizobium属，对大量菌株进行的16S和23SrDNAPCR-RFLP分析和代表菌株的部分16SrDNA碱基测序，揭示了7个不同基因型，表明这类菌具有遗传多样性。可以认为存在不同的种，它们都有质粒，数量1-5个，因菌株而异，可分为不同质粒型。共生基因常定位在最大的一个质粒上，即共生质粒，它们的结瘤基因具有独特结构。采用包括nodA,nodB。noC,nodD的苜蓿根瘤菌突变株进行基因互补，从紫云英根瘤蓖基因文库中获得了相应的转移接合子，这类结瘤基因的这种结构在7个基因型的菌株中都是一致的，说明结瘤基因的保守性。     

刺槐根瘤菌结瘤因子的初步研究

以根毛变形试验为检测手段，对刺槐与刺槐根瘤菌共生过程中的信号识别作用进行了研究。结果表明，经刺槐种子浸提物诱导后，刺槐根瘤菌野生型菌株８７１１能够产生结瘤因子。该结瘤因子能诱导刺槐根毛发生变形，且变形情况与菌体正常侵染所引起的变化相同。因此，可以把刺槐根毛变形作为检测结瘤因子存在的依据。     

紫云英根瘤菌的分离与鉴定

从采自福建各地紫云英的根瘤中分离出具有一般根瘤菌特征的菌株18株,在对其进行初步细菌学特性鉴定的基础上,利用16S rDNA进行序列分析,确定其系统发育地位.鉴定结果为:YX、Z3、GZ与ZK1为中慢生根瘤菌属Mesorhizobium菌种,B3、XZ、M6与百脉根中生根瘤菌Mesorhizobiumloti可能为同一菌属的不同变种;ZLH2为黄单孢菌属Xanthomonas菌种;M3、M10、ZK7、ZQH、B4、B7为土壤杆菌属Agrobacterium菌种;B6、B5、B1、Z1为根瘤菌属Rhizobium菌种.为了进一步考察各鉴定菌株的结瘤情况,利用琼脂试管法和水培法将部分菌株与紫云英闽紫品种(1号、5号、6号、7号)和80410411品系进行配对结瘤,研究结果不仅进一步阐明了紫云英根瘤菌的系统发育多样性,并且通过对比琼脂试管法和水培法在结瘤结果上的异同,为探究紫云英与不同根瘤菌结瘤能力的差异提供了一种简便可行的研究方法.     

紫云英根瘤菌营养缺陷型的筛选

微生物营养缺陷型是一种突变体。它可以用来进行生物测定,研究各种物质的代谢途径和遗传分析等。本实验的目的是筛选紫云英根瘤菌的营养缺陷型作为紫云英根瘤菌的标记菌株,以用于研究紫云英根瘤菌结瘤、固氮基因的结构及其遗传特性。为此,我们以亚硝酸作为诱变剂,处理出发菌株Ra6,并通过选择性培养基筛选出营养缺陷型。     

紫云英根瘤菌质粒的研究——Ⅱ紫云英根瘤菌(Rhizobium astragali)经高温和吖啶橙处理后结瘤和固氮突变株的产生和质粒的消除

用高温和吖啶橙处理紫云英根瘤菌菌株7653~r和S_(52)分别获得了表型性状为不结瘤(Nod~-)和结瘤而不同氮(Nod~+,Fix~-)突变株。与亲本菌株具有的两条大质粒带相比,上述突变株均丢失了其中的一个较大的质粒。这一结果初步表明:菌株7653~r的nod基因和S_(52)的nif或fix基因可能定位在已消除的那一个大质粒(pRa7-2和pRa5-2)上。     

旌德县紫云英种植小区对比试验

旌德县紫云英种植小区对比试验结果表明，常规施肥能显著提高绿肥产量；常规施肥＋根瘤菌剂拌种能显著提高紫云英单株根瘤茵数和结瘤率，显著提高绿肥产量并能提高净收益。     

紫穗槐丛枝菌根(AM)根系分泌物诱导根瘤菌结瘤因子及作用研究

为了进一步揭示丛枝菌根(AM)真菌促进紫穗槐结瘤数量及提高固氮能力的机制,试验采用高效液相色谱法(HPLC)并结合结瘤因子生物检测法,研究了菌根化紫穗槐苗木根系分泌物对根瘤菌结瘤因子的诱导效果,以及结瘤因子紫穗槐苗木生长的作用。结果表明,菌根分泌物能够显著诱导根瘤菌产生结瘤因子,HPLC检测图谱33min出现的色谱峰物质能够诱导紫穗槐的根毛产生变形;结瘤因子回接盆栽紫穗槐实生苗结果表明,在灭菌基质上播种的紫穗槐苗木能够产生根瘤原基并结瘤,且双接种结瘤因子和AM真菌处理的紫穗槐苗木产生根瘤原基的数量显著高于单独接结瘤因子处理的苗木;结瘤因子提高了紫穗槐的菌根侵染率,结瘤因子的量越大,AM真菌对紫穗槐的侵染效果越显著;结瘤因子与AM真菌混合接种能显著提高紫穗槐苗木的生物量。     

抗链霉素紫云英5号突变菌株的选育

我省种植紫云英已有几十年的历史,由于各地生产水平不同,产量相差悬殊。而要提高紫云英产量,除了做好田间管理之外,更重要的是要有相适应的感染力强、固氮力强的优良菌株与之共生,形成较多的有效根瘤,才能提高植株或籽实的产量。这就需要接种栽培,但是在老区接种是否有效果?拿什么标准衡量?过去是用鲜草或籽实的产量来衡量接种效果的,并未追究人工接种根瘤菌的实际结瘤效果。本课题主要针对这一问题进行了抗药性突变菌株的选育,以此来标记人工接种菌株的感染力。我们通过几年的工作,初步选出了抗链霉素紫云英根瘤菌(Rhizobium astragali)5号菌株为感染力强和固氮力强的优良菌株。     

紫云英根瘤菌的不结瘤(Nod~-)突变

以紫云英根瘤菌A106L(A106菌系的一株)为出发菌株,在正常培养条件下得到的170个分离系中,有19个分离系对紫云英无结瘤能力;在吖啶橙处理条件下得到的150个分离系中有40个无结瘤能力;在热处理条件下得到的165个分离系中有30个无结瘤能力。常规形态,生理鉴定和抗原一一抗血清凝集试验表明这些不能结瘤的分离系都是A106L的后代,是A106L的Nod~-突变体。由于分离系总数不多,以及吖啶橙与热处理的方法多样,得不出两种处理能显著提高Nod~-突变率的统计分析数据。从所得Nod~-突变分离系中,随机抽出20个分离系,考查它们不能在紫云英根上结瘤的症结所在,发现障碍全部在结瘤过程的早期,即不能使根毛“卷曲”(Cur~R),不能侵入根毛形线成入线(Thr~-)。试验还表明,Nod~-突变与对链霉素和卡那霉素(10微克/毫升)的自然抗性的丧失同时发生:Nod_-~ ·Str~R·Kan~R一→Nod 一·Str~R·Kan~R。     

高效大豆根瘤菌基因工程菌株NK132的建选

利用三亲本杂交方法，将大豆根瘤菌ＨＮ３２所携带的增效重组质粒ｐＨＮ３２引入到三江平原土著大豆根瘤菌ＣＨＪ１３１３中，构建和选育出基因工程菌株ＮＫ１３２。在水培，盆载栽和田间小区试验中，ＮＫ１３２菌株的结瘤数量和植株干，鲜重及大豆子实产量明显高于出发菌株和对照。     

华癸中生根瘤菌的分离、回接及质粒检测

从华中农业大学的水稻田中采集的紫云英根瘤中分离到62株华癸中生根瘤菌,对其中的57株进行了回接结瘤试验,供试菌株均能正常结瘤.并对其中的44株进行质粒检测,13株含3个质粒,21株含2个质粒,7株含1个质粒,3株不合质粒,质粒分子量范围约为174～510kb,为研究华癸中生根瘤菌内源性质粒的相互作用及其共生固氮效应奠定了良好的基础.     

苜蓿根瘤菌转Sm nifA基因研究初报

外源固氮调节基因nifA的导入对根瘤菌的结瘤固氮效率有较明显的促进作用.首先构建带有Sm nifA基因的重组质粒,再利用三亲本杂交技术将重组质粒转移至苜蓿根瘤菌XM-1中,得到组成型表达Sm nifA基因的菌株,侵染苜蓿后,植株鲜重、干重、含氮量、结瘤数、固氮酶活等指标均优于原始出发菌.     

重组大豆根瘤菌株与大豆品种组合的试验研究

用重组大豆根瘤菌株HN01(102DL)、GR3(102DL)、TA11(PM5)、TA11(3QD)及出发菌株HN01、GR3、TA11、YC4,对照菌株HN32与8个大豆品种进行了"菌株-品种"的共生固氮试验.结果表明1、快生型出发菌株HN01、YC4与重庆1号大豆品种为菌株与品种最优组合,它们的侵染期早,结瘤总数最多,固氮性强;重组菌株HN01(102DL)、GR3(102DL)、TA11(3QD)、TA11(PM5)与自贡5号组合的固氮性均高;而GR3菌株与供试8个大豆品种的结瘤数、固氮量均较低,表明该菌株对本试验大豆品种的共生有效性差.2、重组菌株TA11(PM5)与重庆1号大豆品种产量比其它菌株高,与对照(不接种)相比,产量达极显著水平.     

快生型大豆根瘤菌的研究——Ⅲ.湖北ZA1等11个菌株的互接种族关系试验

前人的研究已经指出,快生型大豆根瘤菌可超越大豆族的范围,在豇豆和绿豆上结瘤,但不与三叶草、草木樨、紫云英、碗豆、菜豆和花生等豆科植物结瘤共生。为了全面了解湖北省土壤中分离的11个菌株的性能,继研究其生理生化特性,固氮活性和竞争性能之后,又进了本项试验,兹简报如后。材料和方法11株快生型大豆根瘤菌由本校生物固氮研究室从湖北等地土壤中分离。紫云英根瘤菌、苜蓿根瘤菌、三叶草根瘤菌、羽扇豆根瘤菌均由我校微生物专业菌种保藏室提供。花生根瘤菌97-1由中国农科院油料作物研究所提供。碗豆根瘤菌NO300,菜豆根瘤菌NO3622-15由王长霖同志提供(引自英国洛桑试验站)。     

费氏中华根瘤菌共生质粒缺失对结瘤和固氮能力的影响

费氏中华根瘤菌（Sinorhizobium fredii)HN01在大豆上的结瘤表现为非品种专一性，其共生质粒pSymHN01b在诱动转入另一非品种专一性结瘤菌株WWG18SR后，获得的转移接合子WWG18SRN1中的pSymHN01b缺失约40b。盆栽结瘤试验证明，pSymHN01b的缺失导致WWG18SRN1由非品种结瘤菌株转变为大豆品种专一性结瘤菌株，并失去了在所有供试的大豆品种上固氮的能力。在获得了完整的pSymHN01b的转移接合子WWG18SRN2存在时，WWG18SRN1在黑农33上的结瘤受到抑制。