外源共生基因对紫云英根瘤菌共生效率的影响

 将豌豆根瘤菌共生质粒pJB5JI、含紫云英根瘤菌共生基因的重组质粒pRaZ15及含苜蓿根瘤菌共生基因的重组质粒pRmSL26导入紫云英根瘤菌野生型菌株7653R，然后对3种转移接合子的共生固氮效率进行了比较全面的测定。结果表明：转移接合子7653R（pJB5JI）的共生固氮能力较出发菌株7653R大幅度提高，而且表现出较高的竞争结瘤能力，转移接合子7653R（pRmSL26）在固氮酶活性、植物干重及结瘤数方面亦显著高于对照菌株7653R；转移接合子7653R（pRaZ15）虽然在固氮酶活性及植物干重方面没有发现显著性差异，但结瘤数显著减少。     

gusA基因检测慢生花生根瘤菌竞争性的研究

采用大肠杆菌和根瘤菌接合的方法,将gusA标记基因分别导入了2株慢生型花生根瘤菌Spr3-5和Spr4-5中。结果表明,gusA基因在2株慢生型花生根瘤菌Spr3-5和Spr4-5中可以有效表达;对出发菌株和标记菌株的代时测定结果表明,二者之间没有显著差异;在标记菌株与出发菌株等量接种的前提下,比较了二者的竞争结瘤能力,结果表明,标记菌株形成的根瘤(蓝瘤)的占瘤率与出发菌株差异不显著;为了研究标记菌株与出发菌株的固氮有效性,测定了标记菌株与出发菌株各自共生植株的干重、全氮和叶绿素含量,结果表明,标记菌株与出发菌株的这3项指标之间没有显著差异。这说明利用gusA基因研究慢生根瘤菌的竞争结瘤能力是可行的。     

快生型花生根瘤菌株与土著性根瘤菌竞争结瘤能力的探讨

试验结果表明：灰棕紫泥土中的土著性花生根瘤菌数量为１０４个／克干土,并与土壤有机质、含氮量呈极显著相关,而与花生种植年限没有显著相关性;土著性根瘤菌的浸染结瘤能力强,但固氮效率低;接种菌株与土著菌的竞争力差异在于菌株本身优良特性。快生型８５─７菌株占瘤率,固氮酶活性均高,花生荚果增重达显著,极显著水平,竞争力最强;快生型花生根瘤菌株的竞争结瘤性能与花生品种的亲合性有关;不同花生品种根系中的氨基酸含量不同,对菌株占瘤率有影响。     

紫云英根瘤菌的分离与鉴定

从采自福建各地紫云英的根瘤中分离出具有一般根瘤菌特征的菌株18株,在对其进行初步细菌学特性鉴定的基础上,利用16S rDNA进行序列分析,确定其系统发育地位.鉴定结果为:YX、Z3、GZ与ZK1为中慢生根瘤菌属Mesorhizobium菌种,B3、XZ、M6与百脉根中生根瘤菌Mesorhizobiumloti可能为同一菌属的不同变种;ZLH2为黄单孢菌属Xanthomonas菌种;M3、M10、ZK7、ZQH、B4、B7为土壤杆菌属Agrobacterium菌种;B6、B5、B1、Z1为根瘤菌属Rhizobium菌种.为了进一步考察各鉴定菌株的结瘤情况,利用琼脂试管法和水培法将部分菌株与紫云英闽紫品种(1号、5号、6号、7号)和80410411品系进行配对结瘤,研究结果不仅进一步阐明了紫云英根瘤菌的系统发育多样性,并且通过对比琼脂试管法和水培法在结瘤结果上的异同,为探究紫云英与不同根瘤菌结瘤能力的差异提供了一种简便可行的研究方法.     

华癸中慢生根瘤菌7653R SraG sRNA的共生固氮功能

基于前期对华癸中慢生根瘤菌(Mesorhizobium huakuii)7653RsRNA(small non-coding RNA,sRNA)的生物信息学预测,经Northern blot验证获得SraGsRNA。本研究采用RACE与转录组高通量深度测序确定了SraG全长,并分别利用RNAfold软件和TargetRNA软件预测了SraG二级结构和靶位点,进而构建了M.huakuii 7653R的SraG插入失活突变体(M.huakuii SraGmut),并对突变体接种紫云英的共生表型进行了检测。盆栽试验结果表明,与野生型菌株M.huakuii 7653R相比,接种突变株M.huakuii SraGmut的固氮能力显著下降,突变株固氮酶活性下降约40%,植株鲜质量和根瘤数目也显著降低。结果表明,SraG的功能与M.huakuii 7653R的共生固氮过程相关,作为sRNA可能参与根瘤菌的共生固氮调控过程。     

Bradyrhizobium japonicum工程菌株HN32田间占瘤率的测定

应用特定根瘤菌株接种豆科植物与土著根瘤菌竞争结瘤,在竞争中特定根瘤菌结瘤数占总瘤数的百分数称为占瘤率。这是分析特定根瘤菌株产生增产效果的重要因素。测定占瘤率的方法,主要有抗性标记技术,荧光抗体技术,酶连免疫技术,分子杂交技术和红外线指纹图谱法等,每种方法都有其优缺点。本研究利用HN32菌株的四环素抗性测定技术和α—~(32)P标记的pHN32为探针进行的DNA/DNA杂交技术来考查田间接种大豆根瘤菌工程菌株HN32的占瘤率。     

豌豆根瘤菌ohrB基因的抗氧化和共生固氮表型

采用基因敲除构建豌豆根瘤菌ohr B基因突变株,研究突变株的抗氧化和共生固氮表型。结果表明:ohr B基因不影响菌株在自生培养条件下的生长能力,但对氢过氧化枯烯(cumene hydroperoxyde,Cu OOH)、过氧化氢(H2O2)、次氯酸钠(Na Cl O)等氧化物敏感,且在Cu OOH胁迫下,相比野生型菌株,突变株的存活率显著下降。荧光定量RT-PCR结果显示,豌豆根瘤菌ohr B基因表达不受H2O2诱导,且ohr B基因的缺失对其他抗氧化基因的表达没有影响。共生实验表明,ohr B基因对根瘤菌共生固氮能力及根际定殖能力没有影响,但在7 d瘤龄的豌豆根瘤类菌体中表达水平显著提高,并对根瘤菌结瘤能力有影响。ohr B基因虽对豌豆根瘤菌的自生生长、共生固氮、根圈定殖没有影响,但在抗氧化及竞争结瘤中发挥重要作用。     

耐酸苜蓿根瘤菌在酸性黄壤中的定殖研究

在酸性黄壤中接种3株耐酸苜蓿根瘤菌91522,91512,91532,并施用不同浓度的Ca2+,比较研究了其在苜蓿根际土壤中的定殖动态与水平,进而分析了施Ca2+和接种耐酸苜蓿根瘤菌对紫花苜蓿共生效应的影响.结果表明:接种3种耐酸苜蓿根瘤菌均能在酸性土中定殖,且定殖动态基本一致,以接种菌株91512和91532的效果最好.施Ca处理对根瘤菌定殖影响不明显,施5 mmol/L Ca2+时,定殖效果最佳.接种耐酸苜蓿根瘤菌对苜蓿植株瘤重、根鲜重、株高、植株上部鲜重、全氮含量的影响显著.施Ca2+对植株根鲜重、株高和上部鲜重的影响达到了极显著水平,对瘤重的影响显著.施用5 mmol/L Ca2+,苜蓿生长和结瘤的效果最好,表明在酸性黄壤中,施用适当浓度的Ca2+可以提高紫花苜蓿的产量和品质.     

根瘤菌接种方式对复播大豆生长及结瘤的影响

[目的]研究不同根瘤菌接种方式对复播大豆生长及结瘤效果.[方法]以前期分离、鉴定、纯化的3株根瘤菌菌株为材料,对新疆南疆地区复播大豆新大豆8号进行种肥、随水滴施、拌种等接种方式试验,测定其根瘤数、根瘤干重、植株性状、产量及其构成因素的变化.[结果]接种根瘤菌均能促进大豆根系结瘤和生长发育,根瘤菌SN7-2促进效果最明显...     

ACC脱氨酶对大豆快生根瘤菌及苜蓿中华根瘤菌共生固氮与竞争结瘤的影响

利用大肠杆菌S17-1与根瘤菌进行两亲本接合转移,将苜蓿中华根瘤菌Sm1021中的ACC脱氨酶基因导入大豆快生根瘤菌HH103,在苜蓿中华根瘤菌Sm1021中过表达ACC脱氨酶基因,探讨ACC脱氨酶对根瘤菌共生固氮及竞争结瘤的影响。结果显示:接种过表达ACC脱氨酶的重组根瘤菌Sm1021,宿主植物地上部分鲜质量与结瘤数量有所增加;接种外源导入ACC脱氨酶的重组根瘤菌HH103,能够增加结瘤数,提高植物地上部分干质量且竞争结瘤能力增强。但是,接种2种重组根瘤菌后,宿主植物的根瘤鲜质量和根瘤固氮酶酶活性无明显变化。     

半无叶型豌豆根瘤菌接种效应及其竞争结瘤能力分析

【目的】研究不同根瘤菌株对豌豆生长发育、产量及品质的影响,并分析比较不同根瘤菌株的竞争结瘤能力,筛选出与供试豌豆品种匹配较好的根瘤菌株。【方法】在盆栽条件下,应用湖南省华容县棉田低氮土壤,对加拿大半无叶型豌豆MISER分别接种9株豌豆根瘤菌（CCBAU 33109、CCBAU 43228、CCBAU 43227、CCBAU 43232、ACCC 16058、CCBAU 41242、CCBAU 43242及商用菌株F98-1和F98-4）。测定豌豆的生育时期;在豌豆盛花期测定豌豆的主要生育特征、根瘤菌的结瘤固氮性能,并用BOX-PCR指纹图谱技术测定根瘤菌的占瘤率;在成熟期测定豌豆的主要生育特征、产量、产量构成因子,及其干籽粒粗蛋白、粗纤维含量。【结果】与不接种对照（CK）相比,接种CCBAU 33109后,MISER盛荚期和成熟期分别延长4.1和7 d（P＜0.05,下同）;接种ACCC 16058后,主茎节数在成熟期分别比对照、F98-1和F98-4多2.8、3.8和2.9节,株高比F98-4高15.67%,粗蛋白含量比对照和F98-1分别提高9.88%和10.63%;接种CCBAU 41242后,豌豆单株籽粒鲜重比商用菌株F98-1提高40.46%;接种菌株CCBAU 43228的占瘤率最高,为57.50%。【结论】根据接种根瘤菌对豌豆生长发育、产量以及品质等方面的影响,结合各根瘤菌株的竞争结瘤能力,本研究筛选出较适于豌豆MISER的豌豆根瘤菌株CCBAU 33109、ACCC 16058、CCBAU 41242、CCBAU 43228。     

紫云英根瘤菌质粒的研究——Ⅱ紫云英根瘤菌(Rhizobium astragali)经高温和吖啶橙处理后结瘤和固氮突变株的产生和质粒的消除

用高温和吖啶橙处理紫云英根瘤菌菌株7653~r和S_(52)分别获得了表型性状为不结瘤(Nod~-)和结瘤而不同氮(Nod~+,Fix~-)突变株。与亲本菌株具有的两条大质粒带相比,上述突变株均丢失了其中的一个较大的质粒。这一结果初步表明:菌株7653~r的nod基因和S_(52)的nif或fix基因可能定位在已消除的那一个大质粒(pRa7-2和pRa5-2)上。     

耐酸苜蓿根瘤菌在酸性黄壤中的定殖研究

在酸性黄壤中接种3株耐酸苜蓿根瘤菌91522,91512,91532,并施用不同浓度的Ca^2＋,比较研究了其在苜蓿根际土壤中的定殖动态与水平,进而分析了施Ca^2＋和接种耐酸苜蓿根瘤菌对紫花苜蓿共生效应的影响。结果表明：接种3种耐酸苜蓿根瘤菌均能在酸性土中定殖,且定殖动态基本一致,以接种菌株91512和91532的效果最好。施Ca处理对根瘤菌定殖影响不明显,施5mmol／LCa^2＋时,定殖效果最佳．接种耐酸苜蓿根瘤菌对苜蓿植株瘤重、根鲜重、株高、植株上部鲜重、全氯含量的影响显著.施Ca^2＋对植株根鲜重、株高和上部鲜重的影响达到了极显著水平,对瘤重的影响显著施用5mmol／LCa^2＋,苜蓿生长和结瘤的效果最好,表明在酸性黄壤中,施用适当浓度的Ca^2＋可以提高紫花苜蓿的产量和品质.     

参与紫云英共生固氮的1个上调表达结瘤素基因AsB6的分离与鉴定

基于接种华癸中慢生根瘤菌(Mesorhizobiumhuakuii)7653R的紫云英(Astragalus sinicusL.)感染根与未接种对照根在转录水平上的差异,利用抑制差减杂交技术(suppression subtractive hybridization,SSH),建立了紫云英结瘤固氮过程中的差异表达cDNA文库,共获得527个有效克隆,其中增强或特异性表达的上调文库中包含341个克隆,抑制表达的下调文库包含186个克隆。对其中的1个上调表达cDNA克隆AsB6利用RACE(rapid amplification of cDNAends)方法获得了其基因全长序列,利用BLAST在线软件和GenBank,Gen-Bank EST和Tigr Porcine EST等数据库进行同源序列比较,表明AsB6与苜蓿的β-酮酯酰合成酶及依赖于SAM(S-adenosgl methiomine,S-腺苷蛋氨酸)的羧甲基转移酶具有66%的同源性,同时利用实时荧光定量PCR研究了该基因的时空表达特征。结果显示,接种根瘤菌7653R后,在紫云英感染根和根瘤中该基因的表达量显著增强,且在接种后根瘤形成早期和固氮中晚期表达...     

快生型大豆根瘤菌的结瘤竞争性及其田间分布调查

快生型大豆根瘤菌的结瘤竞争能力是生产应用的重要指标之一。Mcloughlin(1984)的研究指出、快、慢型大豆根瘤菌混合接种时,快型菌在“北京”黑豆的根瘤占优势,而在栽培大豆品种内为劣势。我们用快、慢型大豆根瘤菌以不同比例混合后接种栽培大豆品种“开育8号”和“吉林10号”,收获后以相应菌株抗血清去识别根瘤,观察快、慢型大豆根瘤菌的结瘤竞争能力。同时在山西、河南、山东、辽宁、黑龙江、江西、宁夏、新疆等8个省(区)的24个点采取47个大豆品种(次)的4.251个根瘤,以5个不同血清型的快型大豆根瘤菌的抗血清测定每个根瘤,计数各点快型菌出现的频率。     

小豆根瘤菌接种结瘤条件分析

设计不同的小豆根瘤菌及菌液浓度、侵染时间和接种方式接种小豆推广品种京农5号和京农6号,研究其对小豆结瘤数的影响。根瘤菌BAU73042菌液浓度0.6 OD接种,单株平均结瘤数最多;BAU11017菌株菌液浓度0.2 OD接种,单株平均结瘤数最多。BAU73042侵染京农6号15 min单株结瘤数最多,BAU11017侵染京农5号45 min单株结瘤数最多。菌液浇灌接种方式优于菌液侵染接种;不同品种接种不同根瘤菌的结瘤反应不同。该研究为小豆固氮研究及利用和根瘤突变体筛选鉴定奠定了基础。     

华癸中慢生根瘤菌7653R MCHK_8182基因的共生固氮功能

根据华癸中慢生根瘤菌7653R全局转录组分析结果,获得在共生固氮阶段显著上调表达的基因MCHK_8182;设计重叠延伸PCR引物,构建MCHK_8182双交换突变重组质粒载体;通过三亲本杂交,将突变载体导入7653R;在蔗糖压力培养下进行筛选,最终获得MCHK_8182双交换突变株。PCR及测序验证双交换突变株构建成功。植物盆栽试验结果显示,与7653R野生型接种的植株相比,MCHK_8182突变菌株接种的植株根瘤数减少,但固氮酶活未见明显差异。     

高效苜蓿根瘤菌的筛选

旨在利用celB基因标记技术从土著根瘤菌中筛选出与盛世苜蓿品种相匹配的有效性高、竞争性强的高效苜蓿根瘤菌株。从四川雅安、重庆北碚、万州采集野生苜蓿根瘤,采用平板划线法分离纯化获得93株纯菌株,通过与盛世品种在无氮水培液中进行结瘤试验和有效性分析并结合菌株的地理来源,初筛出了与对照相比有效性较高的4株苜蓿根瘤菌,分别为Y6-1-1、BB1-8-1-1、BB2-2-1-1和WZ-6-2-2。进一步利用celB基因标记技术对这4株菌进行竞争性研究,通过供体大肠杆菌HAMBI2356与根瘤菌接合的方法成功地将celB基因导入4个菌株中,对标记基因可能会对标记菌株产生的影响进行检测,结果表明标记基因在标记菌株内能稳定传代,而且对标记菌株的生长、竞争性及有效性都没有显著影响,从而证明celB基因标记技术可以作为一种简便、直观而又有效的检测手段用于追踪根瘤菌株在土壤中的竞争性。进一步通过田间试验比较分析标记菌与土著菌的竞争结瘤能力和固氮有效性,结果表明Y6-1-1、BB2-2-1-1、WZ-6-2-2与对照相比在占瘤率、瘤重、总瘤数上差异显著,占瘤率都在72%以上,显著提高了植株的干重、叶绿素含量、全氮量和产量,其中WZ-6-2-2的有效性最高、竞争性最强,可以用于苜蓿盛世品种的接种。     

解磷菌和根瘤菌复合接种对大豆和紫云英共生固氮的影响

从大豆根际及根瘤中分离获得2株具有较高解磷能力的细菌PSB-1和HZP1,通过Salkowski比色法和钼锑钪比色法,对这2个菌株产生IAA(indole-3-acetic acid,IAA)的能力和溶解无机磷的能力进行了测定,同时对紫云英和大豆进行接种,并对田间栽培的大豆进行了菌剂接种试验。结果显示:PSB-1及HZP1均具有解磷及产IAA的特性;单接种解磷菌HZP1或PSB-1均有促进紫云英和大豆生长的作用;相比于单接种根瘤菌,将这2株解磷细菌分别与根瘤菌混合接种能进一步提高大豆和紫云英的地上生物量、根瘤鲜质量和根瘤数。田间试验结果显示,单独接种根瘤菌剂或解磷菌剂都有一定的增产效果,但双接种根瘤菌剂和解磷菌剂的增产效果不明显。     

抗链霉素紫云英5号突变菌株的选育

我省种植紫云英已有几十年的历史,由于各地生产水平不同,产量相差悬殊。而要提高紫云英产量,除了做好田间管理之外,更重要的是要有相适应的感染力强、固氮力强的优良菌株与之共生,形成较多的有效根瘤,才能提高植株或籽实的产量。这就需要接种栽培,但是在老区接种是否有效果?拿什么标准衡量?过去是用鲜草或籽实的产量来衡量接种效果的,并未追究人工接种根瘤菌的实际结瘤效果。本课题主要针对这一问题进行了抗药性突变菌株的选育,以此来标记人工接种菌株的感染力。我们通过几年的工作,初步选出了抗链霉素紫云英根瘤菌(Rhizobium astragali)5号菌株为感染力强和固氮力强的优良菌株。