中华大蟾蜍皮肤galectin-3cDNA分子多样性及氨基酸变异分析

以中华大蟾蜍Bzfo gargarizans皮肤总核糖核酸(RNA)反转录第1链互补脱氧核糖核酸(cDNA)为模板,以聚合酶链式反应(PCR)扩增出galec tin-3基因片段并通过TA克隆将其插入到pGM-T载体,通过DNA测序确定该基因片段序列,然后利用美国国家生物技术信息中心(NCBI)中ORF finder查找基因的全长开放阅读框(ORF).筛选到9个编码galectin-3的cDNA序列,其中2个序列编码N-端截短型galectin-3(galectin-3C).Clustal X2.0多序列比对和DnaSP4.0分析cDNA序列的多样性.结果发现:中华大蟾蜍alectin-3C区域具有高密度的单核苷酸多态性(SNP),频率为每20 bp为1个单核苷酸多态性.推导的氨基酸序列比对显示这9个基因在N端和糖识别结构域(CRD)有较高同源性,包括磷酸化位点、糖基结合位点和相关基序,而在串联重复区则存在较大差异.galectin-3基因及其编码蛋白的多样性很可能赋予中华大蟾蜍很强的环境适应能力.     

中华大蟾蜍g a l e c t i n - 3c D N A的克隆、序列分析及原核表达载体的构建

通过PCR扩增出中华大蟾蜍Bufo gargarizans半乳糖凝聚素3(gal-3)cDNA全长开放读码框(ORF)并克隆至pGM-T载体,经DNA测序确定获得全长ORF序列(GenBank登录号为JN993733).序列分析表明中华大蟾蜍gal-3的ORF是由789个碱基组成,编码262个氨基酸残基组成的蛋白质.推导氨基酸序列同源性比较发现,中华大蟾蜍与非洲爪蟾Xenopus lavis同源性最高,为51%,与其他10种动物的同源性在41%～50%之间.SMART分析显示gal-3蛋白在136-259位氨基酸存在保守的半乳糖结合域.Net Phos预测gal-3在Ser-6和Ser-186有潜在的丝氨酸磷酸化位点.gal-3氨基酸序列构建的进化树符合传统动物分类学特点.经菌落PCR、双酶切和DNA测序确认gal-3的ORF正确插入原核表达载体pET-28b,表明原核表达用重组质粒构建成功,为研究其蛋白功能和生物学功能奠定了基础.     

中华大蟾蜍皮肤galectin-3 cDNA分子多样性及氨基酸变异分析

 以中华大蟾蜍Bufo gargarizans皮肤总核糖核酸（RNA）反转录第1链互补脱氧核糖核酸（cDNA）为模板,以聚合酶链式反应（PCR）扩增出galectin-3基因片段并通过TA克隆将其插入到pGM-T载体,通过DNA测序确定该基因片段序列,然后利用美国国家生物技术信息中心（NCBI）中ORF finder查找基因的全长开放阅读框（ORF）。筛选到9个编码galectin-3的cDNA序列,其中2个序列编码N-端截短型galectin-3（galectin-3C）。Clustal X2.0多序列比对和DnaSP 4.0分析cDNA序列的多样性。结果发现：中华大蟾蜍galectin-3C区域具有高密度的单核苷酸多态性（SNP）,频率为每20 bp为1个单核苷酸多态性。推导的氨基酸序列比对显示这9个基因在N端和糖识别结构域（CRD）有较高同源性,包括磷酸化位点、糖基结合位点和相关基序,而在串联重复区则存在较大差异。galectin-3基因及其编码蛋白的多样性很可能赋予中华大蟾蜍很强的环境适应能力。图3表1参24     

江苏省沿海滩涂中华大蟾蜍种群的遗传多样性分析

[目的]为中华大蟾蜍野生种群资源的保护和合理开发利用提供理论依据.[方法]通过对中华大蟾蜍线粒体控制区的部分序列进行测序分析,研究江苏沿海地区中华大蟾蜍不同地域种群的遗传多样性.[结果]在江苏省沿海滩涂的3个地域检测到中华大蟾蜍种群的6个单倍型类型,东台种群、大丰种群和射阳种群的个体间享有共享的单倍型类型,其余单倍型均是各种群独享.系统发育树分析表明,中华大蟾蜍3个地域种群没有形成明显的地理分布格局.[结论]各地域种群间既存在着一定程度的基因交流,也存在一定程度的遗传分化.     

人表皮生长因子cDNA的克隆、原核表达和抗体的制备

根据已发表的人表皮生长因子(hEGF)mRNA序列设计引物，上游引物5′端引入山羊β-乳球蛋白信号肽序列。PCR从人肝脏混合单链cDNAs中扩增出hEGF cDNA；测序表明，克隆的hEGF cDNA与已发表的序列完全相同；经Signalp V1．1软件分析，山羊β-乳球蛋白信号肽序列与hEGF cDNA能在预计位点切割。将此cDNA克隆到GEX-6P-1中，经IPTG诱导，在BL21(DE3)大肠杆菌中表达约32ku的GST-hEGF融合蛋白。将此cDAN插到pcDNA-3中，用此重组质粒免疫青紫蓝兔，经6次免疫后获得抗hEGF的多克隆抗体，该抗体能识别GST-hEGF融合蛋白。     

中华大蟾蜍Sox基因的PCR—SSCP分析

Sox基因家族是一个参与发育的基因家族,该家族的基因都含有一个高泳动的HMG-box,在不同物种中高度保守。笔者参照人SRY基因HMG—box保守区序列设计引物．PCR扩增中华大蟾蜍的HMG-box保守区核酸序列,并利用PCR-SSCP技术对其进行保守性分析。在雌雄中华大蟾蜍中均扩增出220bp大小的片段,通过PCR—SSCP分析发现,在不同个体中该Sox基因高度保守,无多态,暗示该基因在中华大蟾蜍中的重要作用。     

一种改进的固相扣除杂交法直接克隆全长差异表达基因

该文集多种分离差异表达基因方法的优点于一体,自行优化了一种基于固相扣除杂交和聚合酶链式反应(PCR)技术直接克隆全长差异表达基因的策略．该策略中的所有操作步骤,包括poly (A)+mRNA的分离,cDNA的合成和扣除杂交都是在磁珠上进行的,操作简单易行．扣除杂交是用结合在磁珠上的以oligo(dT)为引物合成的对照材料（Driver）的cDNA第一链,直接扣除加有接头的处理材料（Tester）cDNA第二链中的共有序列．多次反复使用Driver一链与Tester二链进行杂交,能有效去除Tester二链中的共有序列.磁珠的分离能最小限度地减少每次杂交造成的损失．最后一轮扣除后的Tester二链中,含有大量差异表达序列,用Tester二链特有的接头引物进行扩增,能进一步提高扣除效率．该文选用此扣除方法,成功分离到了低温驯化沙冬青幼苗和对照苗2个群体的18个差异表达克隆,其中有4个克隆是全长cDNA序列．经序列分析发现,这些基因都与低温相关,进一步说明,该方法可用于克隆未知差异表达基因．      

一种构建全长cDNA文库的方法

建立了一种以LD-PCR为基础的cDNA文库的快速构建方法.以人胎盘组织为材料获得总RNA,利用引物F1、R2在逆转录酶M-MLV的作用下合成cDNA第1链,进而利用引物F3、R4在DNA聚合酶的作用下通过LD-PCR方法合成cDNA第2链;双链cDNA经SfiⅠ酶切,通过T4 DNA连接酶连接到经相同酶切的JG45质粒载体后构建成cDNA文库,并对文库的容量、重组率以及多样性进行了分析.结果表明,通过该方法构建的cDNA文库容量约为7.01×105 个/μgds-cDNA,重组率为96%;对随机提取的100个克隆质粒的插入序列进行分析,共获得80个不同的cDNA序列,且未见重复序列.该法构建的cDNA质粒文库具有快速、简单的特点,构建的文库质量符合要求,可用于大规模的基因分析.     

日本蟾蜍皮肤claudin-4 cDNA的克隆与序列分析

为研究日本蟾蜍Bufo japonicus formosus皮肤中多肽类有效成分,通过菌落聚合酶链式反应（PCR）对日本蟾蜍皮肤cDNA质粒文库进行筛选,克隆到2条claudin-4全长cDNA序列（GenBank登录号为JX481975和JX481976）,并对它们进行生物信息学分析。日本蟾蜍claudin-4的2条cDNA全长分别为1 707 bp和1 697 bp,开放阅读框均为630 bp,其中虽有5个碱基不同,但编码的209个氨基酸完全相同。两者的5端非翻译区域序列长度不同,前者为50 bp,后者为41 bp,3端非翻译区域则分别为1 027 bp和1 026 bp。氨基酸序列同源性分析显示,日本蟾蜍claudin-4与非洲爪蟾Xenopus laevis的同源性最高,为88％,与其他7种动物的同源性介于65%~72%。克隆到2条日本蟾蜍claudin-4基因的cDNA序列,为今后研究日本蟾蜍Claudin-4 生物学功能奠定了基础。图5参21     

山溪鲵皮肤β-microseminoprotein样蛋白的分离纯化及其cDNA克隆

从山溪鲵(Batrachuperus pachunii)皮肤匀浆液中经过Sephadex G-50凝胶过滤、AKTA(R)Resource Q阴离子柱和反向高压液相C4柱分离纯化得到相对分子质量为12 000的蛋白.利用其N端氨基酸序列设计引物,从山溪鲵皮肤的cDNA中克隆并筛选到该蛋白的cDNA序列.该cDNA序列的开放阅读框为339 bp,编码113个氨基酸残基组成的蛋白.在BLAST数据库搜寻比对分析表明,该蛋白的氨基酸序列与来自人类及其他哺乳动物β-microseminoprotein蛋白具有约40%的序列同源性.这也是首次在两栖类动物皮肤中确认β-microseminoprotein.初级结构分析表明,该蛋白属于亲水性蛋白;多重序列比较显示,其氨基酸序列中的10个半胱氨酸位点及15个其他氨基酸位点与高等脊椎动物β-microseminoprotein中同种氨基酸有相同的位点.由此推测该蛋白属于β-microseminoprotein家族.     

浙江近海三疣梭子蟹4个群体的控制区序列分析

以浙江近海三疣梭子蟹大螯肌肉的线粒体DNA作为模板,对4群体共67个个体的控制区（D-loop）序列进行了PCR扩增。通过对PCR产物进行双向测序,最终得到了控制区3’端的rRNA部分序列（64 bp）、D-loop全序列（1179 bp）及控制区5’端tRNA-Ile部分序列（73 bp）。经DNASP软件分析得知,67个D-loop序列定义了65个单倍型,在65个单倍型中,除去插入/缺失位点,所有单倍型共检测到344个多态位点,主要发生在D-loop序列的中间区域;D-loop序列检测到26个插入或缺失位点,碱基插入主要发生在中央后端区域,以13 bp重复片断插入的形式进行。每个个体含有0～3个连续重复片断。通过对三疣梭子蟹的遗传多样性分析发现,D-loop序列的单倍型多样性为0.982～1.000,核苷酸多样性指数为0.02770～0.03633,平均核苷酸差异数为31.790～43.304。综合分析,三个成蟹群体的遗传多样性相近,都低于仔蟹的遗传多样性,说明经过遗传育种,可以提高三疣梭子蟹的种质情况,真正实现对三疣梭子蟹的科学利用。     

东海野生灰鲳mtDNA D-loop序列遗传变异分析

以东海区野生灰鲳背部肌肉的线粒体DNA为模板,采用PCR技术对7个个体的D-loop序列进行了扩增,通过对PCR产物进行双向测序,最终得到了471 bp的核苷酸片断（除去两端部分序列）。用DNAMAN6.0软件进行了排序比较发现,东海野生灰鲳的D-loop序列同源性高达99.48%;用DNASP4.0软件分析得知,7个序列共有6个单倍型（在GenBank登录号：GU970085-GU970087,GU970089-GU970091）,在7个个体中,共检测到14个变异位点,包括13个转换和1个颠换位点。运用MEGA4.0软件计算出了不同个体间的遗传距离,并据此构建了MP和NJ系统树。用DNASP4.0软件计算出的多态位点数为14,核苷酸多样性指数和平均核苷酸差异数分别为0.009 71和4.571。研究结果表明,东海野生灰鲳的D-loop序列个体变异程度并不丰富。     

日本囊对虾群体遗传多样性的线粒体序列分析

对日本囊对虾的3个养殖群体即浙江舟山群体（ZJ）、福建群体（FJ）和台湾群体（TW）的线粒体细胞色素c氧化酶亚基Ⅲ基因进行PCR扩增,得到577 bp的核苷酸分析序列,AT含量高于GC含量,发现51个变异位点,其中包括18个简约信息位点,共有31种单倍型。福建群体的核苷酸多样性最高。用MEGA软件中的NJ法构建日本囊对虾3群体与另外5种对虾的系统进化关系,日本囊对虾的3个群体首先聚在一起,再与亲缘关系较近的中国明对虾聚在一起。     

应用ISSR和线粒体COI序列对不同地理种群双齿围沙蚕（Perinereis aibuhitensis）遗传多样性的分析

采用COI基因序列和ISSR分子标记对分布于我国大连（DL）、乳山（RS）、盘锦（PJ）、青岛（QD）、盐城（YC）、晋江（JJ）和朝鲜西海岸（CX） 7个地理种群双齿围沙蚕（Perinereis aibuhitensis）的遗传多样性和遗传结构进行了研究。10个ISSR引物在7个种群中共扩增出116条条带,其中多态性条带109条,总多态位点比率为93.97%,Neis基因多样性指数为0.365 2,Shannons信息指数为0.518 6,群体间遗传分化系数Gst值为0246 0。数据表明24.60%的遗传分化发生在不同地理种群间,76.40%的遗传分化发生在整个种群内,群体内分化大于群体间分化。对7个群体70个个体COI基因序列进行分析,对比长度包括469 个位点,其中变异位点68个,简约信息位点47个。在68个变异位点中,62个位点发生转换,6个位点发生颠换,简约信息位点率达9.611%,系统树分析表明供试群体内具有较高的遗传多样性,与ISSR分析结果相一致。该结果为科学有效的利用和保护沙蚕种质资源提供了理论依据。     

中华大蟾蜍的食性研究

[目的]了解中华大蟾蜍的食性,为其利用和保护提供依据。[方法]2008年4-6月对牡丹江地区中华大蟾蜍的食物状况进行调查,并对食物多样性进行分析。[结果]中华大蟾蜍摄食较广,雌性中华大蟾蜍的食物多样性指数H1=3.786 7,小于雄性（H2=3.838 2）。[结论]中华大蟾蜍对人类的有益性指数较高,对维持生态平衡、消灭农业害虫有重要作用。     

日本蟾蜍皮肤胸腺素α原cDNA的克隆及序列分析

为研究蟾酥、蟾衣、蟾皮中多肽类有效成分,通过菌落聚合酶链式反应（polymerase chain reaction,PCR）对日本蟾蜍Bufo japonicus formosus皮肤cDNA质粒文库进行了筛选,获得胸腺素原（prothymosin?鄄,ProT）全长cDNA序列,并对它们进行了生物信息学分析。日本蟾蜍ProT cDNA全长为1 480 bp,包括339 bp的完整开放阅读框（open reading frame,ORF）,5端125 bp及3端1 016 bp的非翻译区（untranslated region,UTR）。根据cDNA序列推导的日本蟾蜍ProT由112个氨基酸残基组成,无信号肽结构。氨基酸序列同源性分析显示,日本蟾蜍ProT与食用蛙Rana esculenta同源性为82%,与其他11种动物的同源性则介于54%～73%。ProT具有显著的抗肿瘤作用。分析日本蟾蜍ProT cDNA序列,可为研究其生物学功能和药物研发提供实验依据。图4参17     

枯草芽孢杆菌脂肪酶基因lipaseA突变文库构建及其生物柴油转酯研究

采用易错PCR方法对枯草芽孢杆菌脂肪酶基因lipaseA进行定向进化,并首次采用对硝基苯棕榈酸酯（pNPP）法进行96孔板高通量筛选。结果表明：第一轮易错PCR没有产生随机突变,第二轮易错PCR反应在Mn2+浓度为0.2 mmol·L-1时,产生了突变菌株。对该条件下构建的文库中124株突变菌株进行pNPP高通量筛选,突变株4B2的吸光度值A405为1.395,与未突变株PET32a lipaseA（A405=0.448）差异显著。测序结果表明,突变株4B2脂肪酶基因lipaseA有5个核苷酸位点发生了突变,其中3个是同义突变,2个是错义突变,分别是82位的天冬酰胺（AAU）突变为酪氨酸（UAU）,143位的赖氨酸（AAG）突变为苏氨酸（ACG）。突变株4B2发酵上清液转化生物柴油的转酯效率较对照菌PET 32a lipaseA有明显提高,前者为79.5%,后者为49.72%。本研究为枯草芽孢杆菌脂肪酶lipaseA转酯活性位点的探索奠定了基础。