植物蛋白质组研究方法

蛋白质组研究是后基因组时代的热点领域,介绍了蛋白质组概念提出的背景,蛋白质组与基因组的联系与区别,蛋白质纽研究的内容,重点综述了植物蛋白质纽研究的技术．双向凝胶电泳仍为蛋白质分离的核心技术,该技术在某些方面作了改进和发展;生物质谱是蛋白质鉴定的关键技术,进一步发展了生物传感芯片质谱及蛋白质芯片技术;对蛋白质纽研究的信息处理依赖于生物信息学的发展,介绍了国内外相关的蛋白质数据库及建立数据库主要应用的图像软件。     

辣椒胞质不育系与保持系花药的细胞学和蛋白质组学差异分析

为了解辣椒胞质雄性不育系与保持系花药的细胞学和蛋白质组学差异,以辣椒胞质不育系和保持系花蕾发育的6个不同时期的花药为材料,以石蜡切片于Leica DM1000显微镜下观察其发育过程的差异。然后利用SDSPAGE进行花药蛋白分离,经LC-MS/MS质谱技术和蛋白质组学分析对差异蛋白质条带进行鉴定。结果显示:花粉败育发生在四分体形成以后,与绒毡层细胞的过度液泡化及四分体周围的胼胝质不能解体有关。另外,与辣椒保持系相比,在不育系花药蛋白中有4条差异蛋白质条带(条带1~4)表达量下调,质谱分析后共鉴定出蛋白质68个,其中不重复蛋白质64个。对质谱数据利用UniProt数据库进行搜索鉴定,鉴定出的蛋白质按分子功能归类,涉及催化作用的蛋白质最多有24个;按细胞组分归类,涉及细胞内膜组织的最多有20个。按生物学过程归类,参与代谢过程的最多有24个。这说明在四分体形成以后,胞质雄性不育系花药的物质和能量代谢出现异常,导致绒毡层异常膨大,四分体不能获得物质和能量从而败育。另外,这也充分说明本研究通过蛋白质组学分析鉴定出的差异蛋白质可初步解释胞质雄性不育系与保持系在细胞学上的差异表现。     

蛋白质组学及其技术体系简介

蛋白质组学以蛋白质组为研究对象。作为生命科学新的发展前沿,蛋白质组学可以在整体水平上研究蛋白质组成与调控的分子机制。双向电泳和质谱技术是蛋白质组学研究中的关键性技术。双向聚丙烯酰胺凝胶电泳根据蛋白质的等电点和分子量分离蛋白质,而质谱技术已成为鉴定蛋白质的极为灵敏而迅速的工具。由此得到的肽质量图谱结合准确全面的数据库技术,就使得新的蛋白质或多肽得以鉴定。今天蛋白质组学研究已成为后基因组时代的标志性技术。     

线粒体蛋白质组学技术及其在植物细胞质雄性不育机理研究中的应用

利用差异蛋白质组学技术,比较研究不育系和保持系花药线粒体蛋白质组的变化,可以较全面地反映与育性相关蛋白质或多肽的表达变化特征,对于了解雄性不育花药败育发生的原因及其生理生化代谢机制具有重要作用。文章通过对植物线粒体蛋白质组学研究技术及其在揭示植物细胞质雄性不育（CMS）机理方面的研究进行综述,提出从线粒体差异蛋白质组学角度来揭示植物CMS的机理,是该领域研究的必然趋势。今后需加深对作物线粒体差异蛋白组学与其CMS机理的研究。此外,随着线粒体蛋白质组数据库的不断完善,蛋白质组学各种方法间的整合和互补,以及与其他学科（如基因组学、生物信息学等）领域的交叉研究,必将深入阐明CMS机理,从而加快植物杂种优势的利用。     

线粒体蛋白质组学技术及其在植物细胞质雄性不育机理研究中的应用

利用差异蛋白质组学技术,比较研究不育系和保持系花药线粒体蛋白质组的变化,可以较全面地反映与育性相关蛋白质或多肽的表达变化特征,对于了解雄性不育花药败育发生的原因及其生理生化代谢机制具有重要作用。文章通过对植物线粒体蛋白质组学研究技术及其在揭示植物细胞质雄性不育（CMS）机理方面的研究进行综述,提出从线粒体差异蛋白质组学角度来揭示植物CMS的机理,是该领域研究的必然趋势。今后需加深对作物线粒体差异蛋白组学与其CMS机理的研究。此外,随着线粒体蛋白质组数据库的不断完善,蛋白质组学各种方法间的整合和互补,以及与其他学科（如基因组学、生物信息学等）领域的交叉研究,必将深入阐明CMS机理,从而加快植物杂种优势的利用。     

植物磷酸化蛋白质组学研究进展

首先阐述了植物细胞蛋白质磷酸化的作用机制,并从植物磷酸化蛋白质的分离与鉴定技术、植物磷酸化蛋白质数据库及植物蛋白质磷酸化位点的预测工具,对植物磷酸化蛋白质组的研究进展进行综述.最后分析了植物磷酸化蛋白质组研究中亟需关注的3个问题,即磷酸化蛋白质的分离与鉴定技术的提升、位点预测工具的完善及蛋白质功能的分析.     

蛋白质组学在大豆中的研究进展

蛋白质组学分析是目前分离、鉴定蛋白差异表达最为有效的研究手段之一,其核心技术包括以双向电泳为主的蛋白质分离技术、以质谱分析为核心的蛋白质鉴定技术以及计算机图像数据处理和数据库的构建。蛋白质组学分析方法是功能基因组研究的重要支柱。文章总结了蛋白质组学分析用大豆蛋白提取方法的改进,综述了蛋白质组学技术在大豆与根瘤菌相互作用、大豆组织器官蛋白、生长发育相关蛋白研究上的应用以及在生物及非生物胁迫、细胞器水平、大豆遗传多样性及转基因鉴定领域的研究进展,同时对大豆蛋白质组学的发展前景进行了展望。     

蛋白质组分析技术与进展

双向电泳、质谱技术与信息技术是蛋白质组研究的主要技术。为满足高通量蛋白质组研究的需要,这些技术也在不断改进,同时也诞生了其它一些分析技术。本文对蛋白质组分析的主要技术与发展趋势进行了综述。     

同工酶技术在十字花科作物育种上的应用

对近年来同工酶技术在十字花科作物种质资源和亲源关系鉴定、品种和杂种鉴定、杂种优势预测、雄性不育性研究、种子纯度鉴定和抗性育种方面的应用作了综述，并提出了同工酶技术在十字花科作物育种中所存在的问题和应用前景。     

橡胶种子萌发前后蛋白质组的比较研究

采用双向聚丙烯酰胺凝胶电泳（2D—PAGE）及质谱技术对橡胶种子萌发后蛋白质表达谱的变化进行了检测分析。结果显示,种子萌发前后的2个蛋白质组在蛋白质总数上并无显著差异,但各自均检测到特异性蛋白质的存在。成熟干种子蛋白质组含有2个分子量约为36．5kDa和23kDa的蛋白质簇（pH4～7）以及一组碱性蛋白质（大约pH10）,而已萌发种子蛋白质组中23kDa蛋白质的表达量出现明显下降。已萌发种子蛋白质组中大约有60％的蛋白质与成熟干种子一致,其余40％则不相同或为其所独有。此外,本研究通过质谱分析从已检测到的蛋白点中鉴定出了3种在萌发种子蛋白质组中丰度有所下降的蛋白质,同时还发现了2种仅存在于成熟干种子蛋白质组中的蛋白质。前3种蛋白质包括1种推定的β-葡萄糖苷酶,淀粉分枝酶,以及1种MutT／nudix家族蛋白质,后2种蛋白质则分别为1种酸性植物凝集素和赤霉素20-氧化酶。本研究目的旨在探索2D—PAGE及质谱分析技术在巴西橡胶树蛋白质鉴定中的应用潜力,并根据蛋白质的变化动态藉以了解橡胶种子萌发的内在机制。     

家蚕幼虫期和蛹期马氏管差异蛋白质组学分析

【目的】深入了解家蚕幼虫期与蛹期马氏管蛋白质组的变化,为马氏管在不同发育时期的功能研究提供蛋白质水平上的依据。【方法】利用蛋白质双向电泳技术对家蚕5龄第5天及化蛹第1天的马氏管组织进行比较,并采用基质辅助激光解析飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）对表达量差异较大的蛋白点进行肽指纹图谱鉴定,应用GPMAW 8.00软件对NCBI蛋白质数据库中所有来自于P50/Dazao的蛋白质与家蚕9倍基因组预测蛋白质库共同构建本地数据库,对试验采集到的肽指纹图谱进行分析。【结果】共检测到360-430个蛋白点,主要分布在分子质量15-80 kD、等电点4.0-9.5。2个时期共成功鉴定17个表达量有显著差异的蛋白质,其中包括与能量代谢相关蛋白质、热激蛋白、V型H+ ATP合酶、30K蛋白以及与肾脏功能密切相关的丙氨酸-乙醛酸氨基转移酶 2,3-羟基异丁酸脱氢酶等。【结论】本研究中差异蛋白质的发现和鉴定为完全变态昆虫幼虫期与蛹期马氏管的功能差异提供了蛋白质水平上的理论依据。     

大豆质核互作雄性不育系NJCMS1A及其保持系的花药差异蛋白质组学研究

 【目的】对大豆质核互作雄性不育系NJCMS1A及其同型保持系NJCMS1B的二胞花粉期花药进行差异蛋白质组学研究，探讨大豆质核互作雄性不育的分子机制。【方法】采用双向凝胶电泳技术对其蛋白质进行分离，凝胶用考马斯亮蓝染色，使用PDQuest软件分析蛋白质图谱，利用基质辅助激光解吸飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）技术对差异表达蛋白进行质谱分析，获得肽质量指纹图谱，用Profound和Mascot软件搜索NCBInr数据库，初步鉴定差异表达蛋白并分析其功能。【结果】 在分子量18.4～116.0 kD、等电点4～7线性范围内，检测到约212个蛋白点，差异表达蛋白点24个。其中10个在NJCMS1A 中出现而在NJCMS1B中缺失，12个在NJCMS1A中缺失而在NJCMS1B中出现，2个表达量在NJCMS1B中比在NJCMS1A中明显增强。鉴定出11个差异表达蛋白，其中7个在NJCMS1A中出现而在NJCMS1B中缺失，4个在NJCMS1A中缺失而在NJCMS1B中出现。【结论】对主要差异表达蛋白如ACC氧化酶、半胱氨酸蛋白酶、V型H+-ATP酶A亚基、MADS盒蛋白、淀粉分枝酶和UDP-葡萄糖焦磷酸化酶等进行功能分析，推测不育系NJCMS1A雄性不育性可能与能量代谢紊乱、细胞程序化死亡（PCD）、乙烯过度合成、淀粉合成受抑制和花器官发育调节基因作用失控等有关。     

棉花晋A细胞质雄性不育系及其保持系差异蛋白质组分析

【目的】对棉花晋A细胞质雄性不育系及其同核异质保持系MB177（JB）雄性败育关键时期的花药进行差异蛋白质组研究,为进一步揭示棉花细胞质雄性不育机理奠定基础。【方法】运用双向电泳技术对晋A细胞质雄性不育系及其保持系小孢子发育的造孢细胞时期和小孢子母细胞时期表达的蛋白质进行分离（考马斯亮蓝染色）;采用PDQuest8.0.1软件进行斑点检测,并经统计学分析确定获得差异表达蛋白质;对这些差异蛋白质斑点进行LC-Chip-ESI-QTOF-MS质谱分析,用Mascot软件搜索NCBInr绿色植物,鉴定差异表达蛋白质;对差异表达蛋白质进行GO和KEGG功能分析。【结果】PDQuest8.0.1软件分析表明,晋A不育系和保持系在花药发育的造孢细胞时期和小孢子母细胞时期的花蕾总蛋白质斑点数分别为1 525、1 540和1 554、1 540,这些蛋白质斑点的分子量分布在10-100 kD,等电点分布在3-10。经差异定量研究和统计学分析,共鉴定到15个在晋A不育系与保持系间显著差异表达的蛋白斑点,15个差异蛋白质斑点都得到了质谱特异峰图。对应的蛋白质H（+）-转运ATP合成酶、谷胱甘肽还原酶、线粒体上的ATP酶亚基、核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶大亚基和UDP-D葡萄糖脱氢酶在不育系与保持系花药发育2个阶段均差异表达;膜联蛋白、S-甲酸谷胱甘肽水解酶、momilactone A 合成酶类似物、一个具有丙二烯氧化环化酶活性的未命名蛋白质和一个位于线粒体上的保守预测蛋白质仅在不育系和保持系花药发育的造孢细胞时期差异表达;β-羟酰-ACP脱水酶、丙酮酸脱氢酶-α亚基以及与花粉发育相关的一个预测蛋白质仅在不育系和保持系花药发育的小孢子母细胞时期差异表达。这些差异表达蛋白质主要参与小孢子与绒毡层发育过程,它们的下调或上调表达可能造成发育与代谢过程的不协调性,产生不正常的小孢子和绒毡层提前解体,从而导致雄性不育。采用荧光定量PCR分析核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶大亚基基因和H（+）转运ATP合成酶基因的转录变化,它们在转录水平与蛋白质表达的趋势一致。【结论】晋A不育系的小孢子败育可能与能量代谢紊乱、茉莉酸合成途径损害、细胞内大量ROS积累、查尔酮合酶活性下降有关。雄性不育的产生是一个复杂的生物学过程,涉及到多个基因的相互作用,构成了一个复杂的调控网络。     

脑梗死肝阳化风证与阴虚风动证蛋白质组学 比较研究

目的建立脑梗死肝阳化风证与阴虚风动证血清双向凝胶电泳图谱,初步分析其差异蛋白质表达情况。 方法双向凝胶电泳(2-DE)分离脑梗死肝阳化风证与阴虚风动证血清标本,考马斯亮兰染色,PD-QUEST 图像分析系 统分析,从凝胶中选取分离较好的蛋白质点,基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)分析获取肽质 量指纹图谱（PMF）,Mascot 软件搜索SWISS-PROT 数据库鉴定蛋白质,对差异蛋白质进行组间对比。结果获得了分 辨率较好的脑梗死肝阳化风证与阴虚风动证双向凝胶电泳图谱,质谱分析了29 个差异蛋白质点,获取了87 张肽质 量指纹图谱,通过查询数据库鉴定了29 个蛋白质,其中部分蛋白质与肝阳化风证及阴虚风动证发生发展有关。结论 建立了脑梗死肝阳化风证与阴虚风动证血清双向凝胶电泳图谱,并应用质谱技术鉴定了部分差异蛋白质点,为脑梗 死肝阳上亢证与阴虚风动证与正常组血清双向凝胶电泳图谱血清蛋白质组数据库的建立提供了有意义的数据,并认 为蛋白质组学能在脑梗死不同证型具有代表意义。     

小麦叶片蛋白质组的2D-LC分离及Nano LC-MS/MS分析

 【目的】二维液相色谱（2D-LC）与双向电泳（2-DE）技术具有互补性,本文旨在探讨利用2D-LC和纳升级液相色谱串联质谱（Nano LC-MS/MS）技术分离鉴定小麦叶片蛋白质组的新方法。【方法】小麦叶片蛋白经提取、脱盐后,进行第一维阴离子交换分离;收集洗脱组分进行SDS-PAGE分析,并对非高丰度蛋白组分进行第二维反相液相色谱分离;随机选择含较低吸收峰的部分组分经胰蛋白酶水解后进行Nano LC-MS/MS 分析;将串联质谱数据通过MASCOT搜索NCBInr和EST数据库,并对二级质谱获得的蛋白序列进行MS BLAST分析。【结果】经第一维阴离子交换色谱分离,收集得到15个组分,其中第15组分包含小麦叶片丰度最高的蛋白——1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶（RuBisCO）;其余14个组分经反相液相色谱分离,共收集1 551个组分,获得1 867个色谱峰;随机对其中6个含较低吸收峰的收集组分酶解和Nano LC-MS/MS 检测,9种蛋白得到鉴定。【结论】结果初步表明,利用2D-LC和Nano LC-MS/MS技术可有效地分离和鉴定小麦叶片蛋白质组,为更深入全面地研究小麦叶片蛋白质组奠定基础。     

寒胁迫诱导灰木相思无性系差异蛋白的表达

本实验提取寒胁迫前后的灰木相思组培苗的水溶性蛋白进行双向电泳和质谱鉴定,分析在寒胁迫条件下蛋白质组的变化。利用ImageMaster 5.0软件分析比较,经基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱测定差异蛋白点的肽质量指纹图谱,通过Mascot软件查询Swiss-Prot等数据库,鉴定得到4个显著差异蛋白点,R7、R15、R20表现为上调表达,R17表现为下调表达。结果表明:在寒胁迫条件下灰木相思组培苗存在明显的蛋白质表达差异。     

基于质谱的代谢组学数据分析技术研究进展

代谢组学是系统生物学研究的重要组成部分,是一种对特定条件下生物体内所有内源性小分子代 谢物进行全面定性和定量分析的技术。质谱和核磁共振系统的不断更新迭代推进了代谢组学技术的迅猛发展, 其中质谱技术因其能同时检测出数千个生物流体、细胞和组织中的代谢物,且所需前处理步骤简单,已发展为 当前代谢组学研究中应用最广泛的技术,开发基于质谱的代谢组学数据分析方法也因此成为过去 10 年代谢组学 研究的热点领域。对基于 GC-MS 和 LC-MS 的代谢组学数据预处理、代谢组学数据统计分析、代谢途径富集分析, 以及未知代谢物鉴定 4 个方向取得的研究进展进行系统总结,详细介绍常用的数据分析策略和分析软件;并重 点综述了包括基于数据库、分子网络算法、人工智能算法等未知代谢物鉴定的前沿方法,最后展望了基于质谱 的代谢组学数据分析的未来发展方向,在已知生化反应和分子网络分析的基础上再整合代谢物合成的遗传位点 等信息,有望进一步提高代谢物的鉴定数量和准确度。全面综述基于质谱的代谢组学数据分析技术,将为开发 新的代谢组学分析方法和挖掘代谢组学数据的生物学意义提供重要的参考和思路。     

二维电泳和质谱技术鉴定BmNPV包埋型病毒粒子的蛋白组成

 【目的】BmNPV包埋型病毒ODV（occlusion-derived virus）粒子在BmNPV感染家蚕初期起了非常重要的作用,主要包含了病毒感染初期所必须的蛋白质,解析其蛋白组成有利于进一步理解病毒和宿主关系,同时也为了进一步了解BmNPV的生活史提供依据。【方法】利用二维电泳对ODV病毒蛋白进行分离,采用考马斯亮兰G-250染色,经质谱鉴定。【结果】共获得70个蛋白点,大部分集中在等电点5～9之间,约占蛋白点总数的61%。其中59个蛋白点适合质谱分析, 数据库检索出20种蛋白,其中13种与AcMNPV中鉴定一致,而另7种蛋白是BmNPV中新鉴定出来的。此外,在二维电泳图谱上显示GP41蛋白点有21个,VP39蛋白点有9个。【结论】超速离心结合PCR技术提取ODV蛋白方法可行;二维电泳和质谱联用技术是一种研究病毒蛋白质组快速有效的方法。     

光温敏雄性不育玉米9417雄穗幼穗期叶片叶绿体蛋白质差异分析

为了研究玉米"两用系"9417雄穗不育的分子机制,以玉米光温敏雄性不育系9417的不育和可育2种状态的植株为材料,利用SDS-PAGE、质谱和生物信息学等技术,对其幼穗分化敏感期叶片中叶绿体差异表达蛋白质组进行分离和鉴定。电泳图谱显示,光温敏雄性不育、可育株在雄穗分化发育敏感时期叶绿体表达蛋白至少存在4条显著的差异条带,其中No.1、No.2是可育株中存在而不育株缺失的条带;No.3、No.4是不育株存在可育株中缺失的条带。质谱分析共鉴定出4种蛋白质:①AOL_s00004g466、②luc7-like protein 3-like、③putative T3SS effector EspN2-2、④ABC transporter ATP-binding protein。可育株中No.1为假定蛋白,No.2蛋白的U1-snRNP成分在RNA的加工和修饰中起介导自身与帽结合蛋白相结合的作用;不育株中No.3蛋白具T3SS效应,No.4蛋白在膜上ATP结合区域具单向转运底物的作用。叶绿体出现差异蛋白质,可能与雄性败育、不育有关。     

微囊藻受短时超声波胁迫蛋白表达差异研究(英文)

为探索微囊藻抵抗短时超声波表达调控相关蛋白质,应用双向电泳技术对微囊藻短时超声波处理蛋白质表达进行分析,结果表明,71个蛋白质点上调,56个蛋白质点下调,54个新增蛋白质点,21个消失蛋白质点。对其中8个差异大的蛋白质点采用MALDA-TOFMS进行质谱分析,并经数据库搜索匹配,鉴定出2个未知蛋白、6个功能蛋白。这些功能蛋白参与抗氧化和抗炎症、磷酸盐合成、电子传递等生理过程,实现微囊藻在短时超声波胁迫下的代谢平衡和自我保护。