鸡大肠杆菌O2/O74混合血清型菌株iss基因的克隆与序列测定

采用PCR方法对1株O2/O74混合血清型鸡大肠杆菌检测其iss基因的存在,并与1株O2血清型鸡大肠杆菌相比较.结果表明:鸡E.coli O2/O74混合血清型菌株携带iss基因,但采用目前通用的PCR方法并不能检测出iss基因,必须经套式PCR扩增才能检测出iss基因.O2/O74混合血清型菌株iss基因序列与已知禽大肠杆菌iss基因序列同源性为99.7%;与人源大肠杆菌iss基因进行比对,同源性为90.6%;与λ噬菌体bor 基因序列进行比对,同源性为88%,显示了此基因的保守性.     

鸡大肠杆菌1型菌毛fimH蛋白结构基因克隆及序列测定

根据已发表的大肠杆菌1型菌毛fimH基因序列,以产1型菌毛菌株MG2(O11)、YR5(O78)、MG12(O18)基因组DNA为模板,对大肠杆菌1型菌毛fimH基因进行扩增并与国外同源菌株基因序列进行比对。结果表明:核酸同源性分别为97.8%、99.7%、97.8%,氨基酸序列的相似性分别达到98.7%、99.3%、98.0%。运用DNA-STAR软件对fimH蛋白抗原决定簇进行预测分析,发现它们的抗原决定簇基本相似,这说明fimH基因序列及氨基酸序列的变异并未对fimH蛋白的抗原结构产生明显影响。     

鸡源大肠杆菌与人源大肠杆菌Ⅰ型菌毛蛋白同源性比较

应用DNA-Star分析软件对3个不同血清型鸡源大肠杆菌YR10(O18)、MG10(O11)及GL7(O78)与人源大肠杆菌(pSH2)Ⅰ型菌毛蛋白结构基因(pilA)序列、氨基酸序列、二级结构及抗原决定簇进行了比较分析。结果表明,鸡源与人源大肠杆菌结构基因序列相似性为:GL7(O78)对pSH2为88.9%;YR10(O18)对pSH2为92.3%;MG10(O11)对pSH2为98.3%。氨基酸序列相似性为:GL7(O78)对pSH2为90.2%;YR10(O18)对pSH2为95.1%;MG10(O11)对pSH2为98.9%。可见,3个菌株Ⅰ型菌毛蛋白的二级结构及抗原表位与人源存在较多的相似性。     

三株O_(78)、O_(137)混合血清型鸡大肠埃希菌iss基因的序列分析

采用1日龄雏鸡对3株O78、O137混合血清型鸡大肠埃希菌的致病性进行了测定,并扩增了iss基因。结果表明,3株O78、O137混合血清型鸡大肠埃希菌均对1日龄雏鸡具有较强的毒力。iss基因在3株O78、O137混合血清型鸡大肠埃希菌中的序列与已知的禽大肠埃希菌iss基因序列的同源性为100%,与人源大肠埃希菌iss基因序列的同源性为90.9%,显示了此基因的保守性。     

3个血清型鸡源大肠杆菌1型菌毛蛋白抗原位点变异分析

采用Goldkey及DNA Star分析软件对发表的3个不同血清型的鸡大肠杆菌1型菌毛结构基因(pilA)进行同源性及抗原位点分析。结果显示,3种鸡大肠杆菌(O_1、O_(78)及O_(88))l型菌毛pilA基因相似性为91.36％～98.38％,所编码的氨基酸同源性为93.50％～97.84％;3种血清型鸡大肠杆菌(O_1、O_(78)及O_(88))1型菌毛蛋白二级结构在1～73位及150～185位氨基酸的二级结构基本相似,而111～150位氨基酸的α螺旋与β折叠的数量有所不同。菌毛蛋白亲水性、抗原性及抗原决定簇预测表明,来源于3种血清型大肠杆菌的1型菌毛蛋白在l～110位及150～184位氨基酸存在相似的二级结构及抗原位点,且不同血清型之间存在一定的共同抗原。     

禽大肠杆菌O2、O78菌株外膜蛋白A基因扩增及序列分析

根据Genbank中大肠杆菌K-12外膜蛋白A基因的核苷酸序列设计引物，从禽大肠杆菌O为O2、O78及它们的融合株O2．78(Chl^rNor^r)中分别扩增得到外膜蛋白A基因(ompA)，进行序列测定及分析发现3个菌株的ompA均由2276nt组成，核苷酸序列完全相同，只有一个大的开放性阅读框(ORF)，长1041bp，编码由346个氨基酸组成的前外膜蛋白A(pro-OmpA)，前21个氨基酸残基组成信号肽，成熟的OmpA由325个氨基酸残基组成，相对分子质量为37000．其氨基酸序列也完全相同．从基因水平上证明了禽大肠杆菌O2和O78菌株存在相同的外膜蛋白A抗原。     

鸭源致病性大肠杆菌Ⅰ型菌毛pilA基因序列测定及生物信息学分析

据GenBank中人源大肠杆菌pilA基因序列,由Oligo 6.0设计一对引物,以提取的鸭源致病性大肠杆菌基因组为模板,进行PCR扩增,获得了5株鸭源致病性大肠杆菌的pilA基因,序列测定和生物信息学分析表明:鸭源致病性大肠杆菌pilA基因核苷酸序列长度为549 bp,编码182aa,与人源、鸡源及猪源大肠杆菌pilA基因之间核苷酸同源性为87.3%~100.0%,氨基酸同源性为87.5%~100.0%。对不同宿主来源大肠杆菌pilA基因所编码蛋白的二级结构、亲水性、抗原性、抗原表位进行预测分析比较,结果显示Ⅰ型菌毛间具有一定的结构相似性,并存在一定的共同抗原位点;系统进化分析表明,各菌株之间的pilA基因遗传相关性与其宿主来源及血清型之间没有严格的相关性。     

鸡大肠杆菌FimH基因C端结构域克隆及特性分析

[目的]通过进一步研究禽大肠杆菌I型菌毛主要结构基因FimH的基因结构及其抗原特性,为深入探索鸡大肠杆菌致病机理及研制基因工程疫苗奠定必要的理论基础。[方法]本文以已发表的Fim H基因C端核酸序列为参考序列,设计并合成引物,扩增鸡大肠杆菌JS1、JS2、JS6三个菌株的Fim H相应基因,使用Lasergene软件对其进行序列比对、蛋白质结构预测以及进化树的绘制等。[结果]JS1、JS2、JS6三个菌株的核酸同源性分别为97.3%、97.7%和97.3%,而氨基酸序列的相似性分别为95.3%、97.6%和95.3%。此外,其抗原决定簇基本相似,但在第78和79位抗原决定簇不同,这说明本研究中的3个鸡大肠杆菌菌株的Fim H基因序列及氨基酸序列的变异可能对Fim H蛋白抗原结构产生了轻微影响。进化树分析发现,本实验室分离的3株鸡大肠杆菌菌株FimH基因与选择的国内鸡大肠杆菌菌株的Fim H基因同源性比较高,同处于一个进化分支中。[结论]本研究结果表明鸡大肠杆菌I型菌毛Fim H基因未发生明显变异,这为后续研究Fim H基因的功能及其基因工程亚单位疫苗研发提供了重要的实验基础。     

集约化猪场PWD病原性大肠杆菌毒力因子分析

探索浙江省集约化猪场仔猪断奶腹泻(PWD)病原性大肠杆菌血清型和毒力因子特征,为PWD防治及耐药性研究提供资料.从10个规模化猪场以直肠棉拭子采集PWD病料,经细菌分离纯化、革兰氏染色、生化试验和小鼠致病性试验等,对病原进行鉴定.采用11种猪源大肠埃希氏茵常见O型抗原血清、应用K88及F18菌毛单因子血清对分离茵进行玻板凝集试验和PCR方法分析黏附素及肠毒素类型.分离鉴定的56株病原性大肠杆菌O抗原定型了33株,共覆盖了11种血清型,其中O149、O139、O8为优势血清型,共17株,占定型菌株的51.5%;茵毛单因子血清玻板凝集试验和PCR测得病原性大肠杆菌中产肠毒素大肠杆菌(ETEC)比例较高,占病原性大肠杆菌分离总数的67.92%(36/53),肠毒素中含STa、STb、STa+STb、LT和SL-2e分别占总检测菌株数的30.19%(16/53)、35.85%(19/53)、18.9%(10/53)、1.89%(1/53)和9.43%(5/53).黏附素类型主要有K88和F18两种,分别占总检测菌株数的24.53%(13/53)和28.30%(15/53).结果表明,浙江省PWD病原性大肠杆菌至少覆盖了包括优势血清型O149、O139、O8在内的11种血清型;大肠杆菌中以产肠毒素型为主,主要毒力因子包括黏附素F18及K88和肠毒素STa、STb、SLT-2e等.     

河北省南部鸡肝周炎大肠杆菌的分离及血清型鉴定

通过对2003年3月～2008年4月,自河北省邯郸市、邢台市、石家庄市、衡水市、沧州市等发病鸡场呈现典型肝周炎病变的病死鸡肝脏分离的132株致病性大肠杆菌进行了生化特性测定,O抗原血清型鉴定及药敏试验。结果表明132株均符合大肠杆菌生化特征,试验用55种大肠杆菌单因子阳性血清进行O血清型鉴定,确定了103株O血清型,占分离菌株数的78.03%(103/132)。选取O1、O21、O65、O78、O93血清型共15株菌株(每一血清型选取3株不同来源的菌株)做药敏试验,证实多数菌株对丁胺卡那霉素高敏,对头孢曲松中敏,而对磺胺甲硝唑耐受。     

大肠杆菌O157 Stx噬菌体裂解酶的克隆表达及活性分析

为研究大肠杆菌O157Stx噬菌体编码的裂解酶(内溶素)对肠出血性大肠杆菌的抗菌作用,克隆表达了大肠杆菌O157Stx噬菌体裂解酶,并检测其裂解作用和裂菌谱。利用PCR方法扩增大肠杆菌O157Min27株中Stx2噬菌体裂解酶基因(R基因),构建表达质粒pET28a(+)-lysEC1,并转化至大肠杆菌BL21(DE3)。重组质粒在BL21中获得了高表达,目的蛋白表达量占菌体总蛋白的34%,经His-trapTM亲和层析柱纯化后,获得的重组LysEC1的纯度大于97%。体外裂解活性试验证实纯化的噬菌体裂解酶LysEC1对肠出血性大肠杆菌菌株具有很好的裂解作用,这为新型噬菌体抗菌生物制剂的研发提供了新的研发方向。     

大肠埃希氏菌O157:H7的HDA检测方法的建立

采用自行建立和优化的依赖解旋酶DNA恒温扩增(HDA)检测体系,建立HDA检测方法对大肠埃希氏菌O157:H7进行检测。采用大肠埃希氏菌O157:H7的rfbE基因为目的片段设计特异性引物,建成可快速检测大肠埃希氏菌O157:H7的HDA检测法,进行了特异性和灵敏度试验,并与普通PCR方法进行了比较。结果表明:所建立起的检测法,灵敏度为4.3×103 cfu·mL-1,灵敏度与普通PCR方法相当。大肠埃希氏菌O157:H7的依赖解旋酶DNA恒温扩增检测方法具有普通PCR的特异、灵敏等特点,并且对仪器要求更低,用普通水浴槽即可进行反应。具有广阔的推广前景。     

新疆奶牛乳源大肠杆菌Irp2毒力岛的克隆及序列分析

采集新疆奶牛隐性乳腺炎乳样,经分离、鉴定,从中得到乳源大肠杆菌,并将大肠杆菌菌株用大肠杆菌O因子血清标定。根据GenBank已发表的Irp2基因序列,用Oligo 6.0生物软件设计一对特异性引物。对分离得到的大肠杆菌菌株提取基因组DNA,利用聚合酶链式反应(PCR)进行扩增。结果表明,所分离大肠杆菌中Irp2基因阳性率为35.3%(12/34),阳性样品的测序结果与已发表的Irp2基因序列高度同源,同源率在98%以上。同时发现Irp2基因的阳性率与血清型并没有相关性。     

鸽源大肠杆菌O157：非H7菌株的致病性和耐药性分析

为查明南京市某赛鸽公棚赛鸽出现腹泻、死亡的致病病原,本研究对采集的病料进行病原分离鉴定,分析致病菌的血清型、生物被膜表型、毒力基因、耐药菌谱,并对分离菌株进行了人工感染试验。研究表明:1)从患病鸽组织、拭子和粪便中分离出的细菌初步诊断为大肠杆菌O157;分离菌株在NA平板上长出白色、光滑的圆形菌落,在CT-SMAC平板上长出紫红色菌落。2)分离菌株的16S rRNA基因序列与大肠杆菌的相似性达98%~99%,命名为E.c.86246。3)血清学试验表明分离菌株为大肠杆菌O157:非H7菌株,动力试验进一步证实其为动力株。4)分离菌株携带tccp1014、eaeA和hly毒力基因,可导致雏鸡胃肠道出现不同程度的功能损伤,甚至导致死亡;其半数致死量为2.0×10⁵ CFU/mL,具有较强的致病性。5)分离菌株携带tetA、tetM、sul2、aadA1和bla_TEM 5种耐药基因,具有较弱的生物被膜形成能力,对四环素、氨基糖苷类等抗菌药物严重耐药,对阿莫西林、氧氟沙星和诺氟沙星敏感。综上,本研究分离的鸽源大肠杆菌O157:非H7菌株,具有动力性,有较强的致病性和一定的耐药性,为大肠杆菌O157的流行病学调查、致病机理分析和抗菌药物的精准施治提供理论依据和数据参考。     

Distribution of Virulence-Associated Genes of Avian Pathogenic Escherichia coli Isolates in China

216 avian pathogenic Escherichia coli (APEC) isolates were obtained from poultry with colibacillosis in different areas of China. Among them, 195 were serotyped as O78, O88, and O93. Thirteen virulence-associated genes, including fimC, iucD, iss, tsh, fyuA, irp2, eaeA, hlyE, colV, papC, stx2f, vat, and astA, were submitted to PCR amplification. The fimC gene was the most prevalent with a detection rate of 93.6%, followed by iucD (70.8%), iss (58.8%), and tsh (51.4%) in APEC isolates. The detection rate of high pathogenicity islands (HPI)-associatedfyuA and irp2 genes were both 44.9%, with no LEE (the locus of enterocyte effacement) island-associated gene eaeA detected. In terms of distribution patterns of the 13 virulence-associated genes, 5 isolates harborbed 10 genes, 19 isolates contained only fimC gene, and only 4 isolates had no virulence-associated gene detected. Different correlations of the virulence-associated genes with O serotypes were also investigated and 50% O78 isolates had a gene distribution patterns of fimC+iucD+irp2+fyuA+iss+colV+tsh+.     

鸭致病性大肠埃希菌的分离鉴定与毒力基因检测及菌蜕制备

从江苏省某水禽场的疑似感染致病性大肠埃希菌的病鸭中分离获得鸭致病性大肠埃希菌野毒株;通过玻板凝集和试管凝集试验确定其血清型,采用PCR进行分群分析和毒力基因检测;扩增φX_(174)噬菌体裂解蛋白E的基因序列,构建温控型表达质粒pBV221–E,并将其电击转化入分离毒株,升温诱导E蛋白表达制备菌蜕;通过测量菌液A600 nm值和在透射电镜下观察细菌形态,评估菌蜕构建效果;用该菌蜕进行灭活处理和无菌检测后,对雏鸭进行免疫,用间接ELISA法检测血清IgG水平。结果表明:该大肠埃希菌的血清型为O24,属于B1群,具有毒力基因fimC、csgA和iroN;获得的鸭致病性大肠埃希菌菌蜕裂解率为99.96%;经透射电镜观察发现,制备获得的菌蜕表面有明显孔道,细胞质从孔道溢出,细胞膜皱缩变形;抗体水平检测结果显示,二免后菌蜕免疫组雏鸭血清IgG水平显著提高。可见,通过将pBV221–E重组质粒转化至鸭致病性大肠埃希菌分离株,调节细菌培养温度诱导E蛋白表达,能制备鸭致病性大肠埃希菌B1群O24型野毒株菌蜕。该菌蜕可诱发机体产生体液免疫。     

禽大肠杆菌耐药标记弱毒菌株O_2(Nor~r,Chl~s)和O_(78)(Chl~r,Nor~s)的培育

选择最常见的禽致病性大肠杆菌Ｏ２和Ｏ７８菌株，分别以常用的抗菌药物氟哌酸和氯霉素诱导，培育成遗传性稳定的耐药标记弱毒菌株Ｏ２（Ｎｏｒｒ，Ｃｈｌｓ）和Ｏ７８（Ｃｈｌｒ，Ｎｏｒｓ），为进一步运用原生质体融合技术培育Ｏ２和Ｏ７８融合双价耐药弱毒菌株打下了基础