狂犬病快速诊断方法的建立和应用

根据狂犬病病毒核蛋白基因保守区序列设计1对引物，建立了用于狂犬病病毒特异性核酸检测的RT-PCR技术。该技术可从狂犬病病毒CVS株、8202株和SRV9株的含毒细胞培养物及鼠脑组织中．扩增出443bp的核酸片段，检出核酸的敏感性约为3pg。对30份不同种动物脑组织的检测结果与小鼠脑内接种试验(MIT)的测定结果完全吻合，但前者可在3h内直接对组织匀浆进行诊断，具有快速、简便和敏感的优点。     

狂犬病病毒rSRV9减毒株与亲本SRV9毒株的病毒毒力比较

通过半数荧光灶形成量(FFD50)试验、小鼠半数致死量(LD50)试验、免疫组织化学试验,对10个培养代次的狂犬病病毒SRV9亲本毒株和rSRV9减毒株的病毒滴度、毒力及其致病性等病毒生物学特性进行检测,以鉴定拯救狂犬病rSRV9减毒株与亲本SRV9毒株病毒滴度及毒力的差异性。试验结果显示,10个培养代次的狂犬病病毒rSRV9减毒株FFD50值为5.44～7.46logFFD50/0.1mL,LD50值为2.47～2.68logLD50/0.03mL;亲本SRV9毒株FFD50值为6.36～6.79logFFD50/0.1mL;LD50值为5.56～5.79logLD50/0.03mL,通过免疫组织化学试验,检测出脑内注射SRV9毒株和rSRV9减毒株死亡小鼠脑神经细胞内的狂犬病病毒。     

新型鸭肝炎病毒感染雏鸭组织内病毒抗原的分布

应用免疫组织化学方法,对人工感染新型鸭肝炎病毒雏鸭体内的病毒分布进行了动态观察。结果表明:接种后不同时间,在肝脏、脾脏、胰脏、胸腺和法氏囊组织中均可检测到新型鸭肝炎病毒抗原,而肾脏、心脏、脑组织中均未检测到病毒抗原。病毒抗原均位于阳性细胞的细胞质中。研究结果提示,感染雏鸭的肝脏和胰脏的组织病理变化与病毒的分布有关。     

猪伪狂犬病血清学诊断与防制

伪狂犬病是由疱疹病毒科的伪狂犬病病毒引起的一种家畜及野生动物的传染病,在世界各地广泛流行。在我国,该病对猪的危害很严重,能引起仔猪的高发病率,成年猪症状微轻,常呈现隐性带毒,成为新的传染源。用血清学方法检测猪血清中伪狂犬病病毒抗体,在猪伪狂犬病的诊断、流行病学调查及疫苗免疫效果的检测上有一定的意义。本试验应用间接ELISA方法检测猪伪狂犬病病毒抗体,调查猪伪狂犬病的流行情况,     

免疫组织化学方法诊断猪圆环病毒病

以猪圆环病毒Ⅱ型ORF2(PCV2-ORF2)重组蛋白为抗原,按常规免疫方法免疫家兔,制备兔抗猪圆环病毒Ⅱ型ORF2重组蛋白的IgG,以此IgG为第一抗体,采用免疫组织化学二步法,对临床疑似猪圆环病毒病例及RT-PCR确诊为阳性猪圆环病毒病例的肺脏组织切片进行检测。试验结果证明,该免疫组织化学方法具有良好的特异性、直观性,简单易行,可以对猪肺巨噬细胞中的存在的PCV2病毒抗原进行准确的定性和定位诊断。     

Balb/c小鼠新孢子虫病动物模型的建立及在其体内发育过程的研究

 【目的】建立Balb/c小鼠感染新孢子虫的急性和亚急性发病模型,并研究新孢子虫在小鼠体内的发育过程。【方法】分别对两组小鼠腹腔接种新孢子虫8×106个/只和5×105个/只,接种后小鼠进行定时宰杀,取心、肝、肺、脑和后肢肌肉等进行组织病理学、免疫组织化学和PCR检测。【结果】发现Balb/c小鼠感染后病理变化主要表现为各器官组织的广泛性出血,非化脓性脑炎和肝细胞空泡变性。接种后第16天观察到脑组织内包囊,在其它组织中未观察到包囊样结构。PCR检测结果显示,接种后12 h即可检测到肺脏和心脏组织内的新孢子虫特异性基因Nc-5,脑内最早于第8天检测到。接种25 d后在肝脏、肺脏和脑内仍能检测到新孢子虫基因。综合观察和检测结果,发现新孢子虫对肝脏、肺脏和脑组织有一定的组织亲嗜性;雄性小鼠对新孢子虫更为敏感。【结论】 成功建立了新孢子虫感染Balb/c小鼠的急性和亚急性发病的动物模型;跟踪观察了新孢子虫在小鼠体内各器官组织出现时间、持续时间以及分布的规律,初步掌握了新孢子虫在其体内发育的动态过程。     

表达猪2型圆环病毒ORF2基因的重组伪狂犬病病毒的构建及鉴定

【目的】以伪狂犬病病毒为载体，构建表达猪2型圆环病毒ORF2基因的重组病毒，并研究其生物学特性。【方法】将猪2型圆环病毒ORF2基因插入到伪狂犬病病毒gG缺失通用转移载体中，构建猪2型圆环病毒-伪狂犬病病毒重组中间转移质粒，然后将该质粒与伪狂犬病病毒TK-/gG-/LacZ+基因组共转染IBRS-2细胞，待发生细胞病变后收集病毒液进行重组病毒的筛选及生物学特性测定。【结果】利用检测PCV2 ORF2基因和LacZ基因的PCR方法筛选到重组病毒TK-/gG-/ORF2+，同时用Southern blotting证实外源基因PCV2 ORF2已成功插入到TK-/gG-/LacZ+亲本株的基因组中。间接免疫荧光试验（IFA）和Western blotting结果显示重组病毒中PCV2 ORF2基因获得了成功表达。对重组病毒的生物学特性研究表明，重组病毒与其亲本株在不同细胞上的增殖滴度相当，且重组病毒对小鼠无致病性，免疫小鼠后可诱导机体产生抗ORF2蛋白的特异性抗体。【结论】重组伪狂犬病毒构建成功，且表达的ORF2蛋白具有免疫原性。     

猪血凝性脑脊髓炎病毒RT-PCR方法的建立及初步应用

为了建立快速检测猪血凝性脑脊髓炎病毒(HEV)的RT-PCR方法,根据GenBank中HEV的HE基因和S基因设计了1对引物,在优化RT-PCR反应条件的基础上,成功的扩增出323bp的特异性条带。检测与HEV亲缘性较高的牛冠状病毒及猪的伪狂犬病毒均为阴性,最低可以检测到10个TCID50/100μl的病毒,说明该方法的有较好的特异性和敏感性。用此RT-PCR方法对感染HEV的小鼠和猪进行检测,结果能从发病动物的多种组织中检测到病原,其中以脑组织的检出率最高。因此,临床疑似病例检测时以脑组织为最佳检测样本。     

对犬免疫兽用狂犬病疫苗效果的评价

为了预防和控制狂犬病发生,对2种兽用狂犬病(ERA株)活疫苗和3种进口兽用狂犬病灭活疫苗进行了免疫效果和安全性实验。本项试验采用小鼠中和试验和RFFIT试验方法,分别对63只注射了狂犬病(ERA株)活疫苗的健康成年家犬和102只注射了狂犬病灭活疫苗的健康成年家犬进行了免疫抗体监测(按OIE标准,血清抗体滴度≥0.5IU/ml为免疫保护标准);采用ELISA方法监测试验犬唾液中的狂犬病毒抗原并且PCR扩增定性。结果:狂犬病灭活疫苗比兽用狂犬病(ERA株)活疫苗免疫后的血清抗体滴度高、持久性好、安全;注射狂犬病灭活疫苗后,随着血清抗体滴度的升高能有效降低外观健康隐性带毒犬唾液中的病毒量。家养动物定期免疫注射兽用狂犬病灭活疫苗、逐步淘汰狂犬病毒阳性犬是我国控制和消灭狂犬病的重要途径。     

外观健康家犬携带狂犬病病毒状况调查

为了解外观健康家犬携带狂犬病病毒的状况,采用RT-PCR方法对广西13个城市外观健康家犬的脑组织进行了检测,结果阳性率为1.76%(5/283),证明广西外观健康家犬在一定程度上存在带毒现象。     

黄牛狂犬病病毒的分离和鉴定

应用鼠脑传代,从具有神经症状的病牛脑组织中分离获得5株病毒,经电子显微镜观察呈典型弹状病毒样粒子.用抗狂犬病毒CVS(狂犬病毒Ⅰ型代表株)免疫血清作ELISA检测及小鼠中和试验,证明分离株病毒为狂犬病毒.用狂犬病相关病毒Lagos bat(狂犬病毒2型)、Mokola(狂犬病毒3型)和Duvenhage(狂犬病毒4型)免疫血清对分离株病毒作交叉中和试验,结果发现分离株病毒与Duvenhage有较密切的抗原联系.而与Lagos bat及Mokola病毒没有抗原联系.用自制狂犬病毒“核蛋白”单克隆抗体作夹心间接ELISA检测分离株病毒的感染鼠脑均呈阳性反应,5株病毒与CVS及其互相之间没有明显差异.结论认为,由河南省黄牛分离的病毒为狂犬病毒.     

RV野毒株的鉴定,毒力实验及其核酸探针的研究

对从我国不同地区、不同动物分离的３个疑似狂犬病毒分离物８２０２、ＢＲＶ、ＭＲＶ和无毒疫苗株ＳＲＶ９进行了ＥＬＩＳＡ和核酸探针的鉴定。同时，对它们的致病性和毒力进行了测定。结果表明，３个分离物均为狂犬病病毒，其毒力以鼠源ＭＲＶ最强，牛源ＢＲＶ最弱，同地下同动物分离的ＢＲＶ和ＭＲＶ毒力差异很大。疫苗株ＳＲＶ９对１２ｇ小鼠无致病性，研制的狂犬病毒地高辛标记核酸探针敏感性高，特异性强，适用于对狂犬病病料进     

河南省动物狂犬病的诊断与防制研究

从河南病牛脑组织中分离到5株牛狂犬病病毒,用电镜、间接免疫荧光试验等方法鉴定分离病毒的生物学特性。通过微量免疫酶试验,对疫区牛、马、猪、羊、犬、猫、鸡、鼠和蝙蝠9种动物的1 138份血清标本进行检测,阳性率12.65%;其中,疫点内牛、猪、犬、猫和鼠的血清阳性率更高,为20%左右。     

eGFP标记狂犬病病毒G基因与EgM123基因重组融合蛋白的表达与鉴定

【目的】反向遗传学技术构建EgM123基因重组狂犬病SRV₉病毒疫苗株,研究狂犬病病毒G基因、细粒棘球绦虫EgM123基因、eGFP基因重组质粒在真核细胞中的蛋白表达效果与蛋白免疫原性,为通过反向遗传学拯救eGFP标记EgM123基因重组狂犬病病毒,制备狂犬病-包虫病二联基因重组疫苗提供研究基础。【方法】将已构建的携带eGFP增强型绿色荧光蛋白的狂犬病病毒G基因重组细粒棘球绦虫EgM123基因重组质粒(3033 bp)利用脂质体转染方法转染BHK-21细胞,使其在BHK-21细胞中表达出融合蛋白,并通过荧光显微镜观察、SDS-PAGE聚丙烯酰氨凝胶电泳、Western blotting试验鉴定融合蛋白的荧光蛋白表达、融合蛋白分子量,鉴定其免疫原性。【结果】在转然后48 h可见绿色荧光蛋白的表达;通过SDS-PAGE聚丙烯酰氨凝胶电泳结果显示,重组质粒在BHK-21细胞中表达获得分子量约为120KDa的融合蛋白;Western blotting结果显示,将蛋白凝胶转移PVDF膜分别经狂犬病病毒G蛋白单克隆抗体、EgM123多克隆抗体、GFP单克隆抗体分别孵育,均在120KDa处可见抗原抗体结合条带。【结论】eGFP标记的狂犬病病毒G基因重组细粒棘球绦虫EgM123基因重组质粒在真核细胞中成功表达出融合性蛋白,且具有免疫原性,     

间接免疫荧光检测石蜡切片中鸭肿头出血症病毒及抗原定位方法的初步建立

 【目的】建立间接免疫荧光（IFA）检测石蜡切片中鸭肿头出血症病毒（DSHDV）的方法,为DSHDV感染的实验室诊断、DSHDV在感染鸭组织细胞中的亚细胞定位和动态研究提供有效的检测手段。【方法】用差速离心纯化DSHDV,将纯化DSHDV免疫家兔制备兔抗DSHDV高免血清,并以DEAE-SephadexA-50柱层析纯化出兔抗DSHDV IgG,建立IFA检测石蜡切片中DSHDV的方法;利用建立的IFA对28日龄鸭人工感染DSHDV死亡鸭不同组织器官以及临床样品进行检测。应用PAGE电泳分析DSHDV基因组特性。【结果】IFA最佳条件为：切片在0.01 mol•L-1 柠檬酸（pH 6.0）缓冲液微波修复20 min后,以10%马血清37℃下封闭30 min,然后加入1﹕50的一抗4℃孵育过夜,最后加入1﹕100 FITC标记的含0.01%伊文斯蓝的二抗37℃孵育30 min。IFA检测DSHDV感染死亡鸭肝脏石蜡切片为阳性,而检测鸭瘟、禽流感病毒(H5N1)、鸭病毒性肝炎、鸭疫里默氏杆菌感染死亡鸭肝脏石蜡切片为阴性。IFA检测28日龄人工感染DSHDV死亡鸭的不同组织器官,心、肝、脾、胰、肺、肾、法氏囊、食管、气管、胸肌、胸腺、十二指肠、空肠、回肠、盲肠和直肠为阳性;哈德氏腺、脑、皮肤、腺胃为阴性。阳性组织中病毒抗原主要分布在细胞浆。经甲醛固定保持1～6年的临床死亡鸭的病毒分离阳性肝脏,IFA检测结果也呈阳性。DSHDV具有呼肠孤病毒特征,有10条分节段核酸,呈“334”分布。【结论】建立的检测石蜡组织切片中DSHDV抗原的IFA具有直观、特异性强的优点,应用于DSHDV在感染鸭组织细胞中的亚细胞定位具有良好效果,可用于DSHDV感染的实验室诊断、病原在鸭组织细胞中分布研究。DSHDV抗原存在感染细胞浆,肠道、肾脏、法氏囊和胸腺是DSHDV侵害的主要靶器官。     

以合成肽为抗原建立口蹄疫病毒非结构蛋白抗体检测ELISA试剂盒

【目的】建立合成多肽抗原检测FMD NSP抗体的ELISA方法。【方法】固相法合成特异性FMDV NSP B细胞表位肽,将其偶联在BSA载体蛋白上,作为抗原包被在ELISA板上,制备检测抗FMDV NSP抗体的ELISA试剂盒,并对该试剂盒进行方法考核。【结果】抗原包被浓度选择2.5μg·mL-1;检测199份血清标本,与美国UBI商品试剂盒符合率达到96.48%,与国产3ABC ELISA比较,符合率为97.48%,显示极好的一致性。【结论】该合成肽ELISA试剂盒可以用以检测NSP抗体,从而鉴别FMD的自然感染与疫苗免疫,试剂盒特异性强,重复性好、稳定性高,操作简便。     

以合成肽为抗原建立口蹄疫病毒非结构蛋白抗体检测ELISA试剂盒#br#

【目的】建立合成多肽抗原检测FMD NSP 抗体的 ELISA 方法。【方法】固相法合成特异性FMDV NSP B细胞表位肽,将其偶联在BSA载体蛋白上,作为抗原包被在ELISA板上,制备检测抗FMDV NSP抗体的ELISA 试剂盒,并对该试剂盒进行方法考核。【结果】抗原包被浓度选择2.5μg•mL-1; 检测199 份血清标本,与美国UBI商品试剂盒符合率达到96.48%,与国产3ABC ELISA比较,符合率为97.48%,显示极好的一致性。【结论】该合成肽ELISA试剂盒可以用以检测NSP抗体,从而鉴别FMD的自然感染与疫苗免疫,试剂盒特异性强,重复性好、稳定性高,操作简便。     

Rabies virus in nasal mucosa of naturally infected bats

Rabies virus was demonstrated in the olfactory mucosa of naturally infected bats by staining with fluorescent antibody and by isolation of the virus from the nasal tissues. The olfactory mucosa is a potential portal of entry and exit for airborne rabies virus in bat caves.     

狂犬病毒G基因主要抗原表位区（Rmg）的表达及纯化

【目的】对狂犬病毒Rmg基因进行克隆、表达、纯化及复性,以期获得表达量高、反应原性好的Rmg蛋白,为研制快速、直观、简便检测狂犬病毒抗体的胶体金试纸条奠定基础。【方法】用常规PCR从狂犬病毒基因组中克隆出狂犬病毒G蛋白的主要抗原表位基因Rmg,并将其插入原核表达载体pET-Trx中,构建原核表达质粒pET-Trx-Rmg,将pET-Trx-Rmg转化BL21（DE3）plysS,在IPTG诱导下进行表达。【结果】SDS-PAGE分析结果表明,Rmg基因在BL21（DE3）plysS中获得高效表达,表达量占菌体总蛋白的30.5%左右,并主要以不溶的包涵体形式存在,分子量约为51.7 kDa。将表达的蛋白以亲和层析法进行纯化并通过谷胱甘肽还原法进行复性,纯化后蛋白纯度达99.1%。经Western blotting检测,发现表达的Rmg蛋白能够与狂犬病毒高免血清发生特异反应,但与犬细小病毒（CPV）、犬瘟热病毒（CDV）阳性血清不发生反应。【结论】Rmg蛋白具有良好的抗原性,可用于研制检测狂犬病毒抗体的胶体金试纸条。