新的抗草甘膦转基因棉花获得的初报

抗除草剂棉花的培育具有重要的农业生产利用价值。以常规棉花材料为受体,对转化受体的愈伤和幼苗进行草甘膦抗性浓度梯度的筛选试验;在此基础上,利用自主知识产权的草甘膦基因进行多抗草甘膦转化试验,获得了具有草甘膦抗性的棉花再生植株。PCR检测结果表明,该基因已被成功转入棉花受体基因组中。该研究结果可为后续抗草甘膦棉花的选育研究提供必要的新种质资源。     

抗除草剂草甘膦转基因作物

利用生物工程技术,培育出抗除草剂作物新品种、近年来研究发展迅速。草甘膦因其具有最优秀的除草剂特性而成为抗除草剂转基因作物研究的首选对象,抗草甘膦转基因大豆已培育成功并大面积种植。将抗性基因导入油菜、烟草、番茄、棉花、玉米等作物也获得了表达。本文对草甘膦的作用靶标酶———ＥＰＳＰ合酶的发现,抗草甘膦突变的ＥＰＳＰ合酶基因及变异的ＥＰＳＰ合酶抗性特点,及其将快速催化草甘膦代谢成无毒产物的酶的基因导入植物,而获得抗草甘膦作物研究作了概况综述。     

多启动子驱动苘麻epsps优化基因植物表达载体的构建及其转化

转基因抗草甘膦作物是商业化最广泛的转基因作物之一,但是棉花的雄蕊对草甘膦敏感,在四叶期后喷施草甘膦会造成抗草甘膦棉花雄性败育,不能正常授粉,最终导致产量降低。为降低草甘膦对棉花育性的不良影响,有针对性的构建了棉花生殖器官优势表达的arf1启动子、棉花草甘膦高效诱导表达的ag2启动子和组成型启动子CaMV35S驱动苘麻epsps优化基因的串联三表达盒植物表达载体,采用农杆菌喷花法将其转入棉花,对T0代喷施草甘膦筛选获得8株对草甘膦有较强抗性并且生殖发育正常的植株;PCR和RT PCR分析表明外源基因已整合至棉花基因组并正确表达。为探索用不同类型启动子驱动相同基因以扩大外源基因在植物中的表达范围和培育具有自主知识产权的抗草甘膦转基因棉花打下基础。     

肺炎克雷伯氏菌S001草甘膦靶标酶基因的克隆及其抗性验证

【目的】由于草甘膦在农业生产中的广泛使用,抗草甘膦转基因作物的研究一直是转基因作物研究的热点,其中草甘膦抗性功能新基因的挖掘是核心问题。自然界中微生物种类繁多,基因资源丰富,论文拟从广东地区农田土壤中筛选和鉴定出高抗草甘膦菌株,克隆其草甘膦靶标酶基因并进行抗性水平验证,以期获得高抗草甘膦新基因资源用于抗草甘膦转基因作物的研究。【方法】用含有浓度梯度草甘膦的选择培养基从备选土壤中筛选出具有高抗草甘膦特性的菌株;通过显微观察、革兰氏染色以及16S rDNA序列分析结果对菌株种类进行鉴定;利用RT-PCR技术克隆该菌株的草甘膦靶标酶基因aroAS001,并通过序列比对和系统发育树分析aroAS001序列的基本特征;利用重叠 PCR法对aroAS001变异位点进行定点突变获得aroAS001-mut序列后,将aroAS001和aroAS001-mut基因片段转入aroA基因缺陷型菌株DH5α/△aroA中进行基因功能互补和草甘膦抗性水平验证。【结果】分离出一株高抗草甘膦菌株,经形态学和分子生物学鉴定该菌株为肺炎克雷伯氏菌（Klebsiella pneumoniae）,命名为kpS001;克隆该菌株草甘膦靶标酶5-烯醇式丙酮酰莽草酸-3-磷酸合成酶（EPSPS）基因aroAS001,序列分析结果显示由该基因所编码的氨基酸序列具有典型的Class I EPSPS特征,但与已报道肺炎克雷伯氏菌的aroA相比其第227位碱基发生突变,致使对应的氨基酸发生变异。对该基因差异位点进行核酸定点突变获得aroAS001-mut基因片段后,将aroAS001和aroAS001-mut基因片段分别转入缺陷型大肠杆菌菌株DH5α/△aroA进行功能互补验证,与对照菌株相比,转入aroAS001和aroAS001-mut的重组菌株均能在含200 mmol?L-1以下浓度草甘膦的培养基中能够正常生长,表现出良好的抗性,之后随着草甘膦浓度增加其生长状态开始受到抑制,当草甘膦浓度达到350 mmol?L-1时,菌株生长基本完全被抑制。【结论】肺炎克雷伯氏菌kpS001菌株是一株高抗草甘膦菌株,由aroAS001编码的草甘膦靶标酶EPSPS属于Class I EPSP合成酶,aroAS001对草甘膦具有优良抗性,能在含350 mmol?L-1以下浓度草甘膦的培养基中生长,该基因可以作为备选基因资源用于抗草甘膦转基因作物的研究。     

抗草甘膦转基因玉米研究进展

草甘膦是广谱灭生性、内吸传导型除草剂,广泛应用于玉米生产,随着植物基因工程技术的发展以及全球转 基因作物种植面积的不断增加,抗草甘膦转基因玉米研发已成为玉米育种的重要内容。介绍了草甘膦的作 用机理,详细分析了抗草甘膦转基因植物基因工程策略。较为系统地分析了当前国内外抗草甘膦转基因玉 米研发及商品化应用进展,进而提出了针对我国抗草甘膦转基因玉米研发的策略。以期为我国抗草甘膦转 基因玉米研究提供参考。     

转基因抗除草剂作物及其食品安全性

一、转基因抗除草剂作物的发展抗除草剂作物的创制是植物生物技术应用最广泛的技术之一,大多数抗性品种都是采用分子生物学与植物转移技术将外源基因导入而成,从而使每种植物细胞获得外源基因后繁殖成再生植株。在转基因作物中,发展最快的是抗除草剂作物,其中主要是大豆、油菜、玉米与棉花。1993年第一个抗磺酰脲类除草剂大豆品种在生产中开始应用,1996年抗草甘膦大豆品种推广,1998年抗草铵膦大豆品种试验种植,目前虽然已创制出各种抗不同除草剂的转基因作物,但以抗草甘膦作物的种植面积最大,如2000年美国种植抗草甘膦大豆面积3000万hm2,占…     

抗除草剂转基因作物

抗除草剂转基因作物近十余年研究迅速,就其主要研究方面作了概述。１Ｂａｒ基因及ｐａｔ基因转入作物,可获得抗草丁膦烟草、番茄、小麦、水稻等;２多种植物的ＥＰＳＰ合成酶基因可产生抗草甘膦的突变,现Ｍｏｎｓｏｔｏ公司商品化的抗草甘膦大豆基因来源于ＣＰ４ＥＰＳ会成酶基因,一些氧化、代谢酶可将草甘膦快速成无毒化合物而将这些酶基因转入作物,是获得抗草甘膦的另一余径;３植物ＡＬＳ酶基因突变及酶量的过量产生,是产生抗磺酰脲及咪唑啉酮类除草剂的主要原因;４土壤中一微生物的硝酸酶ｂｘｎ基因,是溴苯腈的抗性基因;５植物ｐｓｂ基因多点突变、均可产生抗阿特拉津作物;６一些细胞色素Ｐ４５０及卤素酶等快速代谢除草剂,从而利用此类酶基因获得抗除草剂作物;７愈伤组织培养,悬浮细胞培养,原生质体培养等生物技术也是获得抗除草剂作物的重要手段。     

肠杆菌20yhhs基因的克隆及功能分析

利用基因工程方法培育草甘膦抗性作物,是当前利用草甘膦的主要途径,然而,优良草甘膦抗性基因资源的缺乏是限制抗草甘膦转基因作物发展的限制因素,挖掘新型草甘膦抗性基因资源势在必行。极端环境微生物是分离重要功能基因的资源库。研究分离获得了一株高抗草甘膦菌株肠杆菌20,为解析其高抗草甘膦胁迫的分子机制,基于非靶位点草甘膦抗性机理,利用原核表达系统鉴定了其草甘膦离子转运相关基因yhhs的功能,进而对肠杆菌20耐受高度草甘膦胁迫的分子机制进行了讨论。     

转基因抗草甘膦大豆安全性评价及对环境影响的检测

杂草防治是大豆种植中的重要问题。美国、阿根廷等国家主要是通过种植抗草甘膦大豆，进而喷施草甘膦来消灭杂草。转基因抗草甘膦大疆在我国目前尚没有推广种植。为了保护野生大豆资源的多样性，研究抗草甘膦大豆的基因检测方法，对环境尤其是豆类近缘作物的基凶漂移愈来愈重要。本试验对从阿根廷引进的抗草甘膦大豆在田间种植后对大豆及其近缘种漂移可能性及检测方法进行了研究，并在南京点检测到发生基因漂移的野生大豆1株。这说明大豆与野生大豆发生基因漂移是可能的，同时也提示引种抗草甘膦大豆应有足够的安全控制措施，以免发生基因漂移而逸生为超级杂草。     

转基因抗草甘膦棉花及其对草甘膦抗性的时空表达

草甘膦是一种非选择性除草剂,它通过竞争性抑制莽草酸途径中的5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶(EPSP合酶)干扰芳香族氨基酸的生物合成而发挥毒性作用。虽然获得抗草甘膦棉花的途径有多种,但当前用于生产的抗草甘膦棉花主要是以CP4-EPSPS基因转化棉花获得的。草甘膦对转CP4-EPSPS棉花的营养生长没有不利影响,但4叶期后喷施草甘膦会显著降低花粉粒的活性,抑制散粉、授粉和结实,导致转CP4-EPSPS棉花对草甘膦抗性呈现出一定程度的时空变化。草甘膦对抗草甘膦棉花(雄性)生殖器官的抑制效应一方面源于草甘膦在生殖器官内的大量积累,另一方面在于CP4-EPSPS基因在(雄性)生殖器官的低效表达。促进CP4-EPSPS基因在全株高效表达是提高棉花对草甘膦抗性的重要途径。     

抗草甘膦转基因大豆（Glycine mac (L.) Merri）杂草性评价的试验实例

 【目的】评价美国孟山都公司生产的抗草甘膦转基因大豆40-3-2作为加工原料引入中国可能带来的演化为杂草的生态风险,验证转基因大豆杂草化环境安全评价条款的可操作性。【方法】在农田生态环境下比较了抗性大豆、受体品种和当地常规品种的生存竞争能力、繁育能力、自生苗、种子落粒性和延续能力。【结果】在适宜季节种植的转基因大豆的生存竞争能力和繁育能力明显低于当地常规品种,表现在复叶数少、植株较矮、结实率低;受体品种的生存竞争能力和常规品种相似,但繁育能力低于常规品种。在非适宜季节三者的生存竞争能力相似,而受体品种和抗性大豆的结实能力都比常规品种略强。3个品种的落粒性都不强,形成自生苗的可能性也都很小。所有供试大豆种子的延续能力都很弱。【结论】以上研究结果表明美国孟山都公司生产的抗草甘膦转基因大豆40-3-2在中国南京地区环境条件下演化为杂草的可能性较小,其作为加工原料进口后演化为杂草的生态风险小。试验证实了转基因大豆环境安全评价标准的杂草性条款具有可操作性。     

转G10aroA棉花株系的获得及分子生物学鉴定

【目的】培育具有抗草甘膦除草剂的棉花材料具有极其重要的意义。利用农杆菌介导法在棉花中转入编码EPSPS酶的抗草甘膦除草剂基因G10aroA,通过体细胞愈伤诱导组织培养技术获得能够稳定遗传的转基因棉花株系材料。【方法】首先,利用不同草甘膦抗性筛选条件比较分析不同棉花受体材料的愈伤诱导效率;其次,以R15材料作为受体,利用含有G10aroA的农杆菌侵染下胚轴切段,在进行体细胞愈伤诱导的组织培养过程中通过草甘膦抗性筛选获得棉花再生植株,对获得的棉花再生植株进行纯合繁育。在此基础上,利用PCR扩增检测证实外源G10aroA在转基因植株中能够稳定遗传;利用RT-PCR分析其外源基因在转基因植株不同组织中的转录水平进行研究、并进一步利用Western-blot对转基因植株中外源蛋白的表达进行分析。【结果】在优化的草甘膦筛选条件下,以草甘膦浓度为2.5 mmol•L-1的抗性条件进行棉花愈伤诱导筛选并获得棉花再生植株;利用特异引物进行PCR检测结果表明,在检测的全部再生植株中,扩增得到1.8 kb预期大小目标条带的阳性株系32株,其中,收获的27个株系的外源目标基因能够在T0、T1转基因植株中稳定遗传;对G10aroA在转基因株系L12、L14的不同组织中的转录表达进行定量RT-PCR分析表明,外源G10aroA在转基因棉花植株的不同组织中表达具有差异,相对表达量高低依次为茎、苞叶、叶和花;另外,蛋白检测结果进一步表明,该外源基因能够在转基因株系L7、L12和L14中植株中正常表达为预期46 kD的EPSPS蛋白。【结论】通过农杆菌介导法转化外源抗草甘膦基因G10aroA,在草甘膦抗性条件下进行棉花体细胞诱导的组织培养,成功获得转外源G10aroA的棉花再生株系,并通过分子生物学方法研究证实外源G10aroA能够在T0、T1转基因株系中稳定遗传、转录以及表达。     

基于专利分析的转基因棉技术发展态势研究

通过专利分析研究我国转基因棉的发展态势,发现我国转移因棉发展较快,研发力量以科研院所和高等院校为主,北京、河南研发实力较强,转基因棉研发重点集中在依靠生物工程技术进行转基因育种方面。     

转抗草甘膦基因烟草T-DNA侧翼序列的扩增与分析

[目的]研究抗草甘磷基因在烟草中的插入位点、T—DNA结构等整合情况。[方法]利用现有的3个转抗草甘膦基因的烟草材料,通过PCR Walking的方法扩增出携带抗草甘膦基因的T-DNA侧翼序列,并用DNAMAN、BLAST等生物信息学方法进行分析。[结果]对获得的PCR条带进行分析,结果表明这些侧翼序列均含载体骨架序列且结构各不相同。T-DNA和载体骨架序列都存在重组现象。[结论]研究在转基因植株中检测到了载体的骨架结构,说明转基因的同时有可能会造成非目的基因的转移,即转基因植物存在一定的风险,应对转基因植物转化载体和基因工程技术路线进一步改良。     

中国转基因抗虫棉的研究利用现状及发展对策

从20世纪90年代起,中国开始了转基因抗虫棉的研究、开发和利用,并取得了较大的成就。在此,综述了中国转基因抗虫棉研究取得的主要进展,分析了当前中国转基因棉花发展的现状和存在的问题,对近期的发展进了初步的展望,并提出了转基因抗虫棉今后发展应采取的对策。     

我国棉花转基因目标性状研究进展及其利用

综述了我国转基因棉花的目标性状研究进展,并根据转基因性状的遗传规律,提出了转基因棉花的利用方法。     

喷水杀雄和标记去杂在棉花杂种优势利用中的应用

为寻求简便可靠的棉花去雄新方法,研究了喷水杀雄结合标记去杂用于棉花杂种优势利用的可行性。以转基因抗虫棉或抗草甘膦棉花为父本,与非抗虫棉或非抗草甘膦棉花配置组合,在盆栽和大田条件下对母本棉花喷水杀雄,以人工剥花去雄为对照,分别人工授粉杂交,杂交种子收获后鉴定纯度,并在来年田间种植,苗期通过转基因标记去杂,收获后统计皮棉产量。结果表明,盆栽和大田条件下喷水杀雄的杂种纯度分别为94.8%和92.2%,较人工去雄分别低4.4和6.6个百分点,喷水没有达到完全彻底的杀雄效果,但大田条件下喷水杀雄比人工剥花去雄快了约1倍。人工剥花去雄的最佳时间为开花头天下午,而喷水杀雄以开花当日8~10时的效果最好。喷水杀雄生产的种子种植田间,利用转基因标记于苗期去杂,F1的最终皮棉产量与人工去雄处理的无显著差异。喷水杀雄结合标记去杂可应用于棉花杂种优势的利用。     

国产转基因抗虫棉研究回顾与展望

棉花是我国最重要的经济作物之一,抗虫棉的研制成功与大规模产业化在保障我国植棉业的稳步发展、促进棉纺工业的快速增长、保护环境、增加农民收入和促进农业可持续发展方面作出了重要贡献.作者回顾了国产转基因抗虫棉从单价、双价到融合研究的重要历程,介绍了国产抗虫棉产业化的突出成绩,并对抗虫棉的深化研究、育种技术等作出展望.     

棉花规模化转基因技术体系构建及其应用

文中综述了国内外转基因技术在棉花中的应用概况,主要介绍了近年来中国棉花规模化转基因技术体系的建立及应用研究进展,并对棉花转基因技术中存在的主要问题和未来发展趋势做了相关陈述。对棉花科研工作者了解棉花转基因研究进展并有效利用转基因技术开展工作具有重要意义。转基因技术在克服棉铃虫危害上取得了巨大成功,并将逐步在棉花抗病、抗逆等方面取得重要进展。世界上,棉花转基因初期主要建立了以珂字棉为受体的转基因体系,随着雷蒙德氏棉、亚洲棉、海岛棉、陆地棉等其他棉种组织培养体系的建立,农杆菌介导法、基因枪轰击法、花粉管通道法及其他转基因方法的应用,使得棉花转基因技术研究取得长足的进步。中国棉花规模化转基因技术体系主要是依托中国农业科学院棉花研究所及其他科研单位建立起来的,通过高效转化载体的筛选、主要棉花品种（系）的转基因技术体系的建立、组织培养条件的优化等措施,重点对农杆菌介导法转化棉花技术进行了改良,同时优化了基因枪轰击法及花粉管通道法转化技术,形成了三位一体的棉花规模化转基因技术体系。该体系建立了以中棉所24等材料为转基因受体的农杆菌介导体系,并利用叶柄组织培养筛选获得了组织培养分化率达100%的新材料W12等,使转化率提高到原有效率的2.88倍,同时建立了基因枪胚性愈伤组织轰击转化体系,并提高了花粉管通道的转化效率。该体系为棉花育种提供了大量材料,中国农业科学院棉花研究所已培育多个棉花抗虫新品种,并为国内41家科研单位转化基因200多个,验证了多个功能基因作用获得大量育种价值新材料。笔者认为基因型依赖性仍然是限制棉花规模化转基因技术发展的瓶颈,扩大棉花转基因受体材料基因型范围、提高转化效率、扩大转化规模是棉花转基因技术体系的长久主题。同时,为提高效率和降低安全性的公众焦虑,探索和发现新的更为安全和有效的转化体系,如多基因共转化、质体遗传转化、定点转化或基因叠加、开发安全型转化技术等研究引起人们的普遍关注,是未来棉花转基因技术的发展趋势。大量新基因处于材料阶段,同时安全性评价要求提高也需要转基因材料深入的研究。随着棉花基因组序列的公布,棉花自身基因的克隆将会成为棉花基础研究和应用研究的新方向,对于促进转基因棉花新品种培育和功能基因转化研究具有重要参考价值。