分泌抗马铃薯X病毒株系特异性单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立

继建立分泌抗马铃薯Y病毒株系特异性单克隆抗体(MCA)杂交瘤细胞株之后,最近我们又建立了分泌抗马铃薯X病毒(PVX)株系特异性的杂交瘤细胞株。 以PVX的普通株系(PV54)和轻斑驳株系(PV197)为抗原免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞同骨髓瘤细胞(SP2/OAg-14)在聚乙二醇作     

马铃薯X病毒云南分离物单克隆抗体的制备及其检测应用

用马铃薯X病毒(Potato virus X,PVX)免疫的BALB/C鼠脾细胞与SP2/0鼠骨髓瘤细胞融合,经筛选克隆,获得2株能稳定传代并分泌抗PVX单克隆抗体(MAb)的杂交瘤细胞2B12和4E7,并分别制备它们的单抗腹水.2株单克隆抗体腹水间接ELISA效价在10-6以上,2B12和4E7的抗体类型及亚类均为IgG1,轻链均为κ链.利用这些单克隆抗体建立了抗原包被的间接ELISA(ACP-ELISA)检测PVX的方法.病叶经1:600倍稀释、提纯PVX病毒浓度为2 ng/mL(每孔的病毒绝对量为0.2 ng)时,该方法仍能检测到病毒.利用ACP-ELISA方法测定了田间样品,发现PVX在马铃薯上发病很普遍.     

长叶车前花叶病毒(RMV)单克隆抗体的研制及初步应用

植物病毒病近年来越来越严重地影响农业生产,因而对病毒病的诊断、鉴定、防治等工作显得格外重要。然而病毒种类繁多,株系复杂,分类较乱,给植物病毒检疫,田间诊断,室内鉴定,株系划分等带来许多困难。迫切需要一些精确稳定鉴定病毒,分析株系的方法。免疫学技术是病毒鉴定的重要手段之一。普通抗体由于含有多种抗原决定簇的抗体,特异性差,难以区分株系。单克隆抗体只针对一个抗原决定簇,特异性极高,能精确鉴别病毒株系间的细微差异和株系间的亲缘关系。分析病毒的共同抗原决定簇和独特型决定簇,研究病毒表面结构及免疫学等方面的特征,单克隆抗体能使抗体制剂统一化、试剂化,为病毒的多项研究提供材料。研制长叶车前花叶病毒(RMV)单克隆抗体,无论对该病毒的鉴定、诊断、防治等生产实际问题,还是对植物病毒的基础理论研究,均具有现实意义。到目前为止,国内外尚未见有关RMV单克隆抗体的报道,本研究是首次报道。     

PVY/PVX协生作用对病毒浓度及寄主细胞超微结构的影响

 以烟草品种三生烟 (N .tabacumcv .Samsun)为测试寄主 ,采用酶联免疫检测实验 (TAS ELISA)和电镜观察的方法 ,在温室条件下研究了马铃薯Y病毒 (PVY)和马铃薯X病毒 (PVX)复合侵染所引起的寄主症状和病毒浓度变化的特点、不同条件下复合侵染时病毒浓度的变化规律以及复合侵染对寄主细胞超微结构的影响。结果表明 ,PVY/PVX在烟草植株内发生了协生作用 ,PVY是协生病毒 ,PVX是被协生病毒。与单独侵染相比 ,PVY和PVX的复合侵染使烟草植株症状明显加重。PVY在复合侵染植株中的浓度与在单独侵染植株中相比 ,没有明显的变化 ,而PVX在复合侵染植株中的浓度明显高于在单独侵染植株中的浓度。这种现象不受PVY株系、处理季节和接种次序的影响。但是 ,不同PVY株系、不同处理季节或不同接种次序对PVY/PVX协生作用中PVX浓度的影响程度存在着一定的差异。电镜观察表明 ,与不接种病毒或单独侵染的植株相比 ,受复合侵染的烟草叶片细胞超微结构发生了明显的病理学变化。细胞肿胀 ,叶绿体、线粒体等细胞器受到严重损伤 ,细胞质内有风轮状、薄片状的内含体 ,由于在细胞质中常常有大量纤维状的PVX病毒粒子聚集体存在 ,这意味着PVX浓度的增加可能是在复合侵染的细胞中病毒大量繁殖的结果。     

马铃薯Y病毒的株系种类、分子特征及鉴定方法研究进展

马铃薯Y病毒(PVY)株系分化现象明显,具有多个株系类型。随着分子生物学技术和免疫学技术逐渐被引入PVY的株系鉴定中,产生了一系列的株系鉴定方法。为此,对PVY的主要株系、亚株系的种类及分类依据、分子特征以及近年来应用于PVY株系鉴定的传统生物学方法、分子生物学方法、免疫学方法等进行了综述。     

马铃薯X病毒外壳蛋白基因的克隆与系统进化分析

从贵州威宁等地采集马铃薯病叶样本,采用试管捕捉反转录PCR（tube-capture-RT-PCR,TC-RT-PCR）的方法克隆出714 bp的PVX CP基因,编码237个氨基酸残基.系统进化分析表明,PVX CP基因可分为两大类群,推测分离物属于X3株系,并建议重型花叶也可作为PVX病叶样本.     

抗鸭副粘病毒单克隆抗体的制备及其特性鉴定

【目的】制备抗鸭副粘病毒(DPMV)的单克隆抗体,为鸭副粘病毒病免疫学诊断方法的建立奠定基础。【方法】采用差速和蔗糖不连续密度梯度离心法提纯DPMV,免疫BALB/c小鼠,取脾细胞与骨髓瘤细胞株SP2/0融合,采用间接ELISA、间接免疫荧光试验(IFA)和血凝抑制(HI)试验等方法筛选阳性杂交瘤细胞株,并测定其生物学特性。【结果】筛选到7株能稳定分泌抗DPMV单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为J28、F4、B3、E39、E41、A12和A30。这7株单克隆抗体都具有ELISA和1FA特性,其中J28和F4还具有HI和中和特性。免疫球蛋白亚类测定结果显示,J28和F4均为IgG1,其他5株均为IgM。相加ELISA试验结果显示,单抗B3,J28与F4,A30与E39/E41/A12分别识别3个不同的抗原位点。特异性测定结果显示,7株单克隆抗体与雏番鸭细小病毒(MPV)、鹅细小病毒(GPV)、鸭肝炎病毒(DHV)、番鸭呼肠孤病毒(MDRV)及正常细胞均无交叉反应。【结论】筛选出了7株具有ELISA、1FA等特性且分泌抗DPMV单克隆抗体的杂交瘤细胞株,并明确了各株单克隆抗体的特性,为鸭副粘病毒病的免疫治疗和临床诊断奠定了基础。     

马铃薯X病毒贵州分离物的分子鉴定

从贵州威宁县染病马铃薯植株中分离得到马铃薯X病毒贵州分离物(PVX-GZ),采用RT-PCR扩增并克隆了该分离物的外壳蛋白基因(CP).经测序,该CP基因长714 bp,编码237个氨基酸残基,分子量25.2 ku;与19种已报道的PVX各地分离物的同源性相比,其核苷酸和氨基酸序列分别在78.6％～97.5％和84.8％～99.6％之间,其中,与两种典型的PVX X3株系(荷兰分离物X3和英国分离物UK3)的基因序列同源性达97.1％以上.结合寄主鉴别结果,判断该分离物属PVX的X3株系.     

猪瘟野毒与疫苗弱毒鉴别方法的研究进展

概述了当前鉴别猪瘟强弱毒的几种方法,即免疫学方法(胶体金免疫层析技术、单克隆抗体法和单抗-酶联免疫吸附试验)、核酸检测方法(RT-PCR技术、RT-PCR与其他方法的结合)和动物试验方法.同时提出了鉴别猪瘟强弱毒方法的发展方向.     

一种新的沙丁胺醇人工抗原的合成及单克隆抗体的制备

【目的】为证明采用4-溴丁酸乙酯半抗原合成人工抗原可制备灵敏度高、特异性好的单克隆抗体.【方法】将硫酸沙丁胺醇(SAL)与4-溴丁酸乙酯反应制备半抗原(SAL-HS);通过N-羟基琥珀酰亚胺活化酯法合成免疫原与包被原,用聚丙烯酰胺凝胶电泳、紫外光谱和质谱方法对沙丁胺醇免疫原及包被原进行鉴定.免疫原免疫Balb/c小鼠,采用融合技术产生杂交瘤细胞株,体内诱生腹水法制备单克隆抗体,并鉴定其免疫学特性.【结果和结论】筛选出1株杂交瘤细胞株,其细胞培养上清液效价达1∶128 000,腹水效价达1∶2 560 000,免疫球蛋白亚型鉴定为IGg1;抗体对沙丁胺醇的半数抑制浓度(IC50)为:0.746 ng/mL;与其他同类结构药物的交叉反应率均小于0.015%.     

马铃薯X病毒的分子鉴定与检测技术

为建立快速、灵敏、特异的马铃薯X病毒(PVX)分子鉴定与检测技术,利用反转录—聚合酶链式反应(RT—PCR)技术扩增得到了PVXcp基因,并进行序列测定,同时采用RT—PCR方法和核酸斑点杂交(NASH)方法对PVX进行了分子检测。结果表明:利用PVXcp基因序列及蛋白氨基酸序列分析可准确鉴定PVX,并可分析各分离物间的分子差异。利用PVX特异性引物和DIG标记的PVXcp基因采用RT-PCR技术和NASH技术可对PVX进行准确的检测,其特异性及灵敏度均优于传统方法。     

转BpGLK1基因白桦叶色变异规律及生长特性分析

通过开展转BpGLK1基因白桦叶色变异规律研究,探讨BpGLK1干扰表达株系叶绿素含量的降低对生长的影响.以2年生3个BpGLK1过表达株系(OE1～3)、7个干扰表达株系(RE1～7)为试材,采用PCR及qRT-PCR技术对目标基因进行分子检测,同时测定其叶色参数和叶绿素相对含量的时序变化规律,分析转基因白桦的生长特性.结果 表明:2年生的转BpGLK1基因白桦中,导入的目标基因仍整合于转基因株系的基因组中,且BpGLK1干扰表达株系中BpGLK1显著下调,BpGLK1基因的低表达对2年生苗高生长无影响,7个干扰表达株系中有6个株系在整个生长期叶绿素含量低于WT株系,叶色亮度及黄色程度高于WT株系,其中RE1、RE7株系上述性状均优于其他株系,是后续城市园林绿化应用推广的首选株系.     

单克隆抗体在兽医和畜牧中的研究现状与展望

自Kohler,C.和MilsteinC(1975)发表了“能分泌预定特异性的融合细胞连续培养物”以来,分泌单一抗体的杂交瘤技术(即单克隆抗体技术)在细胞生物学、免疫学、微生物学和寄生虫学等方面蓬勃兴起,发展异常迅速。现将近些年来在兽医和畜牧方面单克隆抗体(以下简称单抗)的研究现状和展望评述于后。     

碧螺春茶树单株的选择研究

[目的]以洞庭碧螺春专用茶树品种选育为目标,开展碧螺春优质茶树[Camellia sinensis(L.)O.Ktze.]单株选择研究。[方法]根据茶叶品质、产量、芽叶发育期、抗性等性状指标,筛选洞庭群体种优良单株。[结果]d-x-1、d-x-8、d-x-24单株的感官审评总得分和单个香气得分均较对照和其他株系高,春茶开采期比其他株系稍早(d-x-24稍晚2 d),春茶发芽密度高于对照和其他株系,鲜叶产量、百芽重、抗逆性等与对照和其他株系相差不多。总体上,这3个株系综合性状比对照和其他株系优异。[结论]筛选出d-x-1、d-x-8和d-x-24共3个优质碧螺春茶树新株系,为碧螺春品种选育奠定了基础。     

新疆树上干杏遗传关系的鉴定

通过对6个树上干杏材料的树型、枝、叶、花和果实等生物学特性进行调查,并采用RAPD标记与其他62个杏品种进行遗传多样性分析,对新疆树上干杏的亲缘关系进行了鉴定。结果显示:(1)6个树上干杏材料在树型、枝、叶、花和果实等生物学特性上存在较小差异,难以作为准确鉴别树上干杏不同株系的指标。(2)聚类分析的结果显示,6个树上干杏材料的遗传相似系数在0.831与0.938之间,可被分为3个不同株系:S1、S2、S3和S6为株系Ⅰ,S4为株系Ⅱ、S5为株系Ⅲ。(3)与其他62份杏材料的聚类分析结果显示,树上干杏株系与新疆的李光杏的亲缘关系最近,其遗传相似系数达到0.802。本研究利用生物学特性观察结合RAPD标记的方法,对新疆地区树上干杏的亲缘关系进行鉴定,为树上干杏种质的挖掘和品种遗传改良奠定基础。     

抗2,4 D单克隆抗体制备及免疫学特性鉴定

制备抗2,4-D高敏感性和高特异性的单克隆抗体,并对其免疫学特性进行鉴定。采用EDC法将BSA、OVA和2,4-D偶联制成免疫原和包被原,并经聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)鉴定后,用免疫原免疫Balb/c小鼠,经过4次免疫,用间接ELISA和阻断ELISA选择高效价、高敏感性的小鼠进行细胞融合;应用杂交瘤细胞技术建立分泌抗2,4-D单克隆抗体的杂交瘤细胞株;用体内诱生法制备腹水,并对其效价、敏感性、亚型和特异性等免疫学特性进行鉴定。结果表明,融合后筛选出3株特异性高的杂交瘤细胞1F11、2A12、2G12,单抗亚型均为IgG1型,效价为1∶2 560～1∶5 120,对2,4-D的IC50分别为0.801、1.332、1.564μg/L,亲和常数(Ka)分别为2.174×1011、3.21×1010和4.36×1010 L/mg,与其他竞争物的交叉反应率均小于0.03%。说明成功获得高敏感性、高亲和力和高特异性的2,4-D mAb,为2,4-二氯苯氧乙酸残留免疫学快速检测方法的建立奠定基础。     

同时快速检测马铃薯X病毒、Y病毒和S病毒试纸条的研制

为实现在马铃薯种薯生产田现场同时快速检测马铃薯X病毒(PVX)、Y病毒(PVY)和S病毒(PVS),采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金溶液,利用抗体与胶体金相结合的特性制备金原子与PVX、PVY和PVS抗体结合物(简称金标抗体),通过三维划膜喷金仪将金标抗体喷射于玻璃纤维上作为金标垫,将PVX抗体、PVY抗体和PVS抗体分...     

转CBF2基因番茄抗NaCl胁迫研究

为明确CBF2基因过量表达对提高植物抗盐胁迫的作用,对NaCl胁迫下的转基因番茄株系进行了分子检测和生理特性分析.结果表明CBF2基因过量表达能够提高转基因番茄植株的耐NaCl能力,表现为在含有150 mmol/L和300 mmol/L NaCl的MS培养基上,转基因植株的株高和鲜重均明显优于非转基因株系,在生理生化特性上表现为转基因番茄的可溶性蛋白含量和过氧化物酶(POD)活性比非转基因株系明显增加,而丙二醛(MDA)含量明显低于非转基因株系.     

山豆根四倍体优良株系的综合评价

【目的】分析山豆根四倍体株系与二倍体株系间的生长发育及其有效成分差异,为山豆根优良种质的选育提供理论依据。【方法】以10个四倍体株系和1个二倍体株系的3年生山豆根为材料,分别从农艺性状(株高、茎粗、叶面积和根干重等)、生理生化[可溶性糖、可溶性蛋白、丙二醛(MDA)含量及超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化物酶(POD)活性]、内源激素[脱落酸(ABA)、油菜素(BR)、赤霉素(GA)、茉莉酸甲酯(JA-ME)和玉米素(Z)]、苦参碱和氧化苦参碱含量等多角度检测及评价其生长与品质状态,并进行因子分析,综合评价出高产优质的山豆根株系。【结果】在山豆根四倍体株系中,A-66株系长势最好,其株高(208.60 cm)和根干重(138.59 g)均显著大于其他株系(P0.05,下同);苦参碱含量最高的是A-96株系(0.6639 mg/gDW),氧化苦参碱及其与苦参碱总含量最高的是D-37株系(30.6366和31.1986 mg/gDW)。山豆根四倍体药用有效成分中的苦参碱含量与其株高和茎粗呈正相关,而氧化苦参碱含量与其株高和茎粗呈负相关。根据因子分析结果可知,综合评分最高的为A-66株系(99.13分),其次是C-16(89.99分)、B-309(84.65分)和A-96株系(80.90分),其余株系的综合评分均未达80.00分,二倍体株系的综合评分最低(53.71分)。【结论】山豆根四倍体株系A-66、C-16、B-309和A-96的综合得分均高于80.00分,即其品质较优,可作为优良品种选育对象进行深入研究。     

寒地多年生麦草新种质的形态学分析与细胞学检测

为丰富北方寒地牧草品种,选育适合北方寒冷地区种植的优势牧草,以八倍体小偃麦(Trititrigia)与中间偃麦草(Thinopyrum intermedium)杂交后代选育的10份寒地多年生麦草新种质为材料,借助我国东北哈尔滨地区的气候特点,对其进行形态学分析和细胞学鉴定。结果表明:10份材料田间自然生长年限超过3a,均具有抗寒性和多年生特性,可在哈尔滨地区-30℃环境下安全过冬;根系发达,除2个株系8LF2 1-1-4和11LF3 1-1-4外,其他株系具有地下茎。植株生长繁茂,有5个株系总分孽数超过40,2个株系穗长超过24cm。株系11LF3 1-1-4和11LF4 1-18-1结实率平均值在80%以上,远高于亲本中间偃麦草;10份材料种子发芽率在60%~90%;株系5Q10L1-18-1茎秆干重可达1.7kg·m~(-2)。10个株系根尖体细胞染色体为42条,遗传稳定,植株均表现抗旱、抗寒,抗病等特性。本研究可为北方寒地的牧草选育提供理论和材料基础。