禾本科植物内生真菌及其在农业上的应用潜力

通常禾本科植物内生真菌专指epichlo内生真菌,包括Epichlo属真菌和Neotyphodium属真菌。Epichlo属真菌偶尔会在植物茎秆上形成子座,而Neotyphodium属真菌在宿主植物体上一般不表现任何症状。这些真菌在培养基上对植物病原具有明显的拮抗作用,能增强植物的抗虫、抗旱、抗病、抗寒能力,促进肥料吸收,促进植物生长和分蘖、增产等,有时也会使宿主植物生产过量的生物碱,造成家畜中毒。因此,如何筛选和利用具有优秀农艺性状且没有合成生物碱能力的禾本科植物/内生真菌共生体是epichlo内生真菌资源利用的关键。本文还结合我国近年来多种小麦族植物内生真菌的新发现,讨论了将禾本科植物内生真菌在我国麦类作物中的应用潜力。     

一种适合于PCR扩增的真菌基因组DNA提取方法

以药用真菌灰树花和蛹虫草以及4种植物内生担子菌为材料,优化一种适用于PCR扩增的高质量基因组DNA提取方法.结果表明,采用改良SDS法提取药用真菌和植物内生担子菌基因组DNA的数量和质量都较为理想,A260/A280为1.8～1.9,DNA产量在110-170μg·g-1湿菌体.将提取的DNA作为模板PCR扩增rDNA ITS片段,扩增条带清晰,结果稳定、准确.该方法简便易行,成本低廉,适合富含蛋白质和多糖的真菌基因组DNA的提取.     

禾本科植物内生真菌研究19:圆柱披碱草内生真菌的系统发育学研究

[目的]本文旨在确定圆柱披碱草(Elymus cylindricus)内生真菌的分类地位。[方法]选择5株分离自新疆、青海的圆柱披碱草内生真菌菌株,采用SDS法提取基因组DNA,利用选择性引物对其tub B和tef A基因片段进行扩增和克隆测序,下载NCBI中的相似序列并进行比对分析,用MEGA 6.0软件构建系统发育树。[结果]成功获得差异极小的各菌株序列,且tub B序列确认为仅1个拷贝,而2个菌株的tef A序列则有2个拷贝。在最大简约树上披碱草菌株的tef A和tub B第1拷贝均在EBY(Epichloe bromicola/E.yangzii)大支上,与E.sinica比较接近;tef A的第2拷贝与ETC(E.typhina complex)中的成员聚类。[结论]Epichloesp.-Elymus cylindricus是一个新的共生体组合。圆柱披碱草分离菌株为杂交起源的Epichloe属真菌,可能起源于E.bromicola(syn.E.yangzii)和E.sylvatica间的杂交。     

禾本科植物内生真菌研究11:黄山景区禾本科植物内生真菌的检测与分布

2006至2008年的夏季,从黄山景区海拔500-1600m处,采集至少23个属的631株禾本科植物,通过镜检,其中的内生真菌检出率为39%.内生真菌的分布与宿主植物的种类、宿t植物的地理分布类型等有关,拂子茅植物的检出率高达67%.在所调查的6个地理分布类型中,内生真菌大量分布在北温带分布的植物类型中.从短柄草中发现了香柱菌(Epichloe sp.),其子座等形态学特征与欧洲菌株存在很大差异,这是我国新报道的第2例有性型内生真菌.     

番荔枝科植物鹰爪内生真菌rDNA ITS-PCR扩增条件的优化

探索一种简单、快速的获得番荔枝科植物鹰爪内生真菌rDNA ITS目的片断的方法。采用改良的Rodrigues组织培养表面消毒技术和CTAB法提取植物样品总DNA,利用真核生物通用引物LH2/Sm73扩增rDNA ITS目的片段,正交法优选ITS-PCR扩增条件。PCR反应可同时获得两条600 bp和700 bp产物,分别为植物和内生真菌的rDNA ITS目的片断。改良的组织表面消毒技术可排除外源DNA污染。正交法可快速获得植物内生真菌目的片断。该法简单、快速,为番荔枝科植物内生真菌生物多样性研究提供分子生物学基础。     

禾本科植物内生真菌研究14:Neotyphodium sinofestucae在小颖羊茅体内的分布及其种传特性

2010年在南京紫金山地区采集小颖羊茅(Festuca parvigluma Steud.)的完整植株和成熟种子,通过染色、分离、特异性基因片段检测等方法探究内生真菌Neotyphodium sinofestucae Chen,Ji et Wang在其体内的分布和种传特性。从植株茎秆、叶鞘、叶片和种子稃片及颖果等部位分别检测和分离到具有禾本科植物内生真菌特征的真菌。同时,从含有内生真菌的种子培育实生苗,并从实生苗中检测和分离到类似的内生真菌。通过对tubB基因片段的PCR扩增和检测,证明分离自小颖羊茅的样品与其实生苗的分离菌株是相同的N.sinofestucae。上述结果表明:N.sinofestucae遍布小颖羊茅植株地上部分,却不进入根部;内生真菌N.sinofestucae能进入种子,通过种子进行垂直传播,与宿主植物长期互利共生。     

三尖杉内生真菌的遗传多样性研究

本研究以三尖杉的根、茎、叶中分离的91株内生真菌为材料,根据其菌落颜色、质地、生长速率和分生孢子外观等形态学特征,确定了其中74株产孢内生真菌为5个属.采用特异性PCR对91株菌株的ITS片段进行扩增,获得单一的分子长为600bp的条带,以4种限制性内切酶对扩增的ITS片段进行RFLP分析,并对部分ITS碱基序列进行测定,表明三尖杉内生真菌的属和种丰富,其中的优势属为刺盘孢属、曲霉属及小丛壳属,表现为热带真菌类型;小丛壳属是首次从三尖杉科植物中分离.本研究结果提示三尖杉内生真菌有丰富的遗传多样性.     

不含花序的禾本科植物样品的鉴定

2011年9月,从内蒙古科尔沁地区采集长有真菌子座、却不长花序的禾本科植物26株。提取植物基因组DNA,合成引物扩增植物叶绿体DNA中的trnT-trnL基因间间隔序列。结果表明:内蒙古带子座植物样品与羊草的目的片段长度均为740 bp,仅4个碱基的差异;而新麦草属的Psathyrostachys fragilis目的片段长度为1 750 bp,与带子座样品及羊草的碱基差异较大。系统发育树分析表明带子座植物样品与羊草聚为一支,自展值95%。利用组织透明法观察植物的叶表皮微形态,内蒙古带子座植物样品同样与羊草叶表皮微形态一致。结合植物学形态特征、trnT-trnL基因片段分析及叶表皮微形态,内蒙古带子座禾本科植物被鉴定为羊草(Leymus chinensis Trin.)。野外条件下,具有宿主特异性的内生真菌能在羊草植株上形成子座,国际上还未见相关报道,也显示羊草植株的特异性。     

白芨内生真菌的多样性

为研究白芨内生菌的多样性,从新鲜白芨根中提取内生真菌的DNA,构建ITS r DNA文库,进行高通量测序和多项信息分析。结果显示,白芨内生真菌主要属于担子菌门(83.4%)和子囊菌门(14.3%),另外2.3%无法鉴定;担子菌门、子囊菌门、接合菌门的菌根优势度指数分别为0.834 1、0.142 6、0.000 3,无法鉴定的真菌菌根优势度指数为0.022 9。纲、目的分类水平上,伞菌纲蜡壳菌目占83.4%,盘菌纲盘菌目占11.4%,锤舌菌纲柔膜菌目占2.1%,无法鉴定的占2.3%。科分类水平上,内生真菌主要属于Serendipitacea(83.4%)和盘菌科(11.4%)。属的分类水平上,梨形孢属(Piriformospora)占83.4%。Shannon index、Chao1、Observed species和Simpson 4种曲线分析结果显示,白芨菌根内生真菌的多样性呈均匀分布。     

皱边石杉内生真菌ISSR-PCR反应条件的优化

以从皱边石杉中分离纯化出的99株内生真菌DNA为材料,优选出10条ISSR引物(UBC842、UBC848、UBC850、UBC856、UBC861、UBC864、UBC868、UBC873、UBC880、UBC887)的最适退火温度,并对其进行ISSR–PCR反应体系单因素试验及正交试验优化,建立皱边石杉内生真菌ISSR–PCR的优化反应体系,即25μL反应体系中,10×PCR Buffer(Mg2+浓度为2.0 mmol/L)2.5μL,dNTPs(10 mmol/L)0.6μL,引物(10 pmol/μL)2.0μL,Taq E(1 U/μL)1.5μL,DNA模板(10 ng/μL)3μL,无菌ddH2O 15.4μL。以UBC873引物对99株内生真菌基因组DNA进行PCR扩增,初步获知皱边石杉内生真菌资源的遗传多样性非常丰富。     

一种简易有效的提取真菌DNA化学改良方法

[目的]探索适合真菌基因组DNA提取的有效方法。[方法]以酵母茵（Hansenula sp.HS07A）和青霉菌（Penicillium sp.HS07）为供试菌株,分别采用煮沸裂解法、石英砂研磨法、研磨和反复研磨冻融法和化学改良法提取其基因组DNA,比较这4种方法的提取效果。[结果]化学改良法提取基因组DNA,除去了机械破壁过程,减少了机械力对DNA造成的破坏,运用阴离子去污剂SIB提取DNA安全、价廉,能有效、完整地提取高质量的基因组DNA,凝胶电泳条带清晰、无弥散,以此基因组DNA作为目的片段的PCR扩增模板,扩增效果优于改良前的方法,并且这种方法也适合多种真菌和细菌基因组DNA的提取。[结论]化学改良法是提取真菌基因组DNA的有效方法。     

几种内生真菌DNA提取方法的比较

通过3种内生真菌DNA提取方法的比较,即CTAB法、SDS法、改良的CTAB法,结果表明三种方法都能得到目的DNA,而且得率都较好,但改良的CTAB法效果最好,不仅DNA纯度高且质量也好.用改良的CTAB法所提取的DNA作为模板,进行PCR扩增,得到了清晰的、单一的扩增普带,完全可用于酶切、测序等后续实验.     

一种适用于PCR的环境友好型植物DNA提取方法(英文)

改进DNA提取方法,利用含2%CTAB、1%SDS、2%PVP、100mmol/LTris-Cl(pH8.0)、20mmol/LEDTA(pH8.0)和1.4mol/LNaCl的DNA提取缓冲液,提取了不同种属12种植物的DNA,并对其进行了PCR检测.结果显示,所提取的DNA符合PCR试验要求,用真核生物ITS4/ITS5通用引物均能扩增出清晰的条带.该方法无需酚仿抽提,简单、高效、环保,特别适合大规模植物DNA的提取.     

新疆泥火山土壤宏基因组DNA的提取方法研究

[目的]寻找一种有效的泥火山土壤宏基因组DNA的提取方法。[方法]分别采用CTAB法、SDS加酶法、实验室改进法、试剂盒法提取泥火山土壤宏基因组,比较4种方法的提取效果。[结果]试剂盒法的提取效率最高、纯度最好;实验室改进法次之;SDS加酶法提取量最多。实验室改进法获得的DNA稀释10倍可直接用于PCR扩增。[结论]从经济和DNA质量的角度考虑,实验室改进法可作为新疆泥火山土壤宏基因组DNA提取最有效的方法。     

新疆泥火山土壤宏基因组DNA的提取方法研究（摘要）

[目的]寻找一种有效的泥火山土壤宏基因组DNA的提取方法。[方法]分别采用CTAB法、SDS加酶法、实验室改进法、试剂盒法提取泥火山土壤宏基因组,比较4种方法的提取效果。[结果]试剂盒法的提取效率最高、纯度最好;实验室改进法次之;SDS加酶法提取量最多。实验室改进法获得的DNA,稀释10倍可直接用于PCR扩增。[结论]从经济和DNA质量的角度考虑,实验室改进法可作为新疆泥火山土壤宏基因组DNA提取最有效的方法。     

适用于竹林土壤PCR-DGGE分析用的微生物总DNA提取及纯化方法

为了获得完整、高纯度的竹林土壤微生物总DNA,采用改良的十二烷基硫酸钠-高盐抽提法对5种竹林土壤进行DNA提取,通过DNA凝胶回收试剂盒纯化粗提的DNA,利用细菌16 SrDNA基因的V3区引物对纯化的DNA进行了聚合酶链式反应一变性梯度凝胶电泳（PCR-DGGE）验证。结果表明,该方法所需土壤样品少,抽提的DNA片段均在23kb以上,完整性好;采用DNA凝胶回收试剂盒纯化能够有效去除粗提DNA中大部分杂质,获得高质量的DNA;以此DNA为模板进行DGGE检测所反映的微生物信息量丰富。图3表1参15     

生豆浆基因组DNA不同提取方法的比较研究

[目的]探讨适宜生豆浆的DNA提取方法。[方法]以市售豆浆为材料,分别采用热解法、异丙醇沉淀法、CTAB法、SDS法、高盐低pH和异硫氰酸胍法以及它们的改良方法提取基因组DNA,并比较了以上方法的提取效果。[结果]除异丙醇沉淀法外,其他方法提取的基因组DNA均可满足PCR检测要求。同时,综合考虑基因组DNA的纯度和浓度,生豆浆基因组DNA提取方法的优劣依次为：改进高盐低pH法、高盐低pH法、改进CTAB法、改进异丙醇沉淀法、异硫氰酸胍法和改进热解法。[结论]这几种豆粉基因组DNA提取方法均具有操作简单、耗时短、利于快速检测的优点。     

蚧虫DNA的提取及PCR法虫种快速鉴定技术

研究了在植物检疫中利用蚧虫残体提取DNA并应用PCR技术快速鉴定虫种的方法.结果表明,该方法对蚧虫残体DNA的提取效果很好,并筛选出了适合蚧虫DNA扩增的引物"AGAGGTGGGCAGGTG";利用该引物对枣大球蚧(Euleconium gigantea Shinji)、朝鲜毛球蚧(Didesmococcus koreanus Borchsenius)、日本龟蜡蚧(Ceroplastes japonicus Green)和白蜡绵粉蚧(Phenacoccus fraxinus Tang)4种蚧虫进行PCR扩增后均有很好的特异性,这为蚧虫的快速检疫鉴定提供了新途径.     

一种适于PCR扩增的蓖麻基因组DNA提取方法

报道了一种从蓖麻叶片中提取DNA的改良SDS方法,该方法提取的DNA经琼脂糖凝胶电泳检测,获得的DNA条带较亮且无明显拖尾现象。利用ISSR引物对提取的蓖麻基因组DNA进行PCR检测,能够获得清晰稳定的条带。说明该方法提取的蓖麻基因组DNA能够满足PCR反应的需要。     

直接、快速地从罹病小麦叶片中提取条锈菌基因组DNA的方法

 小麦条锈菌（Puccinia striiformis f. sp. tritici）是专性程度很高的活体寄生菌,通过分子技术对其进行群体遗传结构研究的过程中,基因组DNA提取是基础之一。本研究利用Chelex 100法和CTAB法直接提取罹条锈病的小麦病叶片上的小麦条锈病菌的基因组DNA,使用PCR对所得到的DNA进行真菌核糖体rDNA ITS和小麦条锈病菌特异性引物CYR33进行检测,对2种基因组DNA的提取方法进行比较分析,结果表明Chelex 100法和CTAB法都能够适合于从罹病组织中直接提取小麦条锈病菌的基因组DNA,但是Chelex 100法较CTAB法所需的样品量少,操作步骤少,操作简单,并且整个过程无需使用有机溶剂进行抽提,对人体比较安全。通过PCR检测DNA提取情况,发现Chelex 100法提取的DNA的PCR结果优于CTAB法,且能够满足基于PCR的群体遗传结构的分析等研究。