Smad9基因干扰表达对鹅卵泡颗粒细胞增殖及内分泌的影响

为阐明BMP/Smad信号通路下游的转录因子 Smad9对鹅卵泡发育的调控作用，研究采用RNAi技术干扰 Smad9基因在鹅卵泡颗粒细胞的表达。通过对SMAD9蛋白表达定位， Smad9基因干扰后颗粒细胞的增殖情况以及卵泡发育相关激素及其受体的表达分析，探讨 Smad9基因表达对鹅卵泡颗粒细胞增殖及其内分泌功能的影响。结果显示，SMAD9蛋白在鹅卵泡仅表达于颗粒细胞，Smad9-siRNA显著抑制 Smad9的表达。 Smad9干扰后颗粒细胞的增殖能力明显降低，细胞上清中雌二醇（E₂）的水平显著下降，孕酮（P_{4）水平未见明显变化，细胞色素P450芳香化酶基因（ CYP19A1）和促黄体素受体（LHR）基因的表达显著下降，促卵泡素受体（FSHR）基因的表达无显著变化。这些结果表明，干扰 Smad9基因表达对鹅卵泡颗粒细胞增殖和内分泌功能均产生显著影响，其机制可能是 Smad9基因表达抑制后引起颗粒细胞E2合成减少和LHR的表达下降有关。}     

马铃薯转录因子StNAC043基因的克隆及其生理功能分析

为探究马铃薯转录因子StNAC043基因的功能，克隆马铃薯转录因子StNAC043基因，利用农杆菌介导法将其转入马铃薯‘东农310’基因组，使其过量表达。转基因植株经无性系扩繁后，测定转基因株系的根和茎的生长指标、叶绿素相对含量(SPAD)以及荧光参数(F_v/F_m、ETR_max)，并以转录组测序结合qRT-PCR验证分析其下游调控基因。结果表明:StNAC043基因过量表达可以显著促进转基因马铃薯根系和茎的生长、显著提高转基因植株叶片SPAD、F_v/F_m、ETR_max；并且转录因子StNAC043可以调控捕光色素结合蛋白基因StCAB1和StCAB2的表达。综上，马铃薯转录因子StNAC043基因对马铃薯幼苗的生长和光合生理调控具有重要作用。     

小麦转录因子TaWRKY28基因克隆与抗旱性分析

【目的】克隆小麦TaWRKY28基因,通过农杆菌浸染法将其转化至拟南芥,研究转基因拟南芥植株生理生化指标变化,探究其在抵御非生物胁迫中的作用。【方法】采用RT-PCR方法,从小麦百农207 cDNA中克隆得到TaWRKY28基因,利用ProtParam等软件对其氨基酸序列进行生物信息学分析;利用实时荧光定量PCR方法,分析TaWRKY28基因的组织表达特异性及在NaCl、ABA、H₂O₂、干旱和低温逆境胁迫下的表达情况;构建基因超表达载体,通过花序浸染法转化拟南芥,选取TaWRKY28基因相对表达量较高的转基因T₃拟南芥株系,测定拟南芥超氧化物歧化酶（SOD）和过氧化物酶（POD）的活性以及丙二醛（MDA）、H₂O₂和脯氨酸含量,研究TaWRKY28对拟南芥抗旱性的影响。【结果】成功克隆获得小麦TaWRKY28基因,该基因ORF全长为978 bp,编码325个氨基酸,相对分子质量为34.87 ku,理论等电点为9.27,含有1个WRKY保守结构域和1个C₂H₂锌指结构域,属于WRKY基因家族的第Ⅱ类成员。序列系统进化分析结果显示,小麦TaWRKY28与大麦HvWRKY2亲缘关系最近。亚细胞定位显示该基因位于细胞核中。qRT-PCR结果表明,TaWRKY28在小麦根、茎、叶、雌蕊和雄蕊组织中均有表达,但具有组织特异表达性,在叶中表达量最高,雄蕊中次之,雌蕊中表达量最低,且受NaCl、ABA、H₂O₂、干旱和低温胁迫后TaWRKY28表达会增强。对TaWRKY28转基因拟南芥植株的抗旱性分析表明,在干旱条件下,转基因植株的表型优于野生型,SOD、POD活性和脯氨酸含量显著增加,而H₂O₂和MDA含量显著降低,转基因植株抗旱性显著提高。【结论】克隆了小麦TaWRKY28基因,该基因可以增强转基因拟南芥植株的抗旱能力。     

TRIM8基因在小鼠组织和早期胚胎中的表达及其功能初探

【目的】研究TRIM8基因在小鼠组织和早期胚胎中的表达情况及其沉默后对早期胚胎体外发育的影响。【方法】采用RT-PCR、免疫印迹分别检测TRIM8基因及其编码的蛋白在小鼠不同组织（心、肝、脾、肺、肾、胃、肠、肌肉、子宫、卵巢和睾丸）中的表达情况,采用免疫组化技术对TRIM8在卵巢中进行定位。利用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)、免疫印迹法检测TRIM8基因及其编码的蛋白在小鼠早期胚胎（1-细胞胚胎、2-细胞胚胎、4-细胞胚胎、8-细胞胚胎、桑葚胚和囊胚）中的表达规律,用免疫荧光结合激光共聚焦显微镜技术对TRIM8在早期胚胎中进行定位。利用RNA干扰技术沉默TRIM8基因,研究该基因沉默对小鼠早期胚胎体外发育的影响。【结果】TRIM8基因及其编码的蛋白在小鼠不同组织中均表达,但在子宫、卵巢和睾丸中表达水平相对较高。在卵巢中,TRIM8蛋白主要定位在不同发育阶段的卵母细胞中。TRIM8基因及其编码的蛋白在早期胚胎中均有表达,但其mRNA表达水平在1-细胞到4-细胞期胚胎中的表达水平显著高于8-细胞到囊胚期胚胎。TRIM8蛋白主要定位在不同时期胚胎的胞质中。TRIM8基因沉默组的囊胚率显著低于对照组(P<0.05)。【结论】TRIM8基因及其编码的蛋白在小鼠各组织及早期胚胎中均有表达,主要定位在早期胚胎的胞质中;沉默TRIM8基因会显著降低囊胚发育率。TRIM8可能参与调控小鼠早期胚胎的发育进程。     

四川省食品动物源大肠杆菌mcr-1与ESBLs基因共转移分析

为了解四川省食品动物源大肠杆菌mcr-1耐药基因流行情况,及其与超广谱β-内酰胺酶基因(ESBLs)共存和共转移的特征,采用微量肉汤稀释法检测菌株对不同抗菌药物的敏感性;采用PCR检测菌株mcr-1,以及mcr-1阳性菌株中ESBLs基因类型;采用质粒接合转移试验分析了mcr-1与ESBLs基因共转移的耐药机制。结果显示:190株大肠杆菌的mcr-1检出率为36.84%,75.71% mcr-1阳性菌株中同时检出ESBLs基因,主要以blaTEM-1、blaCTX-M-55和blaCTX-M-14为优势基因;mcr-1阳性菌对氨曲南(ATM)、头孢噻肟(CTX)和多黏菌素E(COL)耐药率极显著高于mcr-1阴性菌(P<0.01);质粒转移率为47.14%,其中获得mcr-1和ESBLs基因共转移的接合子表现出与供体菌相同的耐药表型及耐药基因。综上,在四川省食品动物源大肠杆菌中,mcr-1与ESBLs基因共存现象广泛存在,且耐药基因易发生水平传播,对菌株多重耐药性的产生具有重要意义。     

梅花鹿茸生长过程中顶端不同组织COL1A1基因启动子DNA甲基化模式及差异分析

为探究COL1A1基因表达的Ⅰ型胶原蛋白α1链在组成生物体结构和骨发育中的重要作用,以梅花鹿茸生长过程的小鞍子(前期)、二杠(中期)和三杈茸(后期)3个典型时期鹿茸顶端组织及其茸皮、间充质、前软骨和软骨4个组织层为试验材料,采用亚硫酸氢盐测序法(BSP技术),从时空角度研究鹿茸生长过程中顶端不同组织COL1A1基因启动子区DNA甲基化模式及其相互间DNA甲基化差异。结果显示:1)COL1A1基因在前、中、后期的茸皮组织中的甲基化率分别为(9.73±0.92)%、(7.60±0.69)%和(3.73±0.23)%;间充质组织中的甲基化率分别为(3.20±0.40)%、(1.33±0.23)%和(1.60±0.69)%;前软骨组织中的甲基化率分别为(4.67±0.83)%、(2.53±0.46)%和(2.67±0.23)%;软骨组织中的甲基化率分别为(5.60±0.40)%、(2.80±0.40)%和(2.27±0.61)%。2)COL1A1基因启动子区的甲基化区域共有25个CG位点,在17个CG位点上均发生了不同程度的甲基化。3)对COL1A1基因启动子区DNA甲基化差异分析发现,相同时期中,茸皮组织甲基化率最高,间充质组织甲基化率最低;相同组织中,中期比前期显著下调;CG位点的比较中,前期与中期的CG位点差异程度较大。综上,COL1A1基因在快速生长期,以及在间充质组织、前软骨组织、软骨组织中对鹿茸生长具有促进作用。在DNA甲基化水平上探究梅花鹿鹿茸不同组织的时空表观遗传差异,为鹿茸快速生长与骨化机制的研究,以及哺乳动物组织再生和器官修复等领域的研究提供了科学参考。     

黄瓜果实黄色线相对长度的遗传分析

【目的】阐明黄瓜果实黄色线相对长度(黄色线长度与果实长度百分比,以下均称为黄色线比例)的遗传特点,为黄瓜果实外观品质优良品种的选育提供理论依据。【方法】以黄色线较长的自交系9501及黄色线短的自交系9502及其F₁、F₂、回交世代（B₁、B₂）为试验材料,利用ABC联合尺度遗传分析和主基因+多基因模型遗传分析2种方法,对各世代黄瓜果实的黄色线比例进行遗传分析。【结果】 ABC联合尺度遗传分析结果表明,黄色线-比例的遗传符合-加性-显性模型,加性效应［d］为－34.673,显性效应［h］为－32.037。主基因+多基因模型遗传分析结果表明,黄色线比例遗传受1对加性-显性主基因+加性-显性多基因控制,分离世代中, B₁、B₂、F₂世代的主基因遗传率(h_mg²)分别为72.79%,67.81%和81.07%;多基因遗传率（h_pg²）分别为26.34%,25.93%和17.83%。主基因加性效应［d］和显性效应［h］值分别为－34.78和－32.96。2种方法分析结果表明,黄色线比例遗传均存在负向的加性、显性效应。【结论】黄色线比例的遗传以主基因遗传为主,同时受微效多基因影,环境条件影响不大,适宜进行早代选择。     

洋葱AcSCL4的克隆及其功能分析

【目的】初步探讨AcSCL4在洋葱成花中的功能，为解析洋葱成花分子调控机制提供理论基础。【方法】以长日生态型洋葱品系SB2为试验材料，根据已有的洋葱转录组数据，通过qRT-PCR筛选目的基因AcSCL4后进行基因克隆，并对其进行生物信息学分析；构建AcSCL4基因的过表达载体pB221-3300-AcSCL4并转化农杆菌，采用花序浸染法浸染拟南芥，并对T₃代纯系转基因植株进行表型分析和开花相关基因表达量分析。【结果】洋葱AcSCL4基因CDS长1 515 bp，编码504个氨基酸；AcSCL4蛋白N端高度变异，C端有GRAS结构域。聚类分析发现，AcSCL4与石刁柏和棉花的SCL4蛋白亲缘关系较近。与野生型拟南芥相比，AcSCL4过表达植株表现晚花表型。荧光定量PCR结果表明，与野生型拟南芥相比,AcSCL4过表达植株开花调控基因CO和FT的表达量极显著下降。【结论】AcSCL4通过调控CO及FT基因表达来抑制洋葱开花。     

过表达玉米ZmSC1基因增强转基因拟南芥的耐盐性

旨在从玉米中克隆耐盐相关基因ZmSC1,分析其分子特征并在拟南芥中研究其耐盐性的生物学功能。以玉米B73为试验材料,克隆ZmSC1全长序列,与其他物种进行同源性比对,解析其盐诱导表达模式和亚细胞定位情况,将ZmSC1转入到拟南芥突变体atsc和野生型中,观察在盐处理下种子萌发率和主根根长情况,利用荧光定量PCR分析相关逆境（140 mmol·L^-1胁迫）基因的表达量。结果表明,ZmSC1基因全长为423 bp,编码141个氨基酸,ZmSC1和小麦、拟南芥中已知的TaSC1、AtSC1具有较高保守性。烟草细胞瞬时表达、玉米原生质体亚细胞定位研究表明ZmSC1定位于细胞膜中。生物学功能研究发现在140 mmol·L^-1的NaCl的盐处理下,相比较于拟南芥突变体,回补植株拟南芥的种子萌发率和主根根长得到了明显改善,这说明ZmSC1基因可以回补拟南芥同源基因AtSC1突变体植株在盐胁迫下的表型。ZmSC1基因过表达拟南芥植株的种子萌发率和主根根长也显著高于野生型植株。荧光定量PCR结果显示相较于野生型,在过表达植株中AtRD29A、AtSOS2、AtSOS3、AtCDPK1等胁迫相关基因的表达量也明显增强。研究结果表明TaSC1、AtSC1的同源基因ZmSC1对提高拟南芥的耐盐性具有重要作用。     

辣椒转录因子CaNAC083对高温胁迫的响应

【目的】分析辣椒NAC转录因子CaNAC083在高温胁迫响应中的作用,为阐明辣椒耐高温机理奠定基础。【方法】以辣椒P70为材料,扩增CaNAC083基因,对其进行生物信息学分析,在辣椒中构建基因沉默载体沉默该基因,用RT-qPCR检测沉默效率以及高温胁迫相关基因CaHsfA2、CaHsfB5、CaHsp25.9和CaHSP90的相对表达量,测定42 ℃高温胁迫处理10 h前后丙二醛（MDA）含量、相对电导率、F_v/F_m、活性氧（H₂O₂和O^-₂·）含量以及抗氧化酶（超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）和过氧化氢酶（CAT））活性的变化,观测二氨基联苯胺（DAB）和氮蓝四唑（NBT）染色情况;同时构建过量表达载体转化拟南芥,测定42 ℃高温处理12 h前后的MDA含量、活性氧含量、相对电导率以及抗氧化酶活性的变化,探讨CaNAC083基因对植株耐高温能力的影响。【结果】CaNAC083属于NAP亚家族的一员,且与典型的NAP亚家族成员的结构一致。CaNAC083基因沉默辣椒植株在高温胁迫后叶片损伤较轻,MDA、相对电导率以及活性氧均低于对照植株,而POD、SOD和CAT活性高于对照植株,CaHsfA2、CaHsfB5、CaHsp25.9和CaHSP90相对表达量均高于对照植株。过表达CaNAC083拟南芥株系在高温胁迫下受害程度较WT严重,MDA、相对电导率以及活性氧含量均高于WT,而POD、SOD和CAT活性均低于WT。【结论】CaNAC083基因沉默可以增强辣椒植株的耐高温性,过表达该基因则减弱植株的耐高温性,判断CaNAC083在植物高温胁迫中可能起负调控作用。     

上海低盐度封闭海域IMTA建立及大黄鱼生态养殖

在上海金山低盐度封闭海域建立了IMTA(integrated multi-trophic aquaculture)系统,进行了大黄鱼(Larimichthys crocea)成鱼生态养殖试验及营养检测分析。结果显示:采用水生植物穗花狐尾藻、近江牡蛎进行生态修复后,水体中硝态氮、亚硝态氮、铵态氮、磷酸盐和COD平均浓度分别下降58.82%、37.50%、55.32%、53.85%和45.18%,大黄鱼存活率达到94%,10月份特定增长率0.22%±0.018%/d。生态养殖的大黄鱼肥满度、肝体指数、脏体指数分别为1.82±0.25、1.36%±0.32%、3.18%±0.22%,均显著低于非生态养殖的大黄鱼13.7%、25.7%、24.5%(P0.05)。特别是粗脂肪含量为31.14%±0.11%,显著低于非生态养殖的大黄鱼42.46%±0.08%(P0.05);粗蛋白、灰分和水分含量分别为66.79%±5.94%、3.84%±0.003%和73.15%±0.07%,均分别显著高于非生态养殖的大黄鱼54.91%±4.88%、3.14%±0.005%和65.96%±0.03%(P0.05);生态养殖大黄鱼的必需氨基酸的缬氨酸(Val)、蛋氨酸(Met)、异亮氨酸(Ile)、亮氨酸(Leu)、苏氨酸(Thr)、苯丙氨酸(Phe)、赖氨酸(Lys)含量显著高于非生态养殖大黄鱼20.7%,36.0%,22.1%,20.5%,20.1%,25.2%,18.2%(P0.05)。以上结果表明,大黄鱼可以在5～6低盐度海域生存和养殖,生态养殖模式下的大黄鱼具有更高营养价值。     

苹果树腐烂病生防链霉菌A144的鉴定及其代谢产物的抑菌活性

旨在明确菌株A144的分类地位及其代谢产物的抑菌活性。基于形态学观察、生理生化特征以及16S rDNA序列分析将菌株A144鉴定为娄彻氏链霉菌(Streptomyces rochei)。采用含药平板法测定菌株A144的抑菌谱,结果表明其发酵滤液对苹果树腐烂病菌(Valsamali var.mali)、西瓜枯萎病菌(Fusarium oxysporum)、水稻恶苗病菌(Fusarium moniliforme)以及番茄早疫病菌(Alternaria solani)均有抑菌活性,抑菌率分别为68.15%±2.62%、28.90%±1.79%、33.77%±2.59%和11.43%±0.81%。以苹果树腐烂病菌为指示菌,从12种不同培养基中筛选出ISP2培养基为菌株A144的最佳发酵培养基,其发酵滤液的抑菌率达85.06%±0.86%。平板涂抹法和平板对扣法试验结果表明,其脂肽粗提物、蛋白粗提物和挥发性物质对苹果树腐烂病菌均有抑菌活性,抑菌率分别为81.44%±0.92%、47.92%±2.25%和22.87%±4.40%。可见,菌株A144在苹果树腐烂病的生物防治中具有良好的开发潜力。     

巴东醉鱼草浸膏对4种病害药效的初步研究

为了进一步明确巴东醉鱼草（Buddleja albiflora Hemsl.）的抑菌活性,采用菌丝生长速率法测定了其对小麦纹枯病菌、棉花黄萎病菌、水稻纹枯病菌、番茄叶霉病菌菌丝的生长抑制活性。结果表明,巴东醉鱼草对小麦纹枯病菌、棉花黄萎病菌具有较强的抑制作用,抑制率都达到了70%以上;对水稻纹枯病菌、番茄叶霉病菌菌丝生长在浓度10 mg干样/mL时抑制效果不明显,当浓度为50 mg干样/mL下,抑制率明显增高,分别为83.90%±0.19%、80.82%±0.36%,表现出较强的抑制率;正丁醇萃取物、乙酸乙酯萃取物、石油醚萃取物对上述4种病菌菌丝生长均有一定抑制作用,其中乙酸乙酯萃取物活性最强,在浓度为5mg干样/mL时,对4种病菌的抑制率都达到的70%以上,其中对水稻纹枯病菌的抑制率达到了81.88%±0.23%。由此可以推断巴东醉鱼草抑菌活性物质有进一步研究开发的潜力。     

赤眼鳟和麦瑞加拉鲮的化学组成、能量密度及对鳜的营养价值

为评价赤眼鳟(Squaliobarbus curriculus)和麦瑞加拉鲮(Cirrhinus mrigala)对鳜(Siniperca chuatsi)的营养价值,分别测定了体质量为(5.27±1.03)g的赤眼鳟、(5.05±1.21)g的麦瑞加拉鲮和(5.19±0.92)g的鳜的化学组成,估算了这3种鱼的能量密度,以探讨赤眼鳟代替麦瑞加拉鲮养殖鳜的可行性。结果显示,赤眼鳟和麦瑞加拉鲮的全鱼蛋白质含量显著高于鳜,水分显著低于鳜(P0.05),必需氨基酸指数分别高达92.56%±2.31%和93.17%±0.36%,多数必需氨基酸的化学评分≥0.82。而赤眼鳟的脂肪和能量密度更高,显著高于麦瑞加拉鲮和鳜,灰分显著低于麦瑞加拉鲮(P0.05)。研究表明,这两种鱼对鳜都具有较高的营养价值,但赤眼鳟的营养价值更高,以赤眼鳟代替麦瑞加拉鲮养殖鳜是可行的,这为转变鳜的养殖方式提供了参考。     

原花青素脂质体的制备条件优化

以大豆卵磷脂、胆固醇为膜材,采用逆相蒸发法制备原花青素脂质体,并对其处方进行优化。研究了脂质体制备配方中胆固醇与卵磷脂物质的量比、原花青素与卵磷脂质量比、水溶液与有机溶剂体积比及制备条件对脂质体包埋率的影响。结果表明,用逆相蒸发法获得的原花青素脂质体最佳制备条件为:胆固醇与卵磷脂物质的量比为1:2、原花青素与卵磷脂质量比为1:40、水溶液与有机溶剂体积比为1:4、温度为30℃,原花青素脂质体的包埋率为88.89%±2.5%。制得的原花青素脂质体粒径分布在185nm～1.29μm之间,在电镜的观察下为球状或近似球状的小囊泡。     

星斑川鲽胚胎的玻璃化冷冻保存

为研究星斑川鲽胚胎玻璃化冷冻保存,首先,于室温条件下采用玻璃化液五步平衡法处理星斑川鲽的尾芽期胚胎30 min,比较分析分别含有葡萄糖、果糖、蔗糖和海藻糖的4种不同玻璃化液(PMG3G、PMG3F、PMG3S、PMG3T)的毒性,发现含有海藻糖的玻璃化液(PMG3T)对尾芽期胚胎的毒性最小,胚胎的成活率与孵化率相对较高,分别为75.00%±5.43%和50.00%±4.53%(P0.05)。其次,分析玻璃化液PMG3T对星斑川鲽囊胚期至出膜前期7个时期的胚胎的毒性,发现尾芽期胚胎和心跳期胚胎经处理后成活率较高,分别为69.33%±6.43%和72.67%±3.94%(P0.05),但心跳期胚胎的孵化率较高,为65.33%±3.91%(P0.05),尾芽期胚胎次之,说明心跳期胚胎对PMG3T的耐受能力相对于尾芽期胚胎更好,更适宜进行胚胎的玻璃化冷冻保存实验。最后,采用玻璃化液PMG3T对心跳期胚胎进行–196℃冷冻实验,发现所处理的60粒胚胎中有7粒成活,可漂浮水面,继续培养后可见进一步发育,但未孵化出膜。另外,将100 mL未受精卵(未经玻璃化液处理)置于–20℃,分别在冷冻5～70 min时取出10 mL复温并进行授精,结果显示,冷冻5 min的卵的受精率为89.83%±6.51%(P0.05),随着冷冻时间的延长,受精率越来越低,冷冻70min时受精率为3.71%±1.27%,畸形率越来越高,在冷冻70min时达到100%。本研究筛选出比较适宜的玻璃化液、低温耐受性较高的胚胎发育时期,为星斑川鲽胚胎低温冷冻保存技术的建立和种质的长期保存和应用提供了实验数据。     

乳脂肪球膜磷脂-免疫球蛋白G脂质体的制备

以乳脂肪球膜磷脂为膜材,采用高压均质法制备免疫球蛋白G脂质体, 研究了不同磷脂浓度、不同均质压力和不同均质次数对脂质体的包埋率和平均粒径的影响。结果表明,磷脂浓度越大,脂质体包埋率越高、粒径越大; 均质压力和均质次数对脂质体的包埋率和平均粒径有不同程度的影响,脂质体粒径在100～200 nm之间,包埋率可达52%。用差示扫描量热法检测脂质体各组成物质的相变过程,电镜观察脂质体为球状或近似球状的小囊泡,显示成功制备出一种以乳中成分为膜材的可食用性脂质体。     

甲磺酸单诺沙星脂质体包封率的测定

利用反透析-反相高效液相色谱法测定甲磺酸单诺沙星脂质体包封率。结果表明,该法能使甲磺酸单诺沙星与辅料及溶剂得到良好分离,甲磺酸单诺沙星在0.01～10μg.mL-1浓度范围内线性关系良好(r=0.9997,n=3),该法准确简单,重复性好,可用于甲磺酸单诺沙星脂质体包封率的测定。     

安氏隐孢子虫ABC2基因的克隆表达与营养物质转运

为探究安氏隐孢子虫(Cryptosporidium andersoni)ATP结合盒转运蛋白基因(CaABC2)对营养物质的转运功能,以安氏隐孢子虫基因组作为模板,设计合成CaABC2基因特异性引物,进行PCR扩增,获得CaABC2基因。将克隆的重组质粒CaABC2基因与真核表达质粒pEGFP-C1双酶切后再连接,构建重组真核质粒载体pEGFP-C1-CaABC2;再采用脂质体转染法将重组质粒pEGFP-C1-CaABC2转入小鼠肠上皮细胞(Intestinal epithelial cells,IEC),检测不同组IEC细胞对总胆固醇、还原型谷胱甘肽、葡萄糖和碱性磷酸酶的转运效果。结果表明:扩增出778bp的CaABC2基因,测序分析与预期片段大小一致;重组真核质粒载体pEGFP-C1-CaABC2转染小鼠IEC细胞后,观察到转染后的对照组和转染组IEC有绿色荧光;检测到在细胞内液中,转染组、对照组和空白组的总胆固醇浓度分别为15.99±0.12、11.80±0.35和12.43±0.16 mmol/L;还原型谷胱甘肽浓度分别为15.24±0.44、10.48±0.35和11.04±0.75mmol/L;在细胞外液中,转染组、对照组和空白组的总胆固醇浓度分别10.67±0.17、14.82±0.06和15.84±0.17 mmol/L;还原型谷胱甘肽浓度分别为10.20±0.79、14.60±0.45和15.60±2.50mmol/L。转染组总胆固醇、还原型谷胱甘肽浓度均显著大于空白组和对照组(P0.05),而在细胞外液中,转染组总胆固醇、还原型谷胱甘肽的浓度均显著小于空白组和对照组(P0.05)。在细胞内液和外液中,空白组与对照组总胆固醇、还原型谷胱甘肽的浓度之间均未见显著性差异(P0.05);转染组、对照组和空白组之间的葡萄糖和碱性磷酸酶浓度均没有统计学差异(P0.05)。CaABC2基因具有协助转运总胆固醇、还原型谷胱甘肽、葡萄糖和碱性磷酸酶的作用,其中转运总胆固醇效果最为明显。     

高效富集磷的周丛生物构建及其特征分析

为强化周丛生物富集磷的性能,采用斜生栅藻与周丛生物共培养,形成新型的具有高效富集磷能力的人工周丛生物,并探究其特征与富集磷的机制。结果表明:与原周丛生物相比,人工周丛生物7 d磷富集量由(2.26±0.14)mg·g~(-1)显著提高到了(6.79±0.45)mg·g~(-1)。人工周丛生物有更为复杂的表面细胞结构以及更高的三维孔隙度,从而增加了表面磷的结合位点。人工周丛生物中光合作用相关生物,特别是绿藻的相对丰度提高了177.6%,从而增加了周丛生物胞内磷的吸附;胞外聚合物(EPS)中胞外蛋白质和多糖的含量增加,提升了周丛生物胞外磷的富集。周丛生物体系代谢产物的定量分析也表明:人工周丛生物中涉及到组氨酸和维生素B6代谢途径的8种关键代谢物质表达量上调。研究表明,斜生栅藻的引入改进了周丛生物的群落组成,尤其提高了光合自养微生物的丰度,促进了EPS的产率和关键代谢物质表达量的上调,最终提高了周丛生物的磷富集能力。