茶毛虫核型多角体病毒基因组酶切分析及质粒文库的构建

应用限制性内切酶图谱分析法,估算茶毛虫核型多角体病毒基因组大小为１３１．０９ｋｂ;通过随机克隆,将ＥｐＮＰＶ基因组８条ＢａｍＨ Ｉ酶切片段中的６条,１３条Ｐｓｔ Ｉ酶切片段中的７条,２６条ＥｃｏＲ Ｉ酶切片段中的７条,２１条ＨｉｎｄⅢ酶切片段中的７条,１４条Ｘｂａ Ｉ酶切片段中的９条分别克隆至载体ＰＴＺ１９Ｒ,构建了ＥｐＮＰＶ基因组的部分质粒文库。     

家蚕核型多角体病毒egt基因的克隆和序列分析

从pUAc-egt中分离出EcoR I-Xba I 1.1kb的egt基因片段作为探针,克隆了家蚕核型多角体病毒镇江株的egt基因,对该基因作了酶切分析和基因定位,测定了该基因的全序列。并与AcNPV-C6株及BmNPV-T3株的egt基因作了比较,发现它们之间的同源性在95%以上,基因大小都为1518bp。     

家蚕核多角体病毒Lef—1和DA26基因的克隆及部分序列分析

ｌｅｆ－１和ＤＡ２６基因分别位于ｅｇｔ基因的上游和下游．从ｐＵＡｃ－ｅｇｔ中分离出ＥｃｏＲＩ－ＸｂａＩ１．１ｋｂ的ｅｇｔ基因片段，进行缺口平移标记，获得探针。与ＢｍＮＰＶＤＮＡ经ＨｉｎｄⅢ酶切、电泳、转移至ＮＣ膜的ＤＮＡ进行Ｓｏｕｔｈｅｒｎｂｌｏｔ杂交，发现ＢｍＮＰＶＤＮＡ的ＨｉｎｄⅢＤ片段呈阳性。从ＢｍＮＰＶ基因组中分离出１０．４ｋｂ的ＨｉｎｄⅢＤ片段，用ＥｃｏＲＩ酶切得到ＨｉｎｄⅢ－ＥｃｏＲＩ２．２ｋｂ、ＥｃｏＲＩ１．４ｋｂ和ＥｃｏＲＩ－ＨｉｎｄⅢ６．８ｋｂ３个片段，分别克隆于ｐＵＣ１９中，命名为ｐＵＨＥ２．２、ｐＵＥ１．４和ｐＵＥＨ６．８。经双链测序并与ＡｃＮＰＶ相关基因序列进行比较，发现ｌｅｆ－１基因被克隆于ｐＵＨＥ２．２中，ＤＡ２６基因克隆于ｐＵＥＨ６．８中。从所测定的ｌｅｆ－１和ＤＡ２６基因的启动子及５＇端部分序列来看，它们在ＡｃＮＰＶ和ＢｍＮＰＶ之间有极高的同源性。     

柞蚕核型多角体病毒研究进展

柞蚕核型多角体病毒(Antheraea pernyi Nuclear Polyhedrosis Virus，简称ApNPV)，属杆状病毒科包含体杆状病毒亚科核型多角体病毒属，是柞蚕核型多角体病的病原。该成熟病毒包含体的断面分三层结构：最外层是致密层，次外层是多角体蛋白层，内部是病毒束。柞蚕核型多角体病毒的核酸为DNA，经限制性内切酶PstI，HindⅢ，BamH，XhoI，SalI，EcoR I和EcoR I BamH I酶解后，电泳分别形成31,25，6，15，24，5，7条谱带。柞蚕核型多角体病毒主要通过食下和体壁创伤途径感染柞蚕幼虫，不同病毒株对柞蚕的致病性存在着差异。柞蚕幼虫消化液对柞蚕核型多角体病毒有溶解、灭活作用；柞蚕幼虫中肠围食膜对柞蚕核型多角体病毒有灭活作用。柞蚕核型多角体病毒多角体在自然条件下有自然裂解现象，游离的病毒粒子在自然条件下很快失活。目前已建立柞蚕核型多角体病毒载体表达系统，并在分别在体内、体外表达了报告基因．     

一种新的杆状病毒转移载体的构建

从家蚕核型多角体病毒和苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒中分别克隆出其Ｐ１０基因。从ＢｍＮＰＶＰ１０中亚克隆得到基５端上游片段，经ＰＣＲ定位突变使之ＡＴＧ区突变成一个Ｂｇ１Ⅱ酶切位点。从ＡｃＭＮＰＶＰ１０中亚克隆得到基因３端下游片段，克隆人经突变的ＢｍＮＰＶＰ１０基因启动子的下游，构建成一个新的转移表达载体ｐＢｍＡｃＰＶ－１，由于ＢｍＮＰＶ和ＡｃＭＮＰＶＰ１０基因及两端的同源性高达９０％以上，     

昆虫核型多角体病毒增殖与温度关系的数学模型

本文以茶尽蠖和油桐尺蠖核型多角体病毒为例，提出了昆核型多角体病毒增殖量与温度关系的模型，该模型可用Ｓｃｈｏｏｌｆｉｅｌｄ和Ｓｈａｒｐｅ于１９８１年提出的变温生物发育速率与温度关系的数学模型加以拟合。     

多角体包埋异源蛋白杆状病毒表达系统的构建

[目的]探索多角体病毒的包装特性,构建能形成多角体包裹外源蛋白的polyh+Bac-to-Bac表达系统。[方法]通过酶切连接的方式,将4个元件片段:作为标记的绿色荧光基因EGFP,Bm CPV自身的多角体蛋白基因,用于基因表达的H1信号肽柔性连接肽,插入到质粒Fast Bac Dual中,利用Ac MNPV Bac-to-Bac系统,得到整合表达重组Bacmid:Ac-polyh/EGFP。将其感染Sf9细胞后,检测蛋白表达情况。[结果]利用该系统构建了一种能大量表达绿色荧光蛋白(EGFP)和能在胞质形成多角体的重组病毒v Bm Bac(polyh+)-EGFP。感染的Sf9细胞在荧光显微镜下观察发现EGFP与多角体可以在同一细胞中同时表达;从感染的Sf9细胞中收集纯化多角体,观察到多角体能被激发出绿色荧光,进一步利用Western blot证实多角体中含有EGFP。[结论]该表达系统为解决活性蛋白长期保存提供了新方法,同时拓宽了杆状病毒在开发含有毒素蛋白的新型生物杀虫剂和新型疫苗的转运载体等领域的应用前景。     

柞蚕核型多角体病毒载体表达系统基因工程研究进展

柞蚕是一种野外饲养的经济昆虫，它以蛹滞育越冬，主要分布在我国东北部山区。我国柞蚕年产茧量６万ｔ左右，占世界柞蚕产量的９０％以上。柞蚕核型多角体病毒（ＡｐＮＰＶ）属杆状病毒科Ａ亚组，是柞蚕脓病的病原体，对柞蚕蛹十分敏感。建立柞蚕核型多角体病毒载体表达系统，以柞蚕蛹为宿主昆虫进行外源基因的大量表达生产，具有成本低、安全、易管理，可工业化生产等特点。本文概述作蚕核型多角体病毒载体基因工程研究的进展，其中     

蜀柏毒蛾核型多角体病毒（NPV）DNA的初步研究

经ＳＤＳ—冷酚法由纯化的蜀柏毒蛾ＮＰＶ颗粒抽提到了ＮＰＶ的ＤＮＡ．经ＳｅｐｈａｄｅｘＧ—１００柱层析和聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定，该ＤＮＡ是均一制剂．ＰｏＮＰＶ－ＤＮＡ的Ｔｍ值测定为７０℃，经限制性内切酶ＨｉｎｄⅢ和ＥｃｏＲⅠ酶切，琼脂糖电泳分析测得该ＤＮＡ分子量约为５５×１０６道尔顿左右．     

微胶囊化昆虫病毒在宿主体内的动态增殖研究

为进一步了解微胶囊化斜纹夜蛾核型多角体病毒（Spodoptera litura nuclear polyhedrosis virus，SINPV）在宿主体内的侵染过程，以明胶/羧甲基纤维素（Carboxymethylcellulose，CMC）为壁材，茶多酚为固化剂，斜纹夜蛾核型多角体病毒为芯材的病毒微胶囊，通过建立实时荧光定量PCR（RT-qPCR）对染病的斜纹夜蛾幼虫中肠、血淋巴及完整虫体的数个时间点所取样本进行病毒量检测，探究微胶囊化斜纹夜蛾核型多角体病毒在其宿主幼虫体内不同组织中的增殖动态. 结果显示，微胶囊化病毒在初始阶段病毒增殖速度低于未包埋病毒，到达中肠组织和血淋巴组织平台期的时间分别晚10、20 h，最终幼虫体内中肠组织病毒基因拷贝数稳定在10^5~10^5.5，血淋巴内病毒基因拷贝数稳定在10^4~10^5，微胶囊化并未改变病毒在昆虫体内的增殖规律，对昆虫的灭活效率取决被包埋病毒的活性.     

一株空多角体突变的HaSNPV的发现及其生物学性质初探

[目的]探索一株新的空多角体突变的HaSNPV的生物学性质。[方法]利用同源重组的方法构建HaSNPV细菌人工染色体的过程中,发现一株多角体病毒对棉铃虫幼虫无毒性。通过电镜观察和Western-blot检测对多角体的生物学性质进行了初步探索。[结果]细胞和多角体的电镜结果表明,该病毒能形成正常的多角体外壳,但是不能包装病毒粒子。通过PCR检测,发现其ORF51-54片段缺失,但这一多角体的突变并不与多角体基因和p10基因有关,ORF53(fp25)的回复也证明fp25的缺失不是造成此突变的原因。[结论]该突变株将为HaSNPV基因功能的研究提供良好的技术平台与研究素材。     

斑痣悬茧蜂和斜纹夜蛾核多角体病毒的互作及氟啶脲对寄生蜂的影响

为探寻小同生物防治资源协同控制害虫的可行性,研究了斑痣悬茧蜂和斜纹夜蛾核多角体病毒(SIN-PV)联合作用于斜纹夜蛾时两者的相互影响,以及昆虫生长调节剂氟啶脲对斑痣悬茧蜂的影响,结果表明,在SIN-PV浓度为10~6PIB/ml、10~7PIB/ml和10~8 PIB/ml 3个浓度下,无沦是病毒和寄生蜂一同处理,还是先寄牛蜂处理1 d后冉病毒处理,斑痣悬茧蜂对SINPV的侵染力和侵染速度均无显著影响.联合处理时病毒埘寄牛蜂也无不良影响,蜂后代结茧数与对照无差异,仅缩短了先寄生蜂后10~6PJB/mJ SINPV处理组寄生蜂从卵刮茧的发育历期.从氟啶脲对斑痣悬茧蜂的影响来看,寄生蜂寄生经1.25 mg/L氟啶脲处理后的甜菜夜蛾,其后代发育历期和结茧均未受影响,仅羽化受影响.寄生蜂成虫卣接经10 ms/L、20 mg/L和40 mg/L(田间推荐剂量)氟啶脲处理后,均对后代结茧和发育历期等无显著影响.表明斑痣悬茧蜂可较安全地与一定浓度范围斜纹夜蛾核多角体病毒或氟啶脲联合用于夜蛾类害虫的控制.     

含伪狂犬病毒完整UL49基因及部分UL48基因片段的克隆与序列分析

以地高辛标记的伪狂犬病毒（PRV）Ea株UL49.5基因片段为探针，同SalI、KpnI、BamHI消化的PRV Ea株基因组DNA进行Southern杂交，确定SalI2.8kb、KpnI17.0kb、BamHI25.0kb片段中含UL49基因。将SalI2.8kb片段克隆到pUC119中，利用其中的BamHI进行亚克隆，获得重组质粒pUC2.0。测定约2.0kb片段的全序列并进行序列分析，发现该片段包含UL50基因部分编码区，UL49.5基因和UL49基因的完整编码区，并且在UL49基因下游，还存在一段约369个碱基的序列，经与人单纯疱疹病毒I型（HSV－1）、牛单纯疱疹病毒I型（BHV－1）的UL48基因进行比对，具有较高的同源性，推测为PRV UL48基因的部分编码区。     

柞蚕核型多角体病毒sod基因核心序列的克隆与分析

根据多种鳞翅目昆虫NPV sod基因的保守区序列设计引物,克隆了柞蚕NPV的sod基因中300个核苷酸的核心区序列.通过同源性比较发现,柞蚕NPV的sod基因与云杉卷叶蛾(Choristioneure fumiferana)和黄杉毒蛾(Orgyia pseudotsugata)NPV的sod基因的同源性较高,分别为80.1%和76.6%,而与家蚕NPV和苜蓿尺蠖NPV的同源性相对较远.     

斜纹夜蛾多角体病毒基因组的限制酶解分析

用3种限制性内切酶分析了斜纹夜蛾多角体病毒（SLNPV）基因组，结果显示：SLNPV基因组DNA含量在134．6～144．0kb左右，SLNPV的XbaI酶切片段为26个，XbaI和EcoRI双酶切片段为36个，EcoRI酶切片段为24个。还对SLNPV含丰富的EcoRI和XbaI酶切位点的原因进行了讨论。     

拟南芥PhrIP1基因超表达、GFP和RNAi载体的构建

根据编码拟南芥成膜素相关蛋白(PhrIP1)基因cDNA全序列设计超表达引物,以1～1000bp之间序列设计GFP引物和序列内部第24～240bp之间序列设计RNAi引物,以pMD18-T-PhrIP1为模板,用PCR方法分别扩增出1.8kb、1.0kb和0.216kb的片段,分别克隆至双元表达载体、GFP载体和RNAi载体上,得到了植物超表达载体pBI-PhrIP1、GFP载体pMON-GFP-PhrIP1和RNAi载体Hellsgate2-PhrIP1。用电转化法,将这些重组质粒导入农杆菌GV3101菌株中,PCR扩增结果表明所构建的植物超表达载体pBI-PhrIP1、GFP融合载体pMON-GFP-PhrIP1和RNAi载体Hellsgate2-PhrIP1已导入农杆菌。     

含绿色荧光蛋白及trp3iar基因的草菇表达载体的构建

分别用限制性内切酶EcoR I和HindIII酶切质粒pBGgHg,将切下的含双孢蘑菇gpd启动子、EGFP基因和35S终止子的碱基序列连接到含Ap抗性的pBSK II上,再将这一段序列切下连接到含kan抗性的pCAMBIA1300载体上,形成中间质粒载体YH2873。用限制性内切酶HindIII分别酶切质粒YH2873和质粒pDB06,将从pDB06切下的trp3iar基因连接到中间质粒载体YH2873上,得到表达载体pSAGF。中间载体pYH2873经限制性内切酶EcoR I和HindIII酶切,电泳后显示1.3 kb的目的片断和9 kb的载体片断,表达载体pSAGF经限制性内切酶HindIII酶切,电泳后显示4 kb的trp3iar基因的目的片断和10 kb的载体片断,进一步测序证明重组质粒连接正确,成功构建了草菇的表达载体pSAGF。     

含绿色荧光蛋白及trp3iar基因的草菇表达载体的构建

分别用限制性内切酶EcoR I和HindIII酶切质粒pBGgHg,将切下的含双孢蘑菇gpd启动子、EGFP基因和35S终止子的碱基序列连接到含Ap抗性的pBSK II上,再将这一段序列切下连接到含kan抗性的pCAMBIA1300载体上,形成中间质粒载体YH2873。用限制性内切酶HindIII分别酶切质粒YH2873和质粒pDB06,将从pDB06切下的trp3iar基因连接到中间质粒载体YH2873上,得到表达载体pSAGF。中间载体pYH2873经限制性内切酶EcoR I和HindIII酶切,电泳后显示1.3 kb的目的片断和9 kb的载体片断,表达载体pSAGF经限制性内切酶HindIII酶切,电泳后显示4 kb的trp3iar基因的目的片断和10 kb的载体片断,进一步测序证明重组质粒连接正确,成功构建了草菇的表达载体pSAGF。