含铁蛋白FAO1融合基因的衣藻核转化表达和分析

【目的】fao1编码Candida cloacae中一种含铁辅基的长链脂肪醇氧化酶。通过构建该基因的衣藻核转化表达载体进行转化,根据表达蛋白的生物活性判断fao1能否充分利用衣藻叶绿体中的铁元素行使功能;同时也为需铁固氮酶基因的研究提供方向。【方法】通过PCR把PsaD信号肽、fao1、His-tag标签融合,连接到pDBle载体上;采用玻璃珠转化法,将重组子导入莱茵衣藻（CW15）中;经博来霉素筛选后,获得转基因植株。运用PCR和RT-PCR法检测了转化衣藻,并且用亲和层析柱纯化蛋白,同时进行FAO1活性检测。【结果】重组质粒测序完全正确;PCR和RT-PCR检测转化衣藻基因组DNA和RNA,扩增片段与预期相符;转化衣藻FAO1蛋白纯化洗脱液使ABTS（2,2′-联氨-双（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二胺盐）底物反应变色。【结论】成功构建了信号肽、FAO1和His-tag融合基因的衣藻核转化表达载体,重组质粒已整合到莱茵衣藻基因组中,并成功转录,纯化的蛋白检测有活性。     

家蝇（Musca domestica）羧肽酶基因克隆及原核表达

从构建的家蝇幼虫cDNA 质粒文库中筛选到羧肽酶（Carboxypeptidase、CP）基因、以该基因的cDNA 文库 质粒为模板、通过PCR 扩增、获得CP 基因完整编码序列（登录号;KF939629.1）。运用生物信息学方法对该基因及其 编码蛋白的基本理化性质尧信号肽和亚细胞定位等进行预测和分析。构建PEASY-E1-CP 重组质粒、转化到大肠杆菌 OrigamiB (DE3)中进行诱导表达。研究结果表明、CP 基因ORF 全长1 284 bp、编码428 个氨基酸、理论分子量47.8 ku、等电点为6.10、具有CP 家族的蛋白保守结构域;重组原核质粒pEASY-E1-CP 经IPTG 诱导、蛋白在大肠杆菌中 获得表达。     

东亚钳蝎神经毒素基因BmKCT的克隆与表达

从蝎毒腺中提取总RNA,通过RT-PCR得到东亚钳蝎神经毒素BmKCT的cDNA,将其连接到pUCm-T载体中。序列分析表明,该基因开放阅读框架编码59个氨基酸残基,其中24个为信号肽,其余35个为成熟肽,与Genebank上登录的相同。将蝎神经毒素cDNA再经PCR扩增除去信号肽序列,克隆到pTrcHisA表达载体中,转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导可高效表达分子质量为10ku左右的融合蛋白。表达产物约占菌体总蛋白的25%。     

禽多杀性巴氏杆菌C48-1株OmpA基因表达与抗原性鉴定

为了研究禽多杀性巴氏杆菌(Pm)外膜蛋白A(Omp A)的免疫原性,根据C48-1菌株Omp A基因序列设计一对特异性引物,采用PCR方法扩增去信号肽的成熟Omp A基因.将去信号肽的成熟Omp A基因扩增片段双酶切后,克隆到p GEX-6p-1表达载体中,构建重组表达质粒p GEX-Omp A,转化宿主菌BL21并经异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达.SDS-PAGE的结果显示,融合蛋白GST-Omp A大小约为63 ku,与预期的分子质量相符.免疫印迹分析结果表明,该融合蛋白与鸡抗Pm血清具有明显的免疫反应,说明Omp A具有良好的抗原性,这为禽Pm Omp A在免疫防御研究中的应用奠定了基础.     

烟曲霉WY-1植酸酶基因的克隆及其在烟草中的表达

以自行筛选的烟曲霉WY-1为出发菌株,通过PCR方法克隆其植酸酶基因,并构建了含有植物信号肽序列的植酸酶基因植物表达载体,利用农杆菌介导的叶盘法对烟草叶片进行了遗传转化.结果表明,PCR鉴定和Southern杂交分析说明植酸酶基因已整合到烟草的基因组中;RT-PCR检测结果证实了植酸酶基因已得到转录表达;酶活性分析表明功能性的植酸酶已成功表达在烟草中,这是烟曲霉植酸酶基因在烟草中的首次表达.     

热纤维素梭菌内切葡聚糖苷酶基因在枯草芽孢杆菌的表达

对热纤维素梭菌Clostridium thermocellum内切葡聚糖苷酶基因CelG及其信号肽序列进行了克隆及表达研究.以热纤维素梭菌总DNA为模板,经PCR扩增获得目的,并连接到大肠杆菌-枯草杆菌穿梭质粒pSW1载体,获得质粒pSW1-CelG;用感受态转化法将获得质粒pSW1-CelG转化到枯草芽孢杆菌BGSC中进行分泌表达,获得了大小约56KD的蛋白片段,且具有生物活性,证明CelG基因克隆成功并正确表达.     

人乙酰胆碱酯酶(hAchE)基因4个分泌型酵母表达载体的构建

设计合成3条引物,以载体pcDNA3．1-hAchE为模板,扩增出两端带有EcoRⅠ的约1．8kb去除信号肽但保留18bp分子内伴侣序列的hAchE结构基因,及去除信号肽序列与分子内伴侣序列的hAchE成熟肽基因。将两个基因插入到酵母分泌型表达载体pPIC9和pHIL-S1,获得正向插入的4个分泌型酵母表达载体。为转化酵母,筛选分泌型高效表达hAchE菌株奠定了基础。     

铁皮石斛2个P型H~+-ATPase基因的克隆、表达及生物信息学分析

利用RACE进行铁皮石斛质膜PMA(plasma membrane H~+-ATPase)基因的全长克隆,采用生物信息学方法、DNASTAR 7.0和MEGA 7.0对其编码蛋白结构、序列和分子进化等进行分析,并借助实时荧光定量PCR技术检测基因表达模式。结果表明,从铁皮石斛叶片cDNA中分离到2个P型H~+-ATPase基因 DoPMA1和 DoPMA2(GenBank注册号KU160470和KU160471),各编码1条由973和951个氨基酸组成的肽链;2个基因编码蛋白均含有2个保守的P型ATPase结构域和5个H~+运输ATPase结合位点,不含信号肽,定位在质膜。2个蛋白与植物H~+-ATPases蛋白相似性大于72%,聚在拟南芥、水稻等植物H~+-ATPase分子进化树的Ⅴ和Ⅱ分支。实时荧光定量PCR分析表明, DoPMA1在根和茎中上调,分别为叶中的2.98、1.95倍, DoPMA2在根与叶中表达无显著差异,茎中下调为叶中的0.86倍。研究结果为进一步揭示 DoPMA1和 DoPMA2分子作用奠定基础。     

象草CpCCoAOMT2基因的克隆及生物信息学分析

从象草中克隆了CpCCoAOMT2基因,并对其进行了初步的生物信息学分析。利用转录组测序获得的表达序列信息,设计1对特异性的PCR引物,应用RT-PCR技术从象草中扩增出CpCCoAOMT2基因。对获得的基因进行序列同源性搜索、结构域搜索及3D结构预测、分子系统进化树构建等生物信息学分析。测序结果表明,CCoAOMT2基因全长926 bp,含110 bp的5'-UTR、741 bp的CDS和75 bp的3'-UTR,共编码246个氨基酸,Gen Bank登录号为Bank It1975804;Blastn和Blast T分析结果显示,CpCCoAOMT2基因及其编码的蛋白在核苷酸水平和氨基酸水平上与多种植物的CCoAOMT基因和CCoAOMT蛋白具同源性;预测CpCCoAOMT2蛋白相对分子质量为27 253,等电点为5.08,是一个不含跨膜结构域、不含信号肽分子的亲水性、稳定蛋白。分子进化树分析结果表明,CpCCoAOMT2蛋白与禾本科植物的CCoAOMT蛋白亲缘关系最近,与裸子植物和蕨类植物关系较近,而与双子叶植物的关系较远。     

基于pHY300PLK的分泌表达载体的构建

用PCR、酶切、连接方法将地衣芽孢杆菌耐高温α淀粉酶基因(amy)表达单元(包括启动子、信号肽及淀粉酶基因)克隆到pHY300PLK中，并用反向PCR、同源重组方法，去除重组质粒的氨芐抗性基因，以利用α淀粉酶基因的启动子和信号肽高效表达自身蛋白及外源蛋白。结果表明：连入了α淀粉酶表达单元的pHY300PLK，即pAMY质粒能够分泌表达α淀粉酶，且去除了氨苄抗性基因的pAMY质粒，即pAMY1质粒能更有效的表达α淀粉酶；将纤维素酶基因连接到pAMY1质粒中淀粉酶信号肽的下游，得到的重组质粒pCEL能分泌表达纤维素酶，表明α淀粉酶基因的启动子和信号肽不仅能启动自身蛋白的表达，也能启动外源蛋白的表达；重组菌的生长情况与质粒拷贝数的比较表明，与PAMY质粒相比去除了氨苄抗性基因的pAMY1质粒对重组菌的生长没有影响，且pAMY1质粒在重组菌的复制效率更高，能更高效的表达蛋白，以上结果证明pHY300PLK克隆质粒已成功改造成表达质粒，下一步可用于更多外源基因的分泌表达。     

农杆菌介导Ds转座因子的黄瓜遗传转化

以黄瓜品种"中农15"子叶外植体为试料,绿色荧光蛋白GFP基因为报告基因,利用农杆菌介导的遗传转化法将构建的激活表达标签pDsBar导入黄瓜,获得转基因黄瓜群体,对转化群体进行GFP基因活性及分子检测。结果表明,GFP已经整合到黄瓜基因组中;以Bar基因设计引物进行PCR检测表明,阳性率为72.3%;通过Southern杂交分析,发现26.0%为1个插入位点,51.0%为2个插入位点,T-DNA在基因组中的平均拷贝数为2.2个。     

OsVIP1 RNAi转基因水稻植株的构建

为进一步阐明农杆菌介导的遗传转化分子机制,进而利用分子生物学方法提高农杆菌转化水稻效率,以水稻品种中花11为遗传转化受体材料,利用RNAi技术对水稻中拟南芥AtVIP1蛋白的同源蛋白进行了功能研究。通过同源性比对得到水稻中拟南芥AtVIP1蛋白的同源蛋白序列,命名为OsVIP1,构建了该蛋白基因2个片段(R1和R2)的RNAi表达载体pDS1301-2-R1和pDS1301-2-R2,通过农杆菌介导的方法分别转化水稻中花11。对转基因抗性愈伤进行统计,结果表明,由携带pDS1301-2-R1和pDS1301-2-R2载体转化的抗性愈伤的形成受到一定程度抑制。经PCR检测,证明2个片段R1和R2均成功整合到再生水稻植株基因组中;半定量RT-PCR分析显示部分RNAi转基因植株中OsVIP1基因表达被成功抑制。     

猪胰岛素诱导1基因的cDNA克隆和差异表达及蛋白质序列分析

克隆猪胰岛素诱导1(INSIG1)基因,并对其蛋白质序列进行分析。根据人INSIG1基因的保守序列设计1对引物,以猪总RNA为模板,经RT–PCR获得INSIG1基因序列,通过相对荧光定量PCR分析该基因在不同组织中的表达量;将INSIG1基因序列连接到pMD19–T Simple载体上,用PCR检测阳性克隆后测序,并对克隆得到的基因进行生物信息学分析。结果表明,INSIG1基因在肺中的表达量最高,其次是在肝脏,再次是在脾脏,在心脏中的表达量最低;通过克隆,获得了一段999 bp的序列,其中831 bp的开放阅读框编码276个氨基酸;该蛋白不含信号肽序列,与其他动物INSIG1基因氨基酸序列的一致性在71%以上。     

水貂阿留申病毒部分VP2基因的克隆表达和重组蛋白的免疫学分析

根据GenBank中已发表的水貂阿留申病毒(ADV)VP2基因核苷酸序列设计合成1对特异引物,利用PCR方法扩增ADV国内分离株部分VP2基因片段,将其克隆到原核表达载体pET-28a中.经酶切、PCR扩增和测序分析证实其已正确插入到表达载体中,构建了原核表达载体pET-28a-VP2.阳性重组质粒转化宿主菌BL21,用IPTG进行诱导表达,对表达产物进行SDS-PAGE和免疫印迹分析.结果表明蛋白获得了表达,表达产物的分子质量为21 kD,与理论推测的分子质量一致;在终浓度为1 mmol/L的IPTG诱导下,5 h时表达量达到高峰;Western blot分析表明表达蛋白能被兔抗水貂抗体所识别,具有相应的抗原性.     

羊口疮病毒重庆株F1L基因克隆与生物信息学分析

旨在分析OrfV-CQ株F1L基因的分子特点,预测其编码蛋白的生物学功能。对OrfV-CQ株F1L基因进行PCR扩增、克隆及序列测定,利用生物信息学相关软件进行序列分析并对其编码蛋白的二级结构、B细胞表位、T细胞表位、保守结构域、跨膜结构域和信号肽进行预测。结果表明,OrfV-CQ株F1L基因长1 023bp,编码340个氨基酸,与Shanxi株F1L基因的核苷酸和氨基酸同源性分别为98.4%和95.0%。OrfV-CQ株F1L基因编码蛋白的α-螺旋、β-片层、β-转角、无规则卷曲分别为11.21%、10.3%、2.73%、75.76%;可能存在5个B细胞优势抗原表位,3个CTL表位,4个Th细胞表位,无跨膜结构域和信号肽。     

枯草芽孢杆菌AmyX基因信号肽性能优化研究

从枯草芽孢杆菌1A 747菌株基因组克隆Am yX基因信号肽序列,构建枯草芽孢杆菌分泌表达载体pYGAm yX,转化枯草杆菌W B 700得W B 700(pYGAm yX)。采用重叠PCR技术,将Am yX基因信号肽突变,使其N端正电荷增加,H区疏水性降低,利用突变后信号肽序列构建枯草杆菌分泌表达载体pYGMUT,转化枯草杆菌W B 700得W B 700(pYGMUT)。对W B 700(pYGAm yX)和W B 700(pYGMUT)的表达产物进行检测,研究Am yX基因信号肽突变对枯草杆菌蛋白分泌途径的影响。结果表明,W B 700(pYGAm yX)和W B 700(pYGMUT均能表达β-半乳糖苷酶,W B 700(pYGAm yX)的最高胞外酶活性达2 300 U,W B 700(pYGMUT)的最高酶活性达5 200 U。结果表明Am yX基因信号肽突变后构建的表达载体pYGMUT分泌表达β-半乳糖苷酶明显提高,说明β-半乳糖苷酶通过枯草杆菌T at途径分泌表达。     

水稻Ossp1基因的亚细胞定位及其干旱条件下的表达

sp1基因是叶绿体蛋白质输入调控的关键基因,本研究通过生物信息学分析、Real time PCR分析、瞬时表达分析等方法,对sp1在水稻中的同源基因Ossp1进行了结构和功能预测、组织表达和干旱响应性分析以及亚细胞定位分析。生物信息学分析结果显示,水稻Ossp1基因位于7号染色体,基因登录号为Os07g0647800,序列全长1 032 bp,SP1蛋白由343个氨基酸残基组成,信号肽序列位于氮端,蛋白质分子中有2个跨膜区域。Real time PCR分析结果显示,Ossp1在水稻叶片中表达量最高,其次为叶鞘,根中最低,此外,Ossp1在叶片中的表达具有明显的干旱响应性,受到干旱胁迫诱导后,表达量显著提高。采用瞬时表达进行亚细胞定位结果显示,SP1蛋白定位于水稻叶绿体。上述结果显示了Ossp1基因与水稻叶绿体及干旱胁迫响应的关系,为Ossp1基因功能的深入研究提供了基础。     

两个类ADP-葡萄糖转运蛋白基因的克隆和特征

搜索数据库获得了2个新的类似ADP-葡萄糖转运蛋白(BT)基因的序列,通过PCR直接克隆了这2个基因。这2个基因都编码406个氨基酸组成的分子量为43 647Da的蛋白。BT2 A在蛋白氮端有一段59个氨基酸残基组成的叶绿体信号肽,而BT2 B的叶绿体信号肽长度为58个氨基酸。BT2 A在信号肽后的是一段71个氨基酸长可变区,碳端是276个氨基酸长的功能域;BT2 B可变区由72个氨基酸组成,碳端也是276氨基酸长的功能域。半定量PCR表明,BT2 A为组成型表达,而BT2 B则在胚乳发育的中晚期表达。BT基因进化树分析表明,BT2 A和BT2 B基因是在禾谷类作物分化后由基因倍增产生的。     

黑木耳漆酶基因在毕赤酵母中的表达及其酶学性质研究

应用SignalP 3.0 Server软件对黑木耳漆酶基因lac1(GenBank No.AY450405)编码的蛋白质序列进行分析,发现在其N端存在18个氨基酸的信号肽序列。通过RT-PCR克隆了lac1基因,分别构建带有自身信号肽的lac1基因毕赤酵母表达载体pPICN-lac1和以α因子信号肽替换自身信号肽的lac1基因毕赤酵母表达载体pPIC9-lac。将这两个载体转化巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115细胞,获得基因工程菌GS115-pPICN-lac1与GS115-pPIC9-lac。SDS-PAGE分析和酶活性测定结果表明,在转化后者中漆酶基因得到了有效分泌表达,而在转化前者中漆酶基因未能得到有效分泌表达。进一步研究确定GS115-pPIC9-lac菌株液体发酵的最适pH为4.0,在此发酵条件下,其分泌表达的漆酶最高酶活为0.149U·mL-1。酶学性质研究表明,该酶的最适反应温度为40℃,最适反应pH为5.0,在最适反应条件下其pH稳定性和热稳定性均较好。     

PRRSV浙江株ORF5基因的原核表达与免疫原性分析

根据GenBank中公布的PRRSV基因序列(EU709837),设计一对PCR引物,以浙江分离株为模板,通过RT-PCR扩增出ORF5基因全序列.以PCR技术构建了缺失信号肽及三处跨膜区的重组ORF5基因,命名为g-ORF5.将g-ORF5基因定向克隆到原核表达载体pET-28a中,转化入E.coli菌株BL21.经酶切和测序鉴定后,阳性菌株用1 mol/L IPTG诱导表达,用Ni-NTA纯化表达的重组蛋白.结果表明,重组GP5蛋白在大肠杆菌中获得表达.纯化后经ELISA和Dot-ELISA分析,表达蛋白具有免疫反应性,能与PRRSV阳性猪血清发生特异性反应,而与阴性血清不反应.