大豆疫霉拮抗菌株的筛选与鉴定

[目的]筛选具有生防潜力的大豆疫霉拮抗菌,为寻找病害防控措施、设计新的疫病控制策略提供基础。[方法]从黑龙江省3个不同地区采集大豆根围土壤样本并分离各类土壤微生物,采用对峙培养法筛选出对大豆疫霉有拮抗作用的微生物,并在此基础上测定拮抗力较强微生物对大豆疫霉菌的生长抑制率及其对大豆疫病的控制作用。[结果]从土壤中分离得到1株拮抗效果相对较好的细菌,命名为B048菌株。对峙试验结果显示,拮抗细菌B048菌株对大豆疫霉的生长抑制率达97.5%;拮抗持久力测定显示,在与大豆疫霉对峙培养21d时抑菌带宽度仍达20.0mm;在盆栽试验中,B048对大豆疫病的防治效果为100%。经形态学和16SrDNA序列分析,初步鉴定该拮抗细菌为短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus）。[结论]拮抗细菌B048菌株具有较好的开发成大豆疫病生物防治菌的前景。     

致病疫霉拮抗放线菌的筛选及抑菌作用初步研究

为获得对致病疫霉具有显著且稳定拮抗作用的放线菌,利用对峙培养法和滤纸片法测定了从土壤中分离纯化出的放线菌活体及其发酵液对致病疫霉生长的抑制作用,并对其中抑菌效果显著的Sy11菌株的抑菌方式、对致病疫霉的感应性、传代稳定性以及对致病疫霉菌体形态的影响进行了初步研究。结果表明,分离纯化出的74株放线菌中有17株对致病疫霉具有拮抗作用,但其发酵液对致病疫霉均无抑制作用;Sy11菌株只有感应到致病疫霉存在时才分泌对致病疫霉的抑菌物质;连续传代25次后,Sy11菌株的抑制率仍然保持在81%以上;Sy11菌株可导致致病疫霉菌丝体严重变形,但只是抑制其生长,并未杀死致病疫霉。这些结果表明,Sy11菌株在防治马铃薯晚疫病方面具有较大的应用潜力。     

甘肃省马铃薯致病疫霉交配型组成及其对甲霜灵的抗药性

为了明确甘肃省马铃薯致病疫霉交配型组成与对甲霜灵的抗药性,采用生长速率法对2007-2012年采集标样中分离到186株致病疫霉菌进行甲霜灵抗药性测定,利用对峙培养法对147株代表性菌株进行交配型测定。结果表明:甘肃省马铃薯致病疫霉交配型由A1、A2、A1A2交配型和自育型菌株组成,分别占被测菌株的61.20%、20.40%、2.10%、16.30%;186株致病疫霉中28.50%的菌株对甲霜灵表现敏感,15.60%表现中抗,55.90%表现高抗。甘肃省马铃薯致病疫霉交配型组成复杂,各采集地组成差异较大,对甲霜灵表现抗药性的菌株普遍存在各采集地。     

大豆疫霉菌对大豆幼苗致病性的遗传变异研究

【目的】研究黑龙江省大豆疫霉菌的致病性特性及其遗传变异特点,为进一步探讨大豆疫霉菌致病力的遗传变异机制奠定基础。【方法】用国际标准鉴别寄主和黑龙江省部分主栽大豆品种测定黑龙江省大豆疫霉菌株的致病性,以大豆疫霉野生型菌株的单游动孢子分离物为亲本,建立连续2代单游动孢子无性后代和1代单卵孢后代,测定大豆疫霉菌致病力的遗传变异特性。【结果】黑龙江省大豆疫霉菌株对黑龙江省大豆主栽品种表现出不同的致病性,但对国际标准鉴别寄主不致病。控制大豆疫霉菌致病力的某些致病基因在连续2代单游动孢子后代和1代单卵孢后代中发生变异,而其他致病基因遗传稳定。【结论】黑龙江省大豆疫霉菌株和大豆品种具有美国大豆疫霉菌株和大豆品种所不具有的更为复杂的遗传多样性,用国际标准鉴别寄主鉴别黑龙江省大豆疫霉菌株的致病性存在明显的局限性。控制大豆疫霉菌的致病基因分布在不同位点,有的遗传稳定,由纯合的核基因控制;有的遗传不稳定,由杂合核基因或细胞质基因控制,其有性和无性后代均发生变异。     

大豆疫霉根腐病菌多聚半乳糖醛酸酶活性对其致病力的影响

就大豆疫霉根腐病菌（Phytophthora sojae）多聚半乳糖醛酸酶（Polygalacturonase,PG）活性对其致病力的影响进行了研究。结果表明,受试致病性菌株在接种复壮后PG活性明显高于复壮前的PG活性;致病性菌株的PG活性显著高于非致病性菌株PG活性;受试菌株的PG活性均在培养后第7天达到峰值。综上所述,PG活性的高低与大豆疫霉根腐病菌的致病力强弱有一定的关系,是该病菌的一种起致病作用的细胞壁降解酶。     

致病疫霉拮抗细菌WL2鉴定及其发酵液稳定性分析

为了明确WL2菌株在抑制致病疫霉(Phytophthora infestans)菌丝体生长及防治马铃薯晚疫病等方面特性,本试验采用对峙培养法和离体组织培养法检测WL2菌株对致病疫霉的抑制效果,评价发酵液抑菌作用稳定性;通过培养特征、生理生化检测以及16SrDNA序列分析对WL2菌株进行分类鉴定。结果表明,WL2菌活体、菌液和发酵液对致病疫霉菌丝体生长的抑制率分别为84.7%,86.8%和82.4%;16SrDNA序列分析表明WL2菌株为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis),该菌发酵液经121℃高温处理后,抑菌率50%,经pH值2~12的条件处理后,发酵液抑菌率70%,在紫外灯(20 W)下照射12h后,发酵液抑菌率仍能达到77%以上,并且发酵液在4℃条件下可至少存放1年并保留其生防活性。这表明WL2菌株在开发成微生物制剂用于防治马铃薯晚疫病等方面具有突出的应用潜力。     

致病疫霉拮抗细菌的筛选及抑菌作用研究

[目的]筛选获得显著拮抗致病疫霉的细菌菌株,为深入开发利用拮抗细菌抑制致病疫霉并控制马铃薯晚疫病提供依据。[方法]用平板对峙法和滤纸片法测定61株细菌活体、发酵液及菌液对致病疫霉的抑制作用并进一步测定了SR13-2菌株的诱导抗病作用。[结果]供试的61株细菌活体对致病疫霉菌丝生长的抑制率达到60%以上的有24株,其中HT-6菌株的抑菌作用最强,抑菌率达到了89.92%;但所有供试菌株的发酵液均无显著抑菌作用,而大部分菌株菌液的抑菌作用却明显高于活体菌株,其中以S34-1菌株的抑菌作用最强,抑菌率为91.50%;同时发现SR13-2菌株的菌液具有显著的诱导抗病作用,保护率可达60%。[结论]拮抗菌株S34-1和SR13-2的活体与发酵液的抑菌作用之间无相关性,而菌液在防治马铃薯晚疫病方面有较大的应用潜力。     

内生真菌DC-11的分离筛选及对致病疫霉的抑制作用

为了获得对致病疫霉有拮抗作用的植物内生真菌,采用常规的分离方法从健康的芹菜及大葱植株中分离内生真菌,并以对峙培养法筛选对致病疫霉有较强抑制作用的菌株。结果显示:分离获得的41株内生真菌与致病疫霉对峙培养后,有11个菌株的抑制率达到50%以上,以QC-18的抑菌率最高(84.21%),其次是QC-13(79.90%);无菌体发酵液活性表明DC-11菌株的抑菌作用最强(84.6%),其次是DC-1(62%);进一步试验发现,经较高浓度(1.91mg/mL)DC-11菌株的发酵液处理后的致病疫霉菌不能恢复生长,在马铃薯块茎切片上也失去了致病能力;镜检发现在0.51mg/mL浓度处理下菌丝体形态明显发生畸变。这些结果表明DC-11菌株在未来防治马铃薯晚疫病方面有一定的应用潜力。     

大豆疫霉菌对甲霜灵抗性风险的研究

为了评估大豆疫霉对甲霜灵是否存在抗性风险,采用药剂驯化的方法诱导获得了大豆疫霉菌抗甲霜灵突变株hlj34M,并对其适生性进行了初步研究。该突变体菌丝生长速率、游动孢子产量和致病力与野生型相比没有显著变化。而卵孢子产量明显减少,突变体的3个单游动孢子后代的卵孢子产量与亲本菌株相比分别减少20.35%、43.63%和43.85%,统计分析差异达极显著水平。结果表明:甲霜灵的长期使用会导致大豆疫霉对其产生较大的抗性风险。     

不同培养基对辣椒疫霉致病力的影响

辣椒疫霉的菌落形态、生长速率、产生孢子囊的能力、致病力的强弱与培养基种类有很大关系。其中在燕麦片培养基上生长最快 ,致病力也最强 ,但致病力的强弱与菌丝生长速率没有关系 ;菌株在同一培养基 (营养条件 )下生活一定时间后 ,其致病力强弱发生了分化 ,认为营养条件是影响辣椒疫霉致病力分化的因素之一     

辣椒疫霉可溶性蛋白和酯酶同工酶电泳分析

采用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳技术(SDS-PAGE)和PAGE电泳技术分别对安徽不同地区的46个辣椒疫霉进行可溶性蛋白和酯酶同工酶分析,从蛋白质和酶学水平上分析辣椒疫霉的生理生化特征。可溶性蛋白电泳表明,每个辣椒疫霉分离出了25~37条谱带,平均31.5条。其中具有多态性的条带共有24条,多态性比率达64.9%,可溶性蛋白图谱与地理来源相关,但与致病力不相关。酯酶同工酶PAGE电泳显示辣椒疫霉菌株各有1~8条条带,Rf值为0.05~1.00,不同辣椒疫霉菌株间某些同工酶谱带数和同一迁移率谱带的颜色和宽度差异显著,其中弱致病力菌株的条带数为1~3条,说明菌株的致病力差异可在酯酶同工酶水平上得到反映。     

大豆疫霉生防菌解淀粉芽孢杆菌JDF3的鉴定

分离获得1株细菌JDF3，它能有效地抑制大豆疫霉菌丝的生长和孢子囊的形成。该菌株对细极链格孢、小麦全蚀病菌和西瓜炭疽病菌的抑制率高于70%。盆栽结果显示细菌JDF3对大豆疫病的防治率为70.7%。菌株形态特征、18项生理生化和gyrB基因测序结果鉴定菌株JDF3为解淀粉芽孢杆菌。     

Distribution of mating types and genetic diversity induced by sexual recombination in Setosphaeria turcica in northern China

Mature ascocarps and ascospores in the heterothallic ascomycete fungus, Setosphaeria turcica, were successfully produced in Sach’s medium with barley culm as the mating stimulator after four weeks’ coincubation of two opposite mating type isolates at 25°C in darkness. A single isolate could not produce ascospores or ascocarps. The ascocarps were produced on the exposed surface and embedded parts of barley culm or in the upper layer of the medium. The asci linked themselves to ascocarp with their short handles and assembled at the bottom of the ascocarp. Many asci had four to six colorless mature ascospores with one to six septa. But asci with eight ascospores were also found. Using isolate 9914 and isolate 9961 as standard testers for mating types (MAT1 and MAT2), respectively, 94 isolates of S. turcica collected from northern China in 1999, 2003, and 2004 were grouped into three mating types: MAT1 (53 isolates), MAT2 (31 isolates) and MAT12 (10 isolates). The MAT12 isolates, which were first found in China, were compatible with not only MAT1 isolates but also MAT2 isolates. No MAT12 isolates were found in 1999, but 2 MAT12 isolates and 8 MAT12 isolates were found in 2001 and 2003, respectively. The geographic distribution of different mating types was unequal among locations. Generally the frequency of MAT1 was significantly higher than that of MAT2 and MAT12. The unequal distribution of mating types suggested a low frequency of genetic recombination. The pathogenicity of different mating type isolates was tested on the susceptible corn inbred B37 and the results revealed that the disease latency period, disease incidence, lesion area and conidia production were not significantly different among the three mating type groups. However, the pathogenicity of the progeny isolates of isolate 99-12 (MAT2, race 1) and isolate 99-15 (MAT1, race 0) was significantly different from the parent isolates, isolate 99-12 and isolate 99-15, suggesting that sexual recombination could cause significantly virulence variation in S. turcica. Random amplification of polymorphic DNA (RAPD) analysis also revealed high genotype diversity among the progeny isolates, indicating that the sexual recombination could also produce significant genetic variation in the fungal pathogen.     

灰葡萄孢霉对不同葡萄品种致病力差异的检测和分析

为了探明适合中国葡萄灰霉病菌致病力检测的方法以及合适的待测葡萄品种,采用菌丝块接种法和改良的保湿培养法,分别测定3个不同致病力类型的灰葡萄孢霉(Botrytis cinerea)菌株SDXL7 1、SDLK1 1、LNXCetz6 1对红提、青提、巨峰、紫奶、玫瑰香5个葡萄品种的致病力,并进行差异分析。结果表明,供试菌株均可引起5种葡萄发病,但致病力不同的菌株所致的平均病斑面积有明显差异,同一菌株在不同葡萄品种上的平均病斑面积也有明显差异。其中,巨峰和青提对灰葡萄孢霉具有较强抗性,红提和玫瑰香对3个灰葡萄孢霉菌株普遍易感,紫奶对菌株LNXCetz6 1具有较强抗性,但对另外两个菌株易感。试验结果为系统和全面地研究中国灰葡萄孢霉菌株的致病力分化提供重要依据。     

西藏牦牛牛支原体的分离鉴定及其生长特性、耐药性分析

为确定引起西藏牦牛常发多发肺炎的细菌病原体，采集145份西藏牦牛鼻腔粘液，通过病原分离培养、菌落形态观察、生化试验和PCR鉴定等方法进行细菌检测；通过OD₆₃₀和pH变化对分离株进行生长曲线测定；采用K-B纸片法进行药物敏感性试验。结果显示:从145份牦牛鼻腔粘液中分离得到10株牛支原体；分离株菌落形态和生化试验结果均符合牛支原体的生物学特性；通过PCR分别扩增得到238 bp的uvrC特异性基因与1 500 bp 16S rRNA基因。10株分离株间的uvrC特异性基因和16S rRNA基因序列同源性较高，均与国际标准株PG45有高度同源性，uvrC特异性基因序列和16S rRNA基因序列与国际标准株PG45的同源性分别为98.4%~100%和99.1%~99.9%。生长曲线测定表明，分离株在PPLO培养基中培养24 h内为迟缓期，培养42 h后开始进入稳定期，78 h后开始进入衰亡期；3个分离株培养物的平均pH随着培养时间延长不断降低，其中24~42 h期间pH下降最快，随后下降速度减慢，至78 h后几乎不再变化。药物敏感性试验表明，分离株对大环内酯类、氨基糖苷类和林可胺类等药物均存在不同程度的耐药，但对强力霉素和卡那霉素敏感或中度敏感。     

牛源鲍曼不动杆菌的鉴定及体外药敏试验

为鉴定山西省某奶牛场引起奶牛子宫内膜炎的相关病原菌。采用细菌分离培养、革兰染色镜检和16SrDNA测序分析法对采集的奶牛子宫分泌物进行细菌鉴定;通过体外药敏试验和小鼠致病性试验检测其耐药性和致病性,并与已知序列进行比对,了解其亲缘性。结果显示,共分离到1株鲍曼不动杆菌,该株菌与中国内地和美国的分离菌株属于同一分支,且与美国的分离菌株亲缘较近;该菌对青霉素、氨苄西林、阿莫西林、卡那霉素、链霉素、庆大霉素、红霉素、先锋霉素IV均耐药;对小白鼠有较强的致病性。     

果胶乙酰酯酶基因 AtPae7参与拟南芥对大豆疫霉菌的非寄主抗病性

利用反向遗传学方法,鉴定拟南芥(Arabidopsis thaliana)对大豆疫霉菌(Phytophthora sojae)非寄主抗病性相关的基因。通过分子生物学和生物信息学方法,鉴定和分析T-DNA插入拟南芥突变体离体叶片对大豆疫霉菌的非寄主抗病性。结果表明:4个果胶乙酰酯酶基因AtPae7(pectin acetyl esterase 7)突变体株系中的3个对大豆疫霉菌的抗性减弱,表现为感病;qRT-PCR检测表明突变体中AtPae7的转录水平下降;生物信息学预测PAE7蛋白的N端有23个氨基酸信号肽序列,确定其为胞外分泌蛋白。说明果胶乙酰酯酶基因AtPae7参与拟南芥对大豆疫霉菌的非寄主抗病性。     

稻纹枯病菌对水稻成株期致病力研究

 1990～1992年室内和大田接菌观察3个不同致病型菌株对水稻成株期致病力,THA的菌株147^#致病力最强.该菌具菌核萌发快,菌丝长势强,病斑潜伏期最短.还对品种、菌株、施肥量、密度等4个因素3个水平对病发生发展影响,及田间病害扩展动态进行研究.     

辣椒疫霉（Phytophthora capsici）多聚半乳糖醛酸酶 PCIPG2 N-糖基化突变体的构建与表达分析

为研究辣椒疫霉（Phytophthora capsici）多聚半乳糖醛酸酶PCIPG2 N-糖基化对其酶活性的影响,从基因组文库中分离克隆到Pcipg2基因,利用定点突变技术突变3个潜在的糖基化位点(N34, N76, N137);构建并表达N-糖基化突变蛋白,并对突变蛋白进行温度和缓冲液体系处理检测其活性。结果发现Pcipg2基因在辣椒疫霉侵染寄主的前期表达并起重要作用。PCIPG2蛋白在30°C,pH5.0 (P <0.05)的缓冲液环境下活性最高。单个的Pcipg2糖基化位点N34、N76、N137对PCIPG2的致病性起正调控作用,而3个糖基化位点相互协调的功能抑制PCIPG2的活性,在PCIPG2表达致病过程中起负调控。N-糖基化在PCIPG2酶活性上起直接作用,使得PCIPG2酶在较低水平上保持较高的稳定性。