化学辅助去核法对延边黄牛卵母细胞去核率及其重构胚发育率的影响

为提高延边黄牛体细胞克隆的效率,采用化学辅助去核法--化学诱导剂脱羰秋水仙碱(Demeeoleine,简称Deme)处理体外成熟的MⅡ期延边黄牛卵母细胞,经显微操作构建重构胚后观察发育情况.试验研究了,Deme的处理浓度、作用时间对延边黄牛卵母细胞去核效果及其重构胚发育的影响.结果显示:体外成熟的卵母细胞在0.2μg/mL、0.3 μg/mL、0.4 μg/mL的Deme溶液中处理45 min,显核率与去核率无显著差异,去核率达100%,但是0.2 μg/mL处理组的囊胚发育率显著高于其他处理组;45 min处理组的显核率显著高于30 min、60 min处理组,45 min处理组的囊胚率高于其他处理组;化学辅助去核法的囊胚率显著高于盲吸法.化学辅助去核能够准确定位去除细胞核,并提高了延边黄牛体细胞克隆的去核率及重构胚的体外发育率.     

不同融合液对延边黄牛体细胞核移植效率的影响

[目的]探寻适宜延边黄牛体细胞核移植的最佳融合液。[方法]用延边黄牛颗粒细胞为供体细胞。试验1,比较3种浓度(0.25、0.280、.30 mol/L)3种融合液(蔗糖、D-山梨醇、甘露醇)对核移植胚胎融合率及重组胚体外发育的影响。试验2,比较3种0.28 mol/L融合液对核移植效率的影响。[结果]3种浓度的蔗糖、D-山梨醇、甘露醇融合液的融合率和卵裂率差异均不显著,但0.28 mol/L融合液处理的重组胚后期发育相对较好。3组融合液融合率(88.44%、86.83%、86.85%)差异不显著,蔗糖、甘露醇融合液卵裂率(87.98%、86.06%)差异不显著,在0.05水平上显著高于D-山梨醇融合液(78.64%);蔗糖、甘露醇融合液囊胚发育率(22.16%、19.91%)差异不显著,在0.05水平上显著高于D-山梨醇融合液(10.14%)。[结论]适宜延边黄牛体细胞核移植的最佳融合液为0.28 mol/L蔗糖融合液。     

精氨酸对延边黄牛体细胞克隆重组胚发育的影响

为了提高延边黄牛体细胞克隆重组胚的发育率,试验研究了在体外培养液中添加不同浓度的精氨酸对重组胚发育的影响。选择形态良好排出第一极体的卵母细胞进行去核与注核操作,然后开始融合、激活,最后在添加不同浓度(0、0.061、0.132、0.264mmol/L)精氨酸的培养液中培养。结果发现,对照组与处理组之间重组胚的卵裂率和8-16C的发育率差异不显著,而囊胚的发育上,0.061mmol/L处理组显著高于对照组。表明体外培养液中添加精氨酸后能够促进体细胞克隆重组胚的发育。     

牛磺酸对延边黄牛体细胞克隆重组胚发育的影响

研究了体外培养液中添加不同浓度的牛磺酸对重组胚发育率的影响。试验中设计了4个牛磺酸浓度组,分别是0、7.0、14.0、21.0 mmol/L。各浓度组之间的卵裂率没有差异,其中低浓度组7.0 mmol/L的囊胚发育率较其他组高,随着浓度的上升囊胚发育率逐渐降低。体外培养液中添加牛磺酸的最佳浓度为7.0 mmol/L,能够显著提高延边黄牛体细胞克隆牛重组胚的发育率。     

挤压去核法和盲吸去核法在延边黄牛体细胞核移植中的对比研究

分别采用挤压去核法和盲吸去核法对延边黄牛卵母细胞进行去核处理,之后进行核移植,培养观察,比较两种去核方法对延边黄牛体细胞核移植效率的影响.挤压法的操作成功率和去核率明显高于盲吸法,盲吸法操作程序耗时比挤压法长,但是差异不显著.两种方法获得了相近的卵裂率和囊胚率,但挤压法构建的重组胚在囊胚数上高于盲吸法.挤压法在延边黄牛体细胞核移植上比盲吸法更有效.     

黄牛供体细胞处理及冷冻保存对核移植率的影响

本试验以延边黄牛耳部皮肤成纤维细胞作为核移植供体细胞,研究不同的供体处理方式对体细胞核移植胚胎发育的影响。使用血清饥饿和汇合处理供体细胞,并进行了体细胞的冷冻保存,研究冷冻后的核移植效果。结果显示:(1)使用血清饥饿处理和汇合处理后,均能提高重组胚的卵裂率及囊胚发育率。(2)未冷冻组重组胚卵裂率及囊胚发育率显著高于冷冻组(P<0.05)。     

胚胎分割液及分割方法对绵羊体外胚分割效果的影响

主要研究了胚胎分割液、分割方法和胚胎发育时期对绵羊体外生产胚胎的影响.体外采集绵羊卵丘卵母细胞复合体,成熟培养24 h,经过体外受精培养,得到体外胚胎样品.借助显微操作仪,将体外受精的桑葚胚和囊胚分割,体外培养半胚,观察其发育情况.结果发现:在D-PBS+0.2 mol/L蔗糖液与D-PBS+5%PVP液中分割桑葚胚和囊胚,其分割成功率及半胚的囊胚发育率及囊胚细胞数三者均无差异显著性(P＞0.05);用显微分割法和徒手分割法分割桑葚胚和囊胚,其分割成功率、半胚的囊胚发育率及囊胚细胞数均无差异显著性(P＞0.05);比较桑葚胚和囊胚分割,囊胚的分割成功率显著高于桑葚胚的分割成功率(P＜0.05),而半胚的囊胚发育率及半胚细胞数均无差异显著性(P＞0.05).结果表明:在D-PBS液中分别添加0.2 mol/L的蔗糖和5%的PVP都可作为绵羊体外胚的胚胎分割液;显微分割法和徒手分割法均可用于绵羊体外胚胎的分割;囊胚比桑葚胚更适于胚胎分割.     

血管内皮生长因子对绵羊卵母细胞体外受精及胚胎发育的影响

为了研究血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)对绵羊卵母细胞体外成熟和成熟后卵母细胞体外受精卵的早期发育的影响,在细胞培养过程中分别在体外成熟培养液、体外受精液及体外胚胎发育液中添加5、10 ng/mL VEGF.结果显示,添加VEGF组卵母细胞的体外成熟率由对照组的80.68%提高到了86.09%和85.22%(P<0.01),成熟卵母细胞的卵裂率由69.38%提高到了75.18%和73.48%(P>0.05),5 ng/mL添加组的桑葚胚率(45.45%)和囊胚率(30.06%)极显著(P<0.01)高于对照组(37.61%;23.65%);而10 ng/mL添加组的桑葚胚率(40.25%)和囊胚率(27.80%)低于5 ng/mL添加组的,高于对照组,但差异不显著.据此认为5 ng/mL VEGF的添加量比10 ng/mL VEGF添加量能更有效的促进绵羊卵母细胞体外成熟、体外受精和胚胎早期发育.     

不同受体胞质对延边黄牛体细胞核移植效率的影响

为确定延边黄牛体细胞核移植过程中卵母细胞的最佳去核时期,本试验选取体外成熟22 h的中期(MⅡ期)卵母细胞与体外成熟28 h的末期(TⅡ期)卵母细胞进行化学辅助去核操作,并将去核的卵母细胞作为受体构建重构胚,后期观察发育情况.结果显示,M期卵母细胞的显核率与TⅡ期卵母细胞的显核率无显著差异;但是TⅡ期卵母细胞所得重构胚的卵裂率及囊胚率均显著高于MⅡ期卵母细胞所得重构胚的卵裂率及囊胚率.综上所述,卵母细胞体外成熟28 h后的TⅡ期可作为延边黄牛核移植去核操作的理想时期,在TⅡ期卵母细胞中选择化学辅助去核法去核能够提高延边黄牛体细胞克隆的效率.     

谷氨酸对延边黄牛体细胞克隆重组胚发育的影响

为了提高延边黄牛体细胞克隆重组胚的发育率,试验研究了在培养液中添加一定浓度的谷氨酸对延边黄牛克隆重组胚发育的影响。选择成熟了20～22 h并且排出第一极体的卵母细胞进行去核与注核,然后进行体外培养,观察卵母细胞的卵裂以及囊胚发育情况。结果显示,低浓度的谷氨酸能够提高重组胚的卵裂率,高浓度则抑制卵母细胞的卵裂;而囊胚的发育方面,低浓度的谷氨酸会降低其发育率。所以,添加适量浓度的谷氨酸能够提高延边黄牛体细胞克隆重组胚的发育率。     

不同培养体系对绵羊体外受精胚胎发育及细胞凋亡的影响

[目的]通过SOFaaBSA和CR1 aaBSA - FBS两种培养液对体外胚胎发育率及胚胎凋亡发生的影响,筛选适合绵羊体外受精胚胎发育的培养体系,为相关研究提供一定的理论依据和研究基础.[方法]采用激光共聚焦显微镜和细胞原位凋亡检测技术(TUNEL),分析这两种胚胎体外培养系统的绵羊体外受精胚胎发育的影响及各发育阶段的细胞凋亡状况及对胚胎发育的影响.[结果]SOFaaBSA和CR1aaBSA- FBS组的卵裂率、囊胚率和囊胚孵化率均高与其它实验组,但这两组之间差异不显著(P＞0.05).同时,在两种培养液培养的2细胞、3-8细胞期的绵羊体外受精正常形态的胚胎中均未发现凋亡信号,凋亡信号在两种培养液中都是首次出现在9- 16细胞胚胎细胞中,并且随着胚胎发育至囊胚期,凋亡细胞效随着胚龄增长越来越多.在SOFaaBSA培养液培养的桑椹胚和囊胚细胞胚胎凋亡率显著低于CR1aaBSA - FBS培养液培养的桑椹胚和囊胚(P＜0.05),同时,在CR1aaBSA- FBS培养液中桑椹胚和囊胚细胞平均具有凋亡细胞的数量显著高于SOFaaBSA培养液(P＜0.05).[结论]CR1aaBSA- FBS培养系统显著的增加了绵羊晚期体外胚胎的凋亡.CR1 aaBSA - FBS能够支持绵羊体外受精胚胎的发育,但SOFaaBSA培养液更适合绵羊体外胚胎的发育.     

In Vitro Developmental Potential of Cloned Embryos Derived from Bovine Somatic Cells and Rabbits Oocyte

180 reconstituted embryos were produced by nuclear transplantation using bovine ear fibroblasts at G0 or non-G0 stage as donor nuclei and oocytes collected from superovulated multiparous or young rabbits as recipients. After cultivation in two kinds of medium M199+ 10%FBS or RD+ 10%FBS, 112 of them developed to 2-cell stage (62.2%) and 26 to morula stage (14.4%) and 20 of them eventually developed to blastocyst stage (11. 1% ). There is no significant difference for the cleavage rates in two groups of reconstituted embryos derived from G0-stage and non-G0 stage donor cells respectively. However, G0-stage donor cells could result in higher rate of 8-cell - 16-cell stage embryos significantly (P＜0.05), as well as higher rate of blastocysts (P＜0.01). It seems that using two different culture systems had no significant effects on the cleavage rate, morula rate or blastocyst rate (P＞0.05).     

巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)对小鼠胚胎体外发育的影响

以小鼠自然受精与体外受精胚胎为模型,探索鼠源巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)在小鼠胚胎早期发育过程中的生理功能。分别使用添加不同剂量(对照组:0 ng.mL-1;试验组:0.5、2和10 ng.mL-1)GM-CSF的化学限定培养基连续培养小鼠自然受精、体外受精原核期与2细胞期胚胎,检测其胚胎着床前发育效率(卵裂率、囊胚率)及囊胚的质量(囊胚总细胞数、ICM/总细胞数的比率、凋亡指数)。结果发现,对自然受精胚胎而言,原核时期添加不同剂量的GM-CSF,其卵裂率、囊胚总细胞数、ICM/总细胞数的比率在各组之间均差异不显著,但10 ng.mL-1试验组的囊胚率显著低于对照组(61.6±5.1)%(P0.05);2细胞时期添加不同剂量的GM-CSF,其囊胚率、囊胚总细胞数、ICM/总细胞数的比率在各组之间均差异不显著,但试验组中的囊胚凋亡指数均显著低于对照组(P0.05)),并且试验组中2 ng.mL-1的囊胚凋亡指数最低,显著低于0.5 ng.mL-1(P0.05),其他试验组之间的囊胚凋亡指数没有统计学上的差异性。对体外受精胚胎来说,原核时期添加GM-CSF,其卵裂率、囊胚率、囊胚总细胞数、ICM/总细胞数的比率在各组之间均无显著性差异;在2细胞时期,10 ng.mL-1组的囊胚率显著低于对照组及其他2个试验组(P0.05),但各组之间的囊胚总细胞数、ICM/总细胞数的比率均无显著性差异。本研究结果表明,在化学限定培养基中添加一定剂量的GM-CSF有利于改善小鼠自然受精与体外受精囊胚的质量,但剂量过高可能不利于小鼠受精胚胎的早期发育。     

新鲜山羊输卵管液对体细胞克隆和转基因胚胎体外发育的影响

用添加不同浓度发情期山羊输卵管液的培养基,对正常单细胞受精卵、注射外源基因后受精卵和细胞核移植后山羊重构卵进行体外培养,探讨其对胚胎体外发育的影响。结果表明:添加20%输卵管液后正常受精卵桑椹胚分裂率为26.1%(11/42),极显著(P<0.01)高于对照组(未添加输卵管液)(7.6%)、50%输卵管液组(4.7%)和100%输卵管液组(0);添加20%输卵管液后,体外培养显微注射转基因受精卵有20.0%(8/40)发育至16-细胞,极显著(P<0.01)高于对照组(6.7%)和50%输卵管液组(4.8%);细胞核移植重构卵在含20%输卵管液的培养基中桑椹胚分裂率为7.3%,与体内培养桑椹胚分裂率(11.1%)差异不显著。在体外培养条件下,添加20%输卵管液可明显提高正常受精卵、转基因受精卵和克隆重构卵的分裂率和发育率。     

CB·氨基酸在猪卵母细胞孤雌激活及体外培养中的作用

[目的]研究CB、氨基酸在猪卵母细胞孤雌激活及体外培养体系中的作用,为优化相关技术体系提供依据。[方法]卵母细胞经体外成熟培养,采用不同孤雌激活方法(Ele.+CB组、CB组、Ele.组、对照组),研究CB在激活中的作用。激活后采用PZM3培养液,并去除氨基酸成分,探索氨基酸对体外培养胚胎的作用。[结果]CB+Ele.组的卵裂率显著地高于其他3组(P<0.05),囊胚率为32.7%,囊胚细胞数为61.4,而其他3组均未出现囊胚。电激活(脉冲电压100 V/mm,脉冲时程100μs,脉冲次数1次)联合CB处理,可激活卵母细胞体外发育至囊胚,CB有助于提高卵裂率、囊胚率。添加氨基酸的培养液中的卵母细胞的卵裂率、囊胚率、囊胚细胞数显著提高(P<0.05),表明氨基酸能提高猪孤雌激活胚胎培养效果。[结论]添加CB、氨基酸在猪卵母细胞孤雌激活及体外培养体系中能提高胚胎的培养效果。     

机械分割的小鼠桑椹胚和囊胚的发育能力

利用机械方法二等份分割小鼠的桑椹胚、早期囊胚和晚期囊胚,并在体外培养分割的半胚到晚期囊胚。将这些囊胚移植到假孕受体鼠子宫内以评价他们附植后发育的能力。在体外培养中发现,囊胚期分割的胚胎比桑椹胚期分割的胚胎有较高的成活率。通过附植前胚胎细胞数量分析得知,囊胚期半胚的细胞数量大约是对照组的一半,但内细胞团细胞与整个胚胎细胞的数量比不变。虽然从半胚发育到囊胚期的胚胎附植率仅略低于对照组,但半胚形成胎儿的能力却显著低于全胚。组织学分析表明,附植后的这种低成活率现象是由于缺乏卵柱发育造成的,而此卵柱则与半胚中的内细胞团的细胞数量减少有关。移植到第3天假孕受体鼠中的半胚,附植后的发育情况明显地比移植到第4天受体中的好。     

牛-兔种间重组胚体外发育能力的研究

 以超排的青年母兔和经产母兔卵母细胞为受体细胞,以处于休眠期和非休眠期的黑毛和牛耳成纤维细胞为核供体,共获得180枚种间重组胚,采用M199+10%FBS和RD+10%FBS2种培养液进行体外培养,有112枚发育到2-细胞期(62.2%),26枚发育到桑椹胚期(14.4%),20枚发育到囊胚期(11.1%)。结果显示,供体细胞处于休眠期与否,对重组胚的卵裂率无显著影响(P<0.05),但以休眠期细胞为核供体的重组胚8-细胞～16-细胞胚的发育率及桑椹胚发育率显著高于非休眠期细胞的重组胚(P<0.05),二者在     

HA对牛卵母细胞体外成熟和早期胚胎体外发育影响的研究

在TCM-199中添加一些确定的辅助成分,探讨在无血清培养基中添加不同浓度HA对牛卵母细胞体外成熟及早期胚胎体外发育的影响。结果表明,在卵母细胞成熟培养液(TCM-199-m)中添加4.0mg/mL的HA时,卵母细胞的成熟率和卵裂率与对照组(BSA)无显著差异(P>0.05),分别为85.14%,83.57%和89.47%,85.24%,但显著高于其他各浓度组(P<0.05),表明HA在卵母细胞无血清成熟培养中可代替BSA。在受精卵体外培养液(TCM-199-c)中添加HA时,囊胚发育率与对照组(BSA)差异不显著(P>0.05),分别为27.64%和26.51%,但显著高于TCM-199-c组(P<0.05),表明HA对牛胚胎体外发育具有明显的促进作用,在无血清培养中可以代替BSA。当在TCM-199-c+HA中添加少量的BSA时,囊胚发育率(31.19%)显著高于其他各组(P<0.05),表明HA欲完全代替BSA还有不完善之处,有待进一步研究。     

不同浓度Leptin对猪卵母细胞体外成熟和早期孤雌发育的影响

[目的]系统比较了在成熟培养液中添加Leptin对猪卵母细胞体外成熟和孤雌激活胚的发育率和囊胚质量,同时比较了成熟培养液和胚胎培养液添加Leptin对孤雌激活胚发育的影响。[方法]成熟培养液中添加不同浓度Leptin对猪卵母细胞体外成熟和早期孤雌发育能力的影响及囊胚的内细胞团细胞数目,并且研究了成熟培养液和胚胎培养液单独或联合添加Leptin对猪早期孤雌胚胎发育能力的影响及囊胚的内细胞团细胞数目。[结果]成熟培养液中添加不同浓度Leptin(0,10,50,100和200 ng/ml),体外成熟44 h,卵母细胞核成熟率统计分析差异不显著(P>0.05);将核成熟卵母细胞进行化学激活,第2天胚胎卵裂率统计分析差异不显著(P>0.05),但100ng/ml组与其他组第7天的囊胚率及囊胚的总细胞数差异显著(P<0.05);成熟液添加Leptin 100 ng/ml、胚胎培养液添加Leptin 10 ng/ml与其他组第7天的囊胚率及囊胚的内细胞团细胞数差异显著(P<0.05)。[结论]Leptin对卵母细胞成熟和孤雌胚胎发育能力上有相辅相成的作用。