鸡生长激素cDNA及其5′端调控区的克隆分析

从肉用品种鸡构建的垂体文库中克隆分离了鸡生长激素cDNA,并作了核苷酸序列测定。克隆的鸡生长激素cDNA序列全长为789个碱基对,其中5′非转译区为40个碱基对,3′非转译区为101个碱基对,编码区为648个碱基对。通过序列比较分析,克隆的鸡生长激素cDNA序列与已报道的蛋用品种鸡生长激素cDNA序列的同源性为96%,与鸭生长激素序列的同源性为87%,但与火鸡生长激素序列的同源性只有52%。通过PCR技术,本研究还扩增了6个鸡品种的生长激素基因5′端调控区。尽管这些鸡品种的生产性能差异显著,但序列分析表明鸡生长激素基因5′端调控区十分保守。因而,鸡生长激素基因表达的差异可能受到内含子或3′端侧翼序列的影响。另外,鸡生长激素对多个数量性状的影响也在本文中进行了讨论。     

宁乡猪生长激素基因的克隆及其原核表达载体的构建

[目的]研究了宁乡猪生长激素基因(nxGH)的克隆及其原核表达载体的构建。[方法]根据已报道的猪生长激素基因序列设计了1对特异性引物,应用RT"PCR技术从宁乡猪脑垂体中克隆了nxGH编码区序列。[结果]扩增片段全长651 bp,共编码216个氨基酸。该序列与已报道的三元和五指山猪生长激素cDNA基因核苷酸序列同源性为99.85%。将nxGH cDNA序列定向插入pET"32a原核表达载体中,成功构建重组原核表达质粒pET"GH。[结论]为下一步制备宁乡猪生长激素抗体奠定了基础。     

水貂生长激素cDNA的克隆与序列分析

从水貂脑垂体中分离提取总RNA，经过RT—PCR分别扩增出水貂生长激素前体肽和成熟肽cDNA。PCR产物经凝胶回收纯化，克隆到栽体pGEM—T，然后转化感受态细胞DH5α。在含X—gal、IPTG的LB(Amp^ )平板上筛选阳性克隆，提取质粒作限制性酶切鉴定后，对目的片段进行测序。结果表明，RT—PCR扩增出的2个cDNA片段碱基数分别为713bp和780bp，用DNAsis2．5软件进行分析表明，此扩增序列与GenBank中发表的水貂生长激素cDNA100％相同。前体肽编码区由651bp组成，编码216个氨基酸，包括长度为29个氨基酸的信号肽；成熟肽的开放阅读框全长564bp，编码187个氨基酸，分子量约为21kDa。通过Blast比对，分析了与人、马、牛、猪、山羊、绵羊、猫、狗、大鼠和小鼠生长激素核苷酸序列的同源性。     

五指山小型猪APEX1基因cDNA的克隆及生物信息学分析

[目的]对五指山小型猪脱嘌呤嘧啶核酸内切酶cDNA进行克隆和生物信息学分析。[方法]以构建的五指山小型猪外周血白细胞cDNA文库为材料,采用菌落PCR方法,克隆得到APEX1基因全长cDNA,并运用生物信息学软件对该基因核苷酸序列及其编码蛋白的理化性质及二级结构等进行分析和预测。[结果]生物信息学分析表明,该cDNA全长1392bp,5′非翻译区长132bp,3′非翻译区长303bp,含有一个957bp的完整开放阅读框,编码318个氨基酸。该蛋白的分子量为35kD,等电点为8.05。比对分析表明,五指山小型猪APEX1基因的核酸序列及其氨基酸序列与人、小鼠、黑猩猩等哺乳动物具有较高的相似性。[结论]成功克隆了五指山小型猪A-PEX1基因cDNA,为进一步研究APEX1在动物体内的作用机制奠定了基础。     

猪TDRP1基因的电子克隆及生物信息学分析

利用生物信息学和比较基因组学方法,对猪TDRP1基因的结构、表达及功能进行分析,结果表明:(1)电子克隆获得猪TDRP1基因cDNA部分序列共776bp,包括119bp的5′UTR、561bp的编码区和96bp的3′UTR,共编码合成187个氨基酸多肽;(2)猪TDRP1基因CDS序列与人、小鼠和大鼠的同源性分别为85%、76.1%、77.1%.编码合成的猪TDRP1蛋白与人、小鼠、大鼠之间的同源性分别为82.5%、71.1%和70.1%;(3)猪TDRP1蛋白的相对分子质量为20489.8,不含信号肽,为1个可溶性蛋白,同时也是1个非分泌性蛋白,存在4个二级结构区段;(4)基于cDNA及EST数据库的检索显示,猪TDRP1基因至少在卵巢和甲状腺等组织中表达.     

龙眼子叶胚3-磷酸甘油醛脱氢酶基因的cDNA克隆及序列分析

从龙眼子叶胚中分离得到一个大量表达的表达序列标签(EST),该EST编码序列与金鱼草3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)基因的同源性为84%,利用cDNA末端快速扩增(RACE)技术成功克隆了龙眼GAPDH基因全长序列.序列分析表明,龙眼GAPDH基因的cDNA全长为1395 bp,包括一个长1008 bp、编码336个氨基酸的开放阅读框(ORF),5′端非编码区(UTR)长71 bp,3′-UTR长316 bp.龙眼GAPDH基因编码的氨基酸序列与水稻、葡萄、小果野蕉、拟南芥、银杏等GAPDH基因的氨基酸序列同源性均高达85%以上,该基因在GenBank中的登录号为FJ694011.     

牛FABGL基因cDNA的克隆与序列分析

以中国西门塔尔牛肝脏组织为材料,运用同源序列克隆技术结合RT-PCR和RACE技术,对牛FABGL基因的cDNA进行了克隆与序列分析,并对推导的FABGL蛋白结构与性质进行了初步分析。结果表明,牛FABGL基因的cDNA序列长994 bp,包括780 bp的开放阅读框、16 bp的5′非翻译区和198 bp的完整3′非翻译区,由260个氨基酸组成。该基因cDNA核苷酸编码区序列与猕猴、人、猪和小鼠FABGL基因的相似性分别为89%,89%,87%和86%。推导的氨基酸序列与猕猴、人、猪和小鼠的相似性分别为89%,87%,89%和86%。以FABGL基因cDNA编码区序列构建的分子进化树研究结果表明,牛的FABGL基因在人、猕猴、猪、鼠等物种中,与猪的亲缘关系最近。牛的FABGL蛋白的三级结构包含2个跨膜结构—Cu toff模体,分别位于11~16位氨基酸和128~131位氨基酸处。     

大白菜PHK4基因cDNA3′端序列的克隆及分析

采用3′RACEcDNA末端扩增技术,克隆出大白菜PHK4基因3′端cDNA序列。该序列长810bp,其中编码区序列546bp．编码181个氨基酸,其编码序列、氨基酸序列与拟南芥爿HK4基因的同源性分别为90％和96％．说明PHK4基因与AHK4基因编码区的同源性较高,而PHK4基因3′UTR区与AHK4基因3′UTR区的同源性为52％,远低于编码区。     

鹅催乳素受体基因3′-末端序列克隆

通过比对鸡、火鸡、鸽、猪、大鼠5种动物及人催乳素受体(PRLR),并根据它们的基因cDNA保守区设计兼并引物,先扩增了鹅催乳素受体基因(gPRLR)cDNA一段606 bp保守区序列,再以此设计基因特异性引物,利用3′-RACE技术克隆了gPRLRcDNA3′-末端序列。序列分析表明,获得的gPRLRcDNA 3′-末端长1 876 bp,含编码区后1 656 bp的编码核苷酸、终止密码子TAA和220 bp的3′-UTR。参照鸡催乳素受体基因(cPRLR),此gPRLRcDNA3′-末端序列可分成6个外显子,其长度分别为148 bp、170 bp、145 bp、100 bp、70 bp和1 243 bp,与cPRLRcDNA最后6个外显子高度同源,终止密码子位于最后1个外显子的1 021 bp处。编码区后1 653 bp编码的551个氨基酸gPRLR C-末端与鸡PRLR同源部分的同源性达到87.7%。     

猪生长激素cDNA克隆及在大肠杆菌中的表达

用逆转录－聚合酰链式反应（RT－PCR）方法，从猪脑垂体总RNA中扩增出编码猪生长激素（GH）成熟及基因序列，定向克隆至质粒pUC18，序列分析表明，克隆的猪GH cDNA长573bp，不含信号肽序列，并在该序列之前加入一起始密码子ATG。将猪GHcDNA定向克隆至原核表达载体pBV220，构建成重组GH基因表达载体pBVpGH7。SDS－PAGE和薄层扫描分析表明：经42℃诱导，pBVpGH7在大肠杆菌中可表达一分子量约2200的特异蛋白，表达量约占细胞总蛋白的20．5％。     

猪L-Myc基因的分子克隆及在细胞重编程中的应用

【目的】克隆猪L-Myc基因,并在蛋白水平表达的情况下探索其在细胞重编程中的作用,为深入研究猪L-Myc基因替代c-Myc诱导多能干细胞（induced pluripotent stem cell,iPSC）奠定基础。【方法】先通过NCBI序列比对,采用RT-PCR克隆猪L-Myc基因cDNA,生物信息学分析猪L-Myc基因与人和小鼠的同源性,构建融合表达载体pEGFP/L-Myc-C1,通过载体转染和免疫印记检测猪L-Myc基因cDNA的蛋白水平表达;再将L-Myc基因装入逆转录病毒载体中,分别使用不同的转录因子诱导猪胎儿成纤维细胞（porcine embryo fibroblast,PEF）,通过形态变化和碱性磷酸酶（AP）染色验证猪L-Myc基因在细胞重编程中的作用。【结果】①获得了1 113 bp的猪L-Myc基因cDNA,编码364个氨基酸,理论分子质量为40 kD;②生物信息学分析显示猪L-Myc基因与人和小鼠高度同源;③免疫印记检测结果说明猪L-Myc基因cDNA能够在蛋白水平表达;④细胞诱导试验和AP染色结果显示转录因子Oct4、Sox2、Klf4和L-Myc（OSKL）组合诱导的细胞阳性克隆率明显高于Oct4、Sox2和Klf4（OSK）组合的阳性克隆率。【结论】获得了猪L-Myc基因,并且该基因在蛋白水平表达且在细胞重编程过程中起到了重要的作用。     

参与紫云英共生固氮的1个上调表达结瘤素基因AsB6的分离与鉴定

基于接种华癸中慢生根瘤菌(Mesorhizobiumhuakuii)7653R的紫云英(Astragalus sinicusL.)感染根与未接种对照根在转录水平上的差异,利用抑制差减杂交技术(suppression subtractive hybridization,SSH),建立了紫云英结瘤固氮过程中的差异表达cDNA文库,共获得527个有效克隆,其中增强或特异性表达的上调文库中包含341个克隆,抑制表达的下调文库包含186个克隆。对其中的1个上调表达cDNA克隆AsB6利用RACE(rapid amplification of cDNAends)方法获得了其基因全长序列,利用BLAST在线软件和GenBank,Gen-Bank EST和Tigr Porcine EST等数据库进行同源序列比较,表明AsB6与苜蓿的β-酮酯酰合成酶及依赖于SAM(S-adenosgl methiomine,S-腺苷蛋氨酸)的羧甲基转移酶具有66%的同源性,同时利用实时荧光定量PCR研究了该基因的时空表达特征。结果显示,接种根瘤菌7653R后,在紫云英感染根和根瘤中该基因的表达量显著增强,且在接种后根瘤形成早期和固氮中晚期表达...     

五指山小型猪生长激素释放激素受体基因的cDNA克隆及序列分析

1材料与方法 1．1材料随机采集五指山猪品种耳组织样共30份,将其迅速放入液氮带回实验室,-70℃保存备用。 1．2试剂RT—PCRKit、PCR产物纯化回收试剂盒、重组质粒抽提试剂盒,均购自天根生物工程有限公司;SalⅠ、BamHⅠ、pMD18-TVector试剂盒、Ecoli DH5α均购自TaKaRa公司。     

猪IL-18 mRNA定量RT-PCR检测方法的建立

根据GenBank中猪白介素(IL)-18基因序列,设计1对引物,用RT-PCR技术从猪肺泡巨噬细胞总RNA中扩增出其411 bp cDNA片段,将其与pGEM-T Easy载体连接,经转化、筛选阳性克隆、酶切与测序鉴定后,构建出含猪IL-18 cDNA部分片段的重组质粒。后用反向PCR技术构建出与扩增411 bp片段共用同1对引物,但缺失174 bp的竞争重组质粒。通过上述2种质粒的竞争PCR方法,建立了猪IL-18 mRNA的标准竞争曲线,得到其直线回归方程^y=0.583 2x-2.903 4(R2=0.9898)。     

猪白细胞介素-8荧光定量PCR检测方法的建立

用RT-PCR技术从猪肺泡巨噬细胞总RNA中扩增出猪白介素（IL）-8基因的278 bp cDNA片段,并克隆到pGEM-T Easy载体中,构建成含有猪IL-8 cDNA片段的重组质粒。通过质粒的Real-time PCR方法,建立猪IL-8 cD-NA的Real-time PCR标准曲线。该方法特异性强、灵敏度高、重复性强,可用于猪IL-8 mRNA含量的定量检测。     

猪脂肪组织酵母双杂交文库的构建及质量鉴定

为了研究猪脂肪细胞分化的蛋白质之间的相互作用,采用LR重组反应的方法,构建猪脂肪组织酵母双杂交文库。结果显示,酵母双杂交文库的库容量为5.28×106CFU。随机挑取的24个克隆均带有插入片段,重组率100%,片段大小多数为1~2 kb,表明构建的文库质量较高。     

香猪ATGL基因的克隆、验证及其在不同猪品种的编码区序列比较

ATGL基因是近年来发现的一个新基因,其表达产物脂肪甘油三酯脂肪酶(ATGL)被证明是催化三酰基甘油水解第一步反应的限速酶.本研究采用电子克隆和RT-PCR的方法克隆并验证了贵州小香猪ATGL基因的cDNA序列.克隆的香猪ATGL基因其cDNA序列全长2 102 bp,其中编码区1 461 bp,编码486个氨基酸.通...     

福美双诱发肉鸡胫骨软骨发育不良早期生长板消减cDNA文库的构建

 【目的】为应用cDNA芯片技术筛选肉鸡胫骨软骨发育不良(TD)时序性差异表达基因,本研究构建了早期生长板消减 cDNA文库。【方法】将7日龄AV肉鸡随机分为两组,对照组(control,C)饲以基础日粮,试验组(thiram diet-fed,T)饲以基础日粮添加福美双100 mg?kg-1,2 d后继续饲以基础日粮,诱发肉鸡TD。应用抑制消减杂交技术(SSH)构建正反向消减cDNA文库,用PCR验证两个文库中克隆的插入片段,随机抽取100个阳性克隆测序,对所测序列同源性分析和功能预测。【结果】从两个文库共获得2 227个有效阳性克隆,插入片段大小主要分布在200—1 000bp之间;所测序列中有97条ESTs与GenBank中的鸡基因序列同源性达到99%,且非冗余度达到68.7%;此外,有3条ESTs未找到同源序列。这些基因具有构成细胞外基质,参与软骨内骨化和骨的重构,调节骨发育,行使信号转导、血管发生,参与电子传递及能量代谢等功能。【结论】成功构建了消减 cDNA文库,将为进一步点制cDNA芯片,筛选不同阶段的差异表达基因奠定了基础,也为肉鸡TD机理研究提供新线索。     

三元杂交猪IL-18全基因的序列测定及分析(英文)

[Objective] To clone the porcine interleukin-18(IL-18) cDNA and explore the immunological effectiveness of porcine IL-18 as an adjuvant of genetic vaccine. [Method] The spleen lymphocytes were isolated from Henan three-way cross-breeding pigs. According to the porcine IL-18 gene in GenBank, a pair of specific primers was designed. The full length cDNA of porcine IL-18 was amplified by RT-PCR. Subsequently, porcine IL-18 cDNA was cloned into pGEM-T vector and sequenced and analyzed. [Result] The porcine IL-18 gene demonstrated an open reading frame of 579 bp encoding an inactive precursor protein with 192 amino acids. The precursor protein had no typical hydrophobic signal peptide and cleaved by interleukin-1 beta (IL-1β) converting enzyme (ICE) in caspase-1 splice site; the porcine mature protein had biological activity. After comparing with other porcine IL-18 genes, the nucleotide sequence homology was over 96% and the deduced amino acid homology was more than 98%. [Conclusion] A full length procine IL-18 gene was gained. It lays the foundation for porcine IL-18 as an adjuvant of genetic vaccine.     

广西水牛ghrelin cDNA的克隆及序列分析

[目的]克隆广西水牛ghrelin的cDNA并对其进行序列分析。[方法]以广西沼泽型水牛的真胃底组织总RNA为模板,用特异性引物扩增ghrelin的cDNA。扩增产物经凝胶回收纯化后与pMD 18-T连接并转化大肠杆菌DH5d,转化产物经PCR和双酶切鉴定后筛选出阳性克隆,阳性克隆经5×1ml LB液体培养基培养鉴定后测序。[结果]成功获得了广西水牛ghrelin的cDNA,该片段长339bp,编码113个氨基酸。BLAST分析结果表明,该片段与黄牛前原ghrelin基因仅有6个碱基的差异,同源性为98．2％;而两者ghrelin均由27个氨基酸组成,序列同源性为1013％。[结论]为进一步研究ghrelin基因的生物学功能提了供理论基础。