矮牵牛遗传转化查尔酮合酶基因的研究

本文建立了矮牵牛的遗传转化体系,并将查尔酮合酶基因转入矮牵牛。经PCR检测,得到34个转查尔酮合酶基因株系。探讨了查尔酮合酶基因对花色及育性的影响。     

栾树查尔酮合酶基因克隆与表达分析

  目的  查尔酮合酶(CHS)是苯丙烷途径的限速酶之一,在植物次生代谢物的合成中起着重要的作用。本研究通过对栾树CHS 基因进行克隆与生物信息学分析,以及分析栾树 CHS 基因表达与类黄酮合成的关系,期望为后续深入研究栾树类黄酮代谢途径其他相关基因、 CHS 基因家族以及锦叶栾呈色机制提供参考。  方法  以栾树叶片为材料,采用RT-PCR技术进行查尔酮合酶基因的克隆并进行生物信息学分析;通过实时定量PCR（qRT-PCR）技术分析 CHS 基因在栾树不同组织以及在5月、7月、9月的栾树和锦叶栾叶片中的表达模式;通过代谢组测定筛选出栾树与锦叶栾的类黄酮差异代谢物。  结果  克隆获得两个 CHS 基因的全长DNA,命名为 KpCHS1 和 KpCHS2 。其中 KpCHS1 序列全长为2 492 bp,ORF为1 173 bp,编码含有390个氨基酸的蛋白质; KpCHS2 序列全长为1 321 bp,ORF为1 182 bp,编码含有393个氨基酸的蛋白质;进一步的序列比对和系统发育分析表明,KpCHS1和KpCHS2蛋白高度同源,具有四个CHS特异性保守基序和一个查尔酮合成酶活性位点; KpCHS1 和 KpCHS2 在栾树根、茎、叶、种子中都普遍表达,其中, KpCHS2 在种子中的表达量最高, KpCHS1 在叶片中表达量高,而在根和茎中,两个基因的表达量相似且较低;表达模式分析显示,在栾树和锦叶栾叶片中,随着月份增加, KpCHS1 的表达量呈现出下降的趋势,而 KpCHS2 表达量未表现出明显的规律。在7月份的叶片样本中, KpCHS1 基因在锦叶栾中表达量显著高于栾树;代谢组结果显示,山奈酚-7-O-葡萄糖苷、7-羟基香豆素、槲皮素-3β-D-葡萄糖苷、以及类黄酮生物合成途径重要的中间产物山萘酚、柚皮苷等黄酮类物质在锦叶栾叶中含量显著升高。  结论   KpCHS1和KpCHS2属于栾树查尔酮合酶家族并且高度同源,但在系统进化树上分布在很远分支上,推测这两个蛋白在氨基酸活性催化功能上可能存在较大差异;KpCHS1和KpCHS2在根、茎、叶、种子中均有表达,且在叶和种子中较高。研究结果初步显示,KpCHS1基因与栾树类黄酮的生物合成高度相关。      

玫瑰查尔酮合酶CHS基因的克隆及生物信息学分析

本研究旨在克隆玫瑰查尔酮合酶CHS基因并对其进行生物信息学分析,以期为利用基因工程技术改变玫瑰花色、培育玫瑰新品种奠定良好基础。以玫瑰品种‘唐红’(Rosa rugosa‘Tanghong’)为试材,采用RT-PCR和RACE方法从花瓣中获得了玫瑰查尔酮合酶(chalcone synthase,CHS)基因的c DNA全长。经生物信息学分析,该基因全长1416 bp,开放阅读框1167 bp,编码389个氨基酸,其蛋白的分子式为C1899H3043N505O562S18,相对分子质量为42.518 k Da,等电点为6.12。该蛋白不稳定系数低于40,为稳定性蛋白,无信号肽和剪切位点存在。其蛋白质二级结构主要由42.16%的α螺旋、29.05%的随机卷曲、10.54%的β转角和18.25%的延伸链组成。系统进化分析表明,玫瑰CHS基因与同科植物月季、草莓亲缘关系最近,与其他科及同科其他属植物的亲缘关系较远。本研究首次克隆了玫瑰CHS基因,获得了其生物信息学相关信息,探明了CHS基因在类黄酮生物合成过程中的重要作用,为改良玫瑰花色提供了理论依据。     

选择与适应:兰科植物查尔酮合酶基因家族成员的分子进化和功能趋异

回顾了近十五年来国内外对各科植物查尔酮合酶基因CHS分子进化的研究成果,并结合作者近年来对兰科植物CHS基因分子进化的研究结果,对兰科植物CHS基因分子进化和功能趋异的机制展开综述,揭示了植物中普遍存在的CHS基因分子进化以及伴随的功能趋异的现象和机制,初步探讨了CHS基因分子进化与生物进化和自然选择的关系。     

红树植物秋茄查尔酮合酶基因克隆及其在盐胁迫下的表达分析

以秋茄(Kandelia candel)叶片为试验材料,采用RT-PCR的方法获得秋茄查尔酮合酶(chalcone synthase,CHS)基因的cDNA序列,命名为KcCHS,GenBank登录号为KX673194.1.序列分析结果表明,KcCHS基因的cDNA序列长度为1170bp,编码389个氨基酸,属于CHS超家族.序列比对结果显示,秋茄与其他物种的CHS基因核苷酸序列具有较高的相似性,平均达到80%以上.系统进化分析显示,KcCHS基因与余甘子CHS基因亲缘关系最近.实时荧光定量PCR分析表明,秋茄叶片KcCHS基因的转录水平随着NaCl浓度的升高而上升.此外,随着NaCl浓度的升高,黄酮类化合物的含量显著增加,羟自由基清除率也明显提高.     

类黄酮物质及查尔酮合酶在油菜性状改良中的作用

类黄酮化合物(Flavonoids)是一类重要的植物次生代谢产物,查尔酮合酶(CHS)是类黄酮物质形成步骤中的一个关键酶,影响植物的多种重要性状.油菜是重要的经济作物,许多植物的CHS基因已经被克隆并进行了基因工程的研究,但CHS与油菜性状发育的关系和分子机理的研究还十分欠缺.本文简略综述了类黄酮物质的结构、分布、功能、CHS基因在类黄酮途径中的重要作用、植物界CHS基因克隆和基因工程的研究进展,重点论述了CHS在油菜的种皮色泽、花瓣颜色、异花传粉、花粉育性、抗紫外线能力、茎表紫色、抗病能力等性状形成中可能的重要作用,并提出了通过对CHS基因的表达调控来改良这些性状的可能性.     

三角梅CHS基因的克隆及表达分析

查尔酮合酶（chalcone synthase,CHS）为花青素苷合成途径的关键酶,是观赏植物花色改良分子育种的研究热点。随着生物技术的发展转录组测序技术成为快速克隆新基因的有效手段,以''新加坡大白''三角梅苞片转录组数据库为基础,筛选克隆CHS基因,利用生物信息学方法预测分析其蛋白的结构与功能,通过实时荧光定量PCR技术检测该基因在不同花色三角梅中的表达模式。结果表明:获得的CHS基因cDNA全长1 176 bp（GenBank ID：MT302539）,编码一个43.96 ku的蛋白,定位于细胞质中,含有CHS特征基序及活性位点,三级结构预测显示为二聚体蛋白,系统进化树分析结果显示与同为中央种子目的植物亲缘关系较近,符合系统进化关系。qRT-PCR显示该基因在黄色叶片中的表达量是红色叶片的24倍,表明黄色更适用于花青素途径的研究。研究结果为三角梅花色改良基因转化受体的筛选提供参考。     

辣椒CHS基因表达的定量分析及与雄性不育的相关性

为了揭示辣椒胞质雄性不育(CMS)机制，以辣椒胞质雄性不育系9704A和其相应保持系9704B为材料，对其花蕾转录组进行了Solexa测序，经过生物信息学分析鉴别出1个花药特异性表达的查尔酮合酶基因(CHS)，该基因在保持系9704B中的表达水平为其对应不育系9704A的16倍；克隆后的序列比对分析表明，该基因属于CHS基因家族，与菸草花药特异表达的同源基因CHSLK的同源性达90%；用实时荧光定量RT–PCR对9704A和9704B的根、茎、叶中CHS基因的表达进行了定量分析，结果表明该基因在2种材料的茎中几乎不表达，在9704B的根和叶中表达量也极低，证实了在正常情况下该基因只在辣椒花药中有较高水平的表达；对不育系的定量PCR结果表明，CHS基因在9704A的根和叶中有异常的较高水平表达，结合其在花药中的低表达，推测辣椒不育系中CHS的异常表达可能与其CMS性状相关。     

虎杖PcPKS1基因RNAi载体的构建

虎杖(Polygonum cuspidatum Sieb.et Zucc.)是富含芳香族聚酮化合物的药用植物,Ⅲ型聚酮合酶(Polyketide synthase,PKS)对芳香族聚酮化合物的合成起重要作用。为了研究虎杖Ⅲ型聚酮合酶基因Pc PKS1的功能,分别选取Pc PKS1基因的编码区保守序列(574 bp)和3′端非编码区特异序列(209 bp)作为干扰片段。将选定的干扰片段,分别以正向和反向插入到p YLRNAi载体中GUS基因内含子的两侧,以形成hp RNA表达盒,成功构建了以组成型Ca MV35S为启动子,以潮霉素抗性为筛选标记的RNA干扰表达载体p YLRNAi-CDS和p YLRNAi-UTR,并将载体导入农杆菌LBA4404中。     

苦荞愈伤遗传转化体系的优化及用于FtCHS1的过表达分析

【目的】建立和优化苦荞愈伤组织遗传转化体系,为苦荞基因功能验证及分子育种提供研究工具。【方法】以苦荞品种“西荞二号”为材料,对苦荞愈伤遗传转化条件进行优化,包括苦荞外植体类型、诱导愈伤的激素比例、继代培养基的激素比例及农杆菌类型。利用苦荞类黄酮生物合成关键酶基因FtCHS1的过表达验证优化后的遗传转化体系。通过PCR筛选和荧光观察鉴定阳性株系,采用紫外分光光度法和高效液相色谱法（high performance liquid,HPLC）测定花青素及黄酮醇支路代谢物含量,使用实时荧光定量PCR分析类黄酮合成相关基因的表达,比较FtCHS1过表达愈伤组织与对照组的差异。【结果】苦荞诱导愈伤组织的最佳外植体为下胚轴,其最适诱导培养基为MS+0.8 mg·L^-1 6-BA+3.5 mg·L^-1 2,4-D,诱导率达72%;最优继代培养基为MS+3 mg·L^-1 6-BA+1 mg·L^-1 KT,愈伤组织增殖率与增殖系数分别为98%和1.09;转化过程中的最佳农杆菌是GV3101,转化效率达31.3%;FtCHS1过表达愈伤组织中,花青素、芦丁和杨梅素的含量显著高于对照（P<0.05）,山奈酚和槲皮素的含量极显著高于对照组（P<0.01）;外源FtCHS1的过表达对转基因愈伤组织中5个内源同源基因FtCHSs的表达水平没有影响（P>0.05）,而FtCHI、FtF3H、FtFLS1、FtFLS2、FtFLS3和FtDFR1等黄酮合成途径关键酶基因均上调表达（P<0.05）。此外,特异性正调控黄酮醇合成的转录因子基因FtMYB5和FtMYB6上调表达,而花青素合成抑制子基因FtMYB8的表达降低（P<0.05）。【结论】建立了苦荞愈伤组织遗传转化体系,过表达FtCHS1的苦荞愈伤组织通过上调黄酮合成相关基因的表达增加类黄酮物质的积累。     

黄皮 CHS 基因的克隆及其表达

为研究黄皮果实中查尔酮合成酶（CHS）的功能,以黄皮果实的 cDNA 和 DNA 为模板,采用同源克隆的方法克隆得 CHS 基因后进行序列比对和聚类分析。结果表明：该基因的开放阅读框为1032 bp,编码343个氨基酸。基因组扩增得到了1100 bp 的片段,不含内含子。该基因主要在果实中表达,而叶片中表达较其他组织低,初步推断该基因可能与果实和花朵中的黄酮类物质合成有密切的关系。该基因编码的蛋白与柑桔的 CHS 蛋白序列亲缘关系较近,可与柑桔、葡萄、芍药、牡丹、荔枝、龙眼等聚为一类。     

‘变叶海棠’幼叶cDNA文库构建及CHS基因克隆

为了理解苹果类黄酮代谢的分子机制,以富含类黄酮‘变叶海棠’苹果幼叶为材料,利用SMART法构建一个苹果叶片全长cDNA文库。初级文库滴度为2.28×104 cfu/mL,库容为3.30×106个独立克隆,重组率100%,插入片段平均长度大于1.5kb。并对随机取16个重组子进行测序,经分析完整全长cDNA为7条。并从测序中获得一个查尔酮合酶（Chalcone sythase,CHS）基因,该基因cDNA全长1548bp,有一个1 170bp的开放阅读框,编码含389个氨基酸残基的蛋白,蛋白的理论分子质量为42.44KDa,等电点5.65,该基因与已知苹果CHS基因高度同源。并构建该基因植物表达载体,用冻融法将其导入根癌农杆菌EHA105。     

巨峰葡萄查尔酮合成酶基因4的克隆及表达特性的RT-PCR分析

克隆了葡萄查尔酮合成酶基因4(CHS4),并采用半定量RT-PCR技术,以actin为内参,分析了CHS4在巨峰葡萄果实发育阶段不同组织的表达。对CHS4的序列分析表明:CHS4含有1个内含子,2个外显子;与CHS1、CHS2、CHS3在核苷酸水平的同源性分别为99.3%、92.6%和76.0%。半定量RT-PCR分析结果表明:CHS4在果皮、果肉、种子、叶片和根系中均有表达,在花后30d的果皮中表达强烈,随后迅速降低,到花后70d表达又增强;CHS4在花后30～45d的果肉中表达强烈,随后迅速降低;在花后45d的种子中也表达强烈,随果实发育,其表达逐渐下降。高温处理抑制CHS4在巨峰葡萄幼叶中的表达,但诱导CHS4在幼根的表达。     

苦荞中查尔酮合成酶全长基因的克隆及序列分析(英文)

[目的]该研究旨在克隆苦荞中查尔酮合成酶全长基因。[方法]选用乌克兰伊琳娜苦荞为试验材料,以从叶片中提取的RNA为模板,应用RACE技术结合CODEHOP引物设计方法克隆苦荞中查尔酮合成酶cDNA序列,通过电子合并获得其全长。设计基因全长特异性引物,以DNA为模板进行PCR扩增出基因序列。应用Clustalxl.81和MEGA4软件进行序列分析和进化树的建立;核酸和蛋白质序列同源性分析应用NCBI的Blastn和Blastp完成。[结果]生物信息学分析表明,该基因全长1906bp,具有一个463bp的内含子序列,编码区长度为1188bp,编码395个氨基酸。Blastn序列比对发现该试验所获得的CHS基因序列与相近物种Rheum palmatum(登录号:DQ205352.1)的CHS基因同源性达86%。[结论]该研究为阐明苦荞生物类黄酮合成的分子基础,探索提高苦荞生物类黄酮含量的有效途径奠定基础。     

苦荞查尔酮合成酶多克隆抗体制备及组织表达分析

苦荞查尔酮合成酶（FtCHS）是黄酮类化合物合成过程中的限速酶之一,在苦荞黄酮类次生代谢物合成中起到重要作用。以苦荞种子灌浆期cDNA为模板,采用RT-PCR方法克隆获得FtCHS基因,通过生物信息学分析确定FtCHS的截短抗原基因序列（TrCHS）。再通过原核表达、亲和层析等方法制备并纯化TrCHS抗原,以纯化的抗原免疫大白兔获得TrCHS的多克隆抗体,利用半定量RT-PCR、Western blotting方法分析苦荞不同器官FtCHS的表达情况。结果表明,成功克隆FtCHS基因开放阅读框（ORF）大小为 1 182 bp,共编码393个氨基酸,通过原核表达获得TrCHS抗原的分子质量约34.71 ku,所制备的多克隆抗体具有较高的特异性, FtCHS基因在苦荞叶子、种子的表达量明显最高。     

光照对黄芩种子萌发及代谢的影响(英文)

[目的]了解光照强度在黄芩Scutellaria baicalensis Georgi种子萌发过程中的初生与次生代谢规律。[方法]光合色素、可溶性糖、苯丙氨酸解氨酶(PAL)、肉桂酸-4-羟化酶和查尔酮合成酶(CHS)活性测定采用紫外分光光度法。次生代谢物质含量测定采用高效液相色谱法。[结果]黄芩种子在萌发过程中对光照强度不敏感,黄芩种苗的生长对光照强度是非常敏感的,光合色素、可溶性糖、苯丙氨酸解氨酶(PAL)、肉桂酸-4-羟化酶和查尔酮合成酶(CHS)活性均随着光照强度增强而增加,其次生代谢物质也呈现出相同的变化趋势。[结论]光照强度促进了光合色素的形成,进而促进了初生代谢物质、关键酶活性和次生代谢物质的合成,因此我们可以通过调节光照强度来提高黄芩药材的质量。     

采后硅酸钠处理及损伤接种对厚皮甜瓜CHS基因的诱导表达

以厚皮甜瓜品种"银帝"为试材,根据黄瓜查儿酮合成酶(CHS)基因设计引物,运用半定量RT-PCR技术,研究了采后100mmol·L-1硅酸钠浸泡处理对甜瓜果实CHS基因表达的影响.结果表明:PCR扩增所得片段(494bp)与黄瓜CHS基因同源,相似性为94%,可用于半定量RT-PCR分析;CHS基因在处理和对照中的表达丰度极低,无法检测;损伤接种T.roseum后第4d,CHS基因大量表达,且硅酸钠处理+损伤接种与对照+损伤接种差异达到最大,前者高出后者12%.     

独一味基因表达SYBR Green I 荧光定量 PCR检测方法的建立

为了建立一种检测独一味mRNA 表达水平的SYBR Green I 荧光定量Real-Time PCR 方法。根据独一 味查尔酮合成酶(LrCHS）和苯丙氨酸解氨酶(LrPAL）基因序列设计特异性引物,运用Real-Time RT-PCR 方法建立 独一味基因的荧光定量标准曲线,进一步研究独一味CHS 和PAL 基因在不同组织中的表达。结果显示,扩增曲线在 1伊105耀1伊1011 copies/滋L 范围内有很好的线性关系,扩增相关系数在0.995 以上。熔解曲线分析表明,产物为特异单 峰,无引物二聚体,具有较高的特异性和灵敏度。独一味CHS 基因在不同组织中表达量顺序为花>叶>叶柄>根>茎, PAL 基因表达量顺序为叶柄>叶>花>根>茎。建立的检测方法能够成功用于独一味CHS 和PAL 基因表达的检测,为 研究独一味在mRNA 水平的定量分析提供技术平台。