脂肪酶水解菜籽油脚料工艺条件的优化

[目的]优化脂肪酶水解菜籽油脚料的工艺,提高菜籽油脚料水解率。[方法]以菜籽油脚料为原料,选用黑曲霉脂肪酶水解菜籽油脚料,通过单因素试验、Box—Benhnken中心组合设计和响应面法对该脂肪酶水解油脂的工艺条件进行优化分析。[结果]单因素试验得出,黑曲霉脂肪酶水解菜籽油脚料的最适酶添加量为200u／ml,底物浓度75mg／ml,酶解pH7．0,酶解温度40℃,酶解时间45min以及摇床转数150r／min,此时菜籽油脚料水解率为16．4％。利用Box—Benhnken中心组合设计和响应面法确定了最优工艺条件是：酶添加量245U／ml,底物浓度为75mg／ml,酶解pH7．0,酶解温度是41℃,优化后的菜籽油脚料水解率达（26．92±0．86）％。[结论]研究可为菜籽油脚料的进一步开发利用提供参考依据。     

果胶裂解酶、木聚糖酶及果胶裂解酶、木聚糖酶基因在毕赤酵母中的表达

运用RT-PCR技术,从绿色木霉(AS3.3711)mRNA中扩增出木聚糖酶基因xyn2,并与质粒pPIC9K相连,构建了表达载体pPIC9K-xyn2,转化毕赤酵母GS115,并且将pPIC9K-xyn2和pPIC9K-PelC(果胶裂解酶)同时转化毕赤酵母GS115,通过组氨酸营养缺陷型筛选,G418高拷贝菌株筛选,以及摇瓶诱导表达筛选,分别得到一株高表达木聚糖酶毕赤酵母菌株X5和一株同时高表达木聚糖酶和果胶裂解酶毕赤酵母菌株PX6。同时,将一株高表达果胶裂解酶毕赤酵母菌株P2保存。重组酶酶学性质分析表明,P2和PX6分泌果胶裂解酶,X5和PX6分泌木聚糖酶最适温度均为50℃;P2分泌果胶裂解酶最适pH5.4,最大酶活为14.2U/mL;X5分泌木聚糖酶最适pH6.0,最大酶活为5.8U/mL;PX6分泌果胶裂解酶最适pH5.4,最大酶活为12.6U/mL,分泌木聚糖酶最适pH6.0,最大酶活为4.2U/mL。     

黑曲霉糖化酶基因的克隆及其在毕赤酵母X33中的表达

[目的]以毕赤酵母（Pichia pastoris）X33为宿主菌高效表达黑曲霉（Aspergillus niger）糖化酶,为进一步扩大糖化酶在工业上的应用奠定基础。[方法]利用RT-PCR技术,提取黑曲霉总RNA进行反转录,以得到的cDNA为模板,根据NCBI数据库中A.nigerCBS513.88糖化酶的cDNA序列（glaA）设计引物,通过PCR扩增得到去除天然信号肽的糖化酶成熟肽编码基因glaAm,并将其克隆到pUC19载体中,序列分析表明,glaAm的开放阅读框由1 879个核苷酸组成,编码625个氨基酸。以此片段构建了pFLDα-glaAm重组表达载体,经NsiI线性化后,电击转化毕赤酵母X-33。摇瓶培养中通过添加终浓度为0.5%的甲醇诱导糖化酶的分泌。[结果]SDS-PAGE和Starch-PAGE显示,糖化酶得到正确的分泌表达,且具有较高的生物活性,发酵上清液中酶活最高达到380.78 U/ml（发酵液）。重组糖化酶的最适反应温度和最适pH分别为6065℃和4.0,在pH2.55.5范围内均保持90%以上的酶活力。该酶具有较高的热稳定性,pH4.0条件下,该酶在50℃下稳定;60℃处理60 min,仍能保持90%以上的酶活力;65℃下的半衰期约为44 min。[结论]黑曲霉糖化酶基因在毕赤酵母X33中得到了异源高效表达。     

响应面法优化重组毕赤酵母菌表达β-甘露聚糖酶的诱导条件

[目的]对重组毕赤酵母菌表达β-甘露聚糖酶的诱导条件进行优化。[方法]以重组毕赤酵母GS115为研究对象,通过单因素试验确定最佳产酶条件,并采用响应面试验确定3个因素的最佳水平。[结果]最佳产酶条件为:培养温度28℃,培养pH 6.5,摇床转速210 r/min,培养基装液量100 ml。响应面试验确定3个因素即装液量、甲醇添加量和pH最佳值分别为103.18 ml、1.77%和6.69;在此条件下,β-甘露聚糖酶的活力最大值为4 917.5 U/ml。[结论]验证试验证明模型预测值准确、可靠,为重组毕赤酵母菌的合理开发利用提供了依据。     

烟曲霉植酸酶基因的克隆及在毕赤酵母的高效表达

根据文献报道的烟曲霉植酸酶序列，设计引物以烟曲霉CCTCCAF93044的总DNA为模板进行梯度PCR，扩增出了1条约1．4kh的带，将该片段进行DNA序列测定，其序列与已报道的烟曲霉植酸酶序列完全一致，但只编码完整的成熟植酸酶序列。将该片段克隆到毕赤酵母分泌型表达载体pPIC9K上，获得表达质粒pHBM108。该质粒转化毕赤酵母KM71所得重组子经PCR验证后进行诱导表达，其中一重组子经144h诱导，植酸酶表达量至少为1．25mg／ml，比同类报道的表达量高出60％以上，以植酸钠为底物测得酶活为11．17U／ml。     

毕赤酵母产人源丁酰胆碱酯酶的发酵条件优化

测定不同条件下重组毕赤酵母的蛋白表达量及酶活力,优选毕赤酵母分泌表达人源丁酰胆碱酯酶的发酵条件。在单因素试验的基础上,采用响应面法优化表达条件,确定了毕赤酵母分泌表达人源丁酰胆碱酯酶的最佳发酵条件:发酵时间4.8d,甲醇浓度13.90%,甘油浓度2.1%。使用最佳发酵条件对毕赤酵母进行培养,最终得到的人源丁酰胆碱酯酶的表达量为368.2mg/L,表达量提高了27%。     

重组毕赤酵母摇瓶发酵产木聚糖酶条件优化

[目的]在摇瓶发酵条件下,研究甲醇诱导毕赤酵母工程菌K3产木聚糖酶表达规律。[方法]以重组木聚糖酶酶活为评价指标,采用单因素试验和L9（34）正交试验考察摇瓶发酵条件下pH值、接种时间、诱导剂浓度、诱导时间对酶活的影响。[结果]各因素影响程度依次为：pH值〉接种时间〉诱导时间〉甲醇浓度,最优表达条件为：pH值5.3,接种时间19h,甲醇诱导浓度1.25%,诱导时间192h,在此条件下菌株产酶酶活可达589.16IU/ml。[结论]该研究为木聚糖酶的工业化生产和应用提供依据。     

密码子优化烟曲霉壳聚糖内切酶基因在毕赤酵母中的高效表达

[目的]烟曲霉(Aspergillus fumigatus)壳聚糖内切酶基因(Chitosanase,EC.3.2.1.132)(csn)的高效表达研究。[方法]根据毕赤酵母密码子的偏爱性对壳聚糖内切酶的基因进行了优化,利用连续延伸PCR方法扩增全长csn基因,构建重组质粒pPIC9k-csn,将重组质粒pPIC9k-csn线性化后转化毕赤酵母GS115,分析重组蛋白的表达,测定其酶活性,并对其酶解产物成分进行分析。[结果]实现了密码子优化后的壳聚糖内切酶的高效表达,重组菌株比野生菌株所产的壳聚糖内切酶活性提高了近20倍。[结论]该研究成功实现了烟曲霉壳聚糖内切酶基因在毕赤酵母中的高效表达,为工业化大规模生产壳聚糖酶奠定了基础。     

黑曲霉葡萄糖氧化酶基因改造及其在毕赤酵母中的表达

为构建并筛选高效表达的葡萄糖氧化酶基因毕赤酵母工程菌株,采用PCR法从黑曲霉基因组中获得葡萄糖氧化酶全长基因(GOD),采用定点突变法和重叠PCR法获得GOD~(mut)基因,将其插入到pPICZαA中,获得重组质粒pPIC-GOD~(mut),经Pme I线性化后,用电击法转化毕赤酵母菌株X33,经大量筛选,获得1株高效分泌表达的工程菌株X33-pPIC-GOD~(mut),在此基础上,去除GOD基因的信号肽,用同样的试验方法构建并筛选高效分泌表达的工程菌株X33-pPIC-GODnew,结果表明:X33-pPIC-GOD~(mut)的产酶水平为460. 3 U/mL,X33-pPIC-GODnew的产酶水平为714. 9 U/mL,是前者的1. 52倍,该酶的最适作用温度和最适作用pH值分别为40℃和5. 0,成功获得1株高效稳定表达的葡萄糖氧化酶基因毕赤酵母工程菌株。     

毕赤酵母分泌表达SAMS及表达产物活性分析

[目的]利用毕赤酵母分泌表达S-腺苷甲硫氨酸合成酶（SAMS）。[方法]以酿酒酵母（Saccharomyce cerevisiae）基因组DNA为模板,通过PCR扩增出S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因2（sam2）,构建重组毕赤酵母（Pichia pastoris）表达载体pPIC9Ks-am2,转化毕赤酵母GS115,以甲醇诱导表达分泌蛋白SAM合成酶,并用HPLC测定重组蛋白的酶活力。[结果]经SDS-PAGE鉴定重组蛋白分子量约50kD,比理论值42.5 kD稍大,可能是分泌过程中糖基化等加工造成。体外酶促反应结果显示,伴随甲醇诱导及初步纯化过程的进行,蛋白活力逐步提高,纯化后比活力为61.48 U/mg。[结论]该研究首次实现了SAM合成酶的胞外表达,为开发和建立体外酶促法生产SAM工艺奠定了基础。     

耐酸性α-淀粉酶产生菌的发酵条件优化(摘要)(英文)

[目的]优化耐酸性α-淀粉酶产生菌的发酵条件。[方法]在筛选出的耐酸性α-淀粉酶产生菌的基础上,对其培养基C、N含量、接种龄、接种量、初始pH、摇瓶转速及温度等发酵条件进行优化。[结果]耐酸性α-淀粉酶产生菌最佳发酵条件为接种龄14h,接种量8%,初始pH值5.5,发酵温度35℃,转速150r/min,接种菌液量25ml,培养基中C、N的含量分别为1.0%、0.5%。[结论]在优化条件下,酶活力达到31.4U/ml,比未优化时提高了65.3%。     

淡紫拟青霉产几丁质酶发酵条件的优化

[目的]优化淡紫拟青霉产几丁质酶的发酵条件。[方法]通过单图素试验和正交试验研究了淡紫拟青霉菌产几丁质酶的最适发酵条件。[结果]淡紫拟青霉菌在装液量80ml／250ml、接种量12％、初始pH6．0,培养潺度28℃及180r/min的条件下培养4d,发酵液中的几丁质酶活性达到最高,为O．115U／ml.[结论]为几丁质酶的进一步研究开发提供了理论依据。     

响应面法优化CZA 1202产低温过氧化氢酶发酵条件

[目的]利用响应面法优化液化沙雷氏菌(Serratia liquefaciens)CZA 1202产低温过氧化氢酶的发酵条件。[方法]在发酵条件单因素试验的基础上通过响应面法优化液化沙雷氏菌CZA 1202产过氧化氢酶的发酵条件。[结果]最佳发酵条件为:温度25℃,pH 8.0,转速190 r/min,种龄36 h,接种量10%,装液量100 ml(容量250 ml),在此条件下,最终低温过氧化氢酶酶活达288.96 U/ml,与优化前相比提高了10%,且与模型预测值290.15 U/ml基本吻合。[结论]该研究所建模型合适有效,为低温过氧化氢酶的规模化生产和应用提供了一定的理论基础。     

黑曲霉液体发酵产α-半乳糖苷酶发酵条件优化

[目的]优化黑曲霉液体发酵产α-半乳糖苷酶的发酵条件。[方法]采用单因素试验和正交试验相结合的方法优化了黑曲霉液体发酵产α-半乳糖苷酶的发酵条件。[结果]单因素试验结果表明,以蔗糖为碳源的黑曲霉生长最好,所产酶的活力最高,最佳碳源浓度为15g/L;蛋白胨浓度为15g/L时黑曲霉干重最大,蛋白胨浓度为10g／L时所产酶的活力最高;pH值为5时黑曲霉的生物量最大,pH值为4时所产酶的活力最高;培养温度为30℃时,所产酶的活力最高。最佳培养基组成为葡萄糖20g／L＋蛋白胨5g/L＋MgSO4 0．05g/L＋KC10．5g/L＋K,HPO4 1g/L＋FeSO4 0．5g/L。当pH值为5,发酵温度为25℃,孢子接种量为10^6cfu/ml,发酵时间为96h时,培养基上黑曲霉产α-半乳糖苷酶的活力最高,达到（3．250±0．035）U／ml。[结论]该试验为仪一半乳糖苷酶的工业化生产提供了参考依据。     

枯草杆菌重组水蛭素(HV3)的发酵工艺研究

［目的］确定芽孢杆菌发酵生产水蛭素的最佳工艺条件。［方法］以枯草芽孢杆菌为供试菌种,研究菌种活化时间、接种量、培养基装量、温度、初始pH值、碳源、氮源等对发酵的影响,在此基础上对发酵条件进行优化。［结果］最佳发酵条件为：温度37 ℃,初始pH值7,培养基装量20 ml/250 ml,菌种活化时间6 h,接种量3%,氮源为1.5%Tryptone,碳源为9.0%大豆浸出液,转速220r/min,16 h后添加0.3%Tween 80,发酵时间29 h。［结论］优化条件下,发酵液活性可达210 ATU/ml,较优化前提高13.1倍;优化条件上50 L罐放大后具有很好的重复性,发酵液活性可达208 ATU/ml。     

超声波/稀H2SO4预处理对玉米秸秆液体发酵产纤维素酶的影响（摘要）

[目的]研究超声波强化稀H_2SO_4预处理对玉米秸秆液体发酵产纤维素酶的影响,探索超声波强化稀H_2SO_4预处理玉米的最优条件。[方法]先以2%的H_2SO_4超声波预处理玉米秸秆,并以预处理后的秸秆为唯一碳源进行发酵,测定胞外发酵液的纤维素酶活性。单因素试验研究固液比、酸溶时间、超声时间、超声功率、酸浓度对发酵液纤维素酶活的影响。再以单因素测定结果为基础,设计4因素3水平的正交试验,筛选最高纤维素酶活的因素组合,进行验证试验。纤维素酶活测定：分别以新华定量滤纸50 mg/份,羧甲基纤维素钠（CMC-Na）510mg/份,脱脂棉花50 mg/份为底物,分别对应FPA、Cx、β-glucosidase,采用DNS还原糖法测定纤维素酶活。[结果]通过极差分析,影响FPA和β-Glu酶活因素大小依次为酸浓度、酸浴时间、超声功率、超声时间;影响Cx的因素依次为酸浴时间、酸浓度、超声功率、超声时间。产纤维素酶的最佳组合为：酸浴时间3h、酸浓度3.5%、超声功率150W、超声时间5h。在该条件下,利用玉米芯作为唯一C源液体发酵产纤维素酶的粗酶活分别为FPA 15.82 U/ml、Cx 39.9 U/ml、β-Glu 55.94 U/ml。验证试验也确定了其准确性。[结论]在筛选出的最佳组合条件下,胞外产纤维素酶具有较高的稳定性。     

根霉Yc1发酵豆渣产纤溶酶的研究

[目的]研究根霉Yc1以豆渣为原料经液态发酵产生纤溶酶的发酵条件。[方法]采用单因素试验与正交设计方法对根霉Yc1培养基及发酵工艺条件进行优化。[结果]根霉Yc1发酵产酶的适宜培养基组成为：麸皮5．00％,豆渣粉3．00％,ZnCl2 0．03％,MgSO。0．15％,Na：HPO4 0．05％;适宜的发酵工艺条件为：发酵温度32℃,初始pH值7．0,250ml三角瓶装液量60ml,摇瓶转速180r／min。在优化条件下培养60h,纤溶酶的发酵效价可达176．2U／ml,比优化前提高92．3U／ml。[结论]以豆渣为主要原料所产的纤溶酶可能成为一种安全、低毒的溶栓剂,其生产成本低,可为大豆综合利用提供新的思路。     

耐酸性α-淀粉酶产生菌的发酵条件优化

[目的]优化耐酸性α-淀粉酶产生菌的发酵条件。[方法]在筛选出的耐酸性α-淀粉酶产生菌的基础上,对其培养基C、N含量、接种龄、接种量、初始pH值、摇瓶转速及温度等发酵条件进行优化。[结果]耐酸性α-淀粉酶产生菌最佳发酵条件为接种龄14 h,接种量8%,初始pH值5.5,发酵温度35℃,转速150 r/min,接种菌液量25 ml,培养基中C、N的含量分别为1.0%。[结论]在优化条件下,酶活力达到31.4 U/ml,比未优化时提高了65.3%。     

高产胆固醇氧化酶菌株的诱变选育

[目的]选育高产胆固醇氧化酶菌株。[方法]从环链拟青霉、斜链拟青霉、中国拟青霉和蛹拟青霉中筛选出发菌株,对筛选出的酶活力高的突变株进行紫外诱变,选育出高产胆固醇氧化酶突变株,对其发酵条件进行优化并测定其酶活。[结果]选择环链拟青霉为诱变选育的出发菌株,紫外诱变环链拟青霉获得了一株高产胆固醇氧化酶突变株CM3,确定了紫外诱变的最佳时间是80S。通过优化其发酵条件,得出CM3发酵产酶最优条件为30℃,pH值6．0,接种量为10％。其最高酶活力为1．3360U／ml,比出发菌株（0．3369U／m1）提高了296．6％。[结论]通过紫外诱变能选育出有较高胆固醇氧化酶活力的菌株。