一株虫生真菌的分离鉴定及生防潜力研究

为挖掘虫生真菌资源,获得高效生防菌,本文利用大蜡螟诱集法从东北地区不同类型土样中筛选虫生真菌,其中选取了一株虫生真菌FLNXY5菌株,经形态学及18s rDNA ITS序列分析鉴定为球孢白僵菌Beauveria bassiana(KY419577)。本研究对FLNXY5菌株生物学特性、对小菜蛾Plutella xylostella 2龄幼虫的致病性及对7种植物病原菌抑菌活性进行测定,结果表明,FLNXY5菌株菌丝生长最适温度为25℃,产孢量在28℃极显著高于其他处理。30与25℃处理下,24 h萌发率最高达91%,无显著差异。浓度为1.0×10~9孢子·mL~(-1)的菌悬液处理小菜蛾2龄幼虫,5 d后的校正累计侵染率为89.2%。球孢白僵菌FLNXY5的拮抗机理研究中,菌株FLNXY5对水稻稻瘟病菌Pyricularia grisea菌丝抑制率最高达40.63%,对番茄灰霉病菌Botrytis cinerea菌丝抑制率最低为29.14%。本次研究得到的菌株发酵滤液对试验选取的7株植物病原菌菌丝没有抑制作用。     

四株马铃薯甲虫白僵菌菌株的鉴定

[目的]通过形态学特征明确四株马铃薯甲虫致病菌分类地位,探讨利用18S及ITS核酸序列鉴定四株致病菌的可行性.[方法]通过传统形态学特征及18S、ITS序列分别对四株马铃薯甲虫白僵菌1572、1573、1576和1577进行鉴定.[结果]孢子形态、产孢结构、菌落等形态学特征表明四菌株均为球孢白僵菌.四菌株18S rDNA序列分析获得1 665个共同碱基,在GenBank比对,从结果中选择相似度大于98;的序列与四菌株一起构建系统发育树I,发现白僵菌属归于一个分支,四菌株均归属于白僵菌属球孢白僵菌.剔除遗传关系比较远的、冗余的属外菌重新构建18S系统发育树Ⅱ,结果四菌株都与Beauveria bassiana(登录号为EU334676.1)分到一个枝上.ITS核酸序列分析获得513个共同碱基,在GenBank比对,显现的序列均属白僵菌属,下载这些序列与四菌株构建ITS系统发育树I,发现球孢与布氏白僵菌归属在一个分支.选取Stephen A.Rehner注册的白僵菌属六个分支的代表种及数据库中部分球孢和布氏白僵菌与四菌株一起构建ITS系统发育树Ⅱ,四菌株与代表种Cordyceps bassiana(AY532041.1)分到一个枝上,但在该枝上有三株布氏白僵菌,球孢与布氏白僵菌不能完全区分开.[结论]利用18S和ITS核酸序列均可将白僵菌鉴定到属,根据ITS序列可以确定四株白僵菌归属于球孢白僵菌的分支.     

白僵菌对烟蚜的致病性研究

[目的]探讨白僵菌（Beauveria bassiana）对烟蚜的致病性。[方法]以4株球孢白僵菌（B-1、B-2、B-3和B-4）为供试菌株,测定其对烟草蚜虫的致病性。[结果]受测的4株白僵菌菌株对烟草蚜虫均有不同程度的杀虫效果。其中,B-3处理烟草蚜虫的校正死亡率达到95%以上,B-1、B-2菌株的分生孢子处理烟草蚜虫的校正死亡率超过80%,其菌丝对蚜虫也有较高的致病率;4株菌株的代谢产物对烟草蚜虫均有较强的触杀作用,施用48 h后其烟草蚜虫的校正死亡率均超过85%。[结论]为烟草蚜虫的微生物防治研究提供了参考。     

29株虫生真菌的鉴定及对烟粉虱的毒力

【目的】对29株虫生真菌菌株进行分类学鉴定并筛选出对烟粉虱Bemisia tabaci具有高毒力的菌株。【方法】采用形态学及ITS区、TEF区、Bloc区基因序列相似性分析鉴定菌株,并采用浸渍法测定真菌对烟粉虱的毒力。【结果】29株虫生真菌有26株符合白僵菌Beauveria的特征,菌株SB003、SP665和SP670被鉴定属于棒束孢属Isaria;利用TEF区序列、Bloc区序列、TEF-Bloc联合序列构建的系统发育树,结果显示29株菌株共包括24株球孢白僵菌B. bassiana、2株假性球孢白僵菌B. pseudobassiana和3株环链棒束孢I. cateinannulata。烟粉虱2龄若虫的死亡率随孢子浓度的增加而增加,不同菌株致病力不同;用1×108 mL-1的孢子悬浮液处理烟粉虱2龄若虫7 d,致死率最高的菌株为SP433,其次为SB009,分别为87.37%和82.93%。【结论】本研究可为虫生真菌的分类提供理论基础,筛选出的高致病力菌株SP433和SB009可为烟粉虱的生物防治提供参考。     

10株白僵菌菌株ITS序列测定和系统发育分析

通过对10株白僵菌菌株进行培养和提取基因组DNA,并利用真菌ITS序列通用引物ITS4和ITS5进行PCR扩增,均得到了1条长约500 bp DNA产物。分别对该产物进行序列测定和分析表明,这10株白僵菌菌株的ITS序列长为490~494 bp;利用ITS序列构建系统发育树表明,菌株YD-1、YD-2、JN-1、QC-1、SY-1、YC-1、YC-2、GA-1和FJ-2均为球孢白僵菌（Beauveria bassania）,而菌株FJ-1很可能为白僵菌属的一个新成员。     

马尾松毛虫高毒力白僵菌菌株筛选

[目的]筛选对马尾松毛虫具有高毒力的白僵菌菌株,为生产上防治马尾松毛虫提供优良菌种资源.[方法]从不同地区林间收集僵虫和采集土壤,分别采用组织分离和稀释涂皿法分离白僵菌菌株,结合形态学观察和ITS序列分析鉴定白僵菌菌株的种级分类地位,通过孢子液浸渍法筛选对马尾松毛虫的高毒力菌株.[结果]共分离获得20株白僵菌菌株,在PDA培养基上各菌株的菌落、菌丝、分生孢子(梗)形态与球孢白僵菌(Beauveria bassiana)相似,且20株菌株ITS序列与GenBank中的球孢白僵菌遗传距离最近.对20株菌株的毒力测定结果表明,B-2、B-14、B-19、B-1和B-13等5株菌株对马尾松毛虫的毒力较强,其中B-2、B-14和B-19菌株的致病力最强,接种11d后马尾松毛虫的校正死亡率为100%,3株菌株对马尾松毛虫的致死中时(LT50)均小于8.00 d,分别为7.63、7.62和7.88 d,致死中浓度(LCs0)分别为0.63× 106、0.96×1 06和0.78× 106个/mL.[结论]筛选得到3株对马尾松毛虫具有高毒力的球孢白僵菌菌株B-2、B-14和B-19,且均具有较高的生物防治潜力和开发应用价值.     

茶卷叶蛾寄生真菌的分离、鉴定及毒力测定

从茶园中自然羅病而死的茶卷叶蛾(Homona coffearia)幼虫僵虫上分离纯化出1株病原真菌,经核糖体DNA(rDNA)转录间隔区(internal transcribed spacer,ITS)鉴定为球孢白僵菌(Beauveria bassiana),并命名为JYBb201菌株。对该菌株在PDA、PPDA和SDAY3种培养基上的生长速度和产孢能力进行测定,发现其在PDA上平均生长速度最快,菌丝的日均增长量达4.30 mm。但在SDAY培养基上培养16 d的产孢量比其他两种培养基大,达4.30×107孢子.mL-1。对茶卷叶蛾幼虫的毒力测定结果显示,该菌具有较高的杀虫活性,以2.16×108孢子.mL-1和4.32×107孢子.mL-1的菌液处理,9 d后其校正死亡率均达到94.74%,表明JYBb201菌株是1株对茶卷叶蛾幼虫具有潜在防治作用的病原真菌菌株。     

3种丝孢虫生真菌对西花蓟马成虫的毒力测定

[目的]测定3种丝孢类虫生真菌对西花蓟马[Frankliniella occidentalis(Pergande)]成虫的毒力,为筛选出对西花蓟马成虫高毒力的虫生真菌及生物防治提供依据.[方法]采用浸渍法在室内测定3种丝孢虫生真菌(球孢白僵菌、黄绿绿僵菌和玫烟色棒束孢)共14株菌株对西花蓟马成虫的侵染致死率;从3种丝孢虫生真菌中选取对西花蓟马成虫相对致病力较好的高毒力菌株各1株,测定其在不同浓度(浓度梯度分别为1.0×104、1.0×105、1.0×106、1.0×107和1.0×108孢子/mL)下对西花蓟马成虫的毒力.[结果]用1.0×107孢子/mL的球孢白僵菌菌株(WSWM81832、WSWL21831、WSWM1018315、WSWH21833和WSWL21836)、黄绿绿僵菌菌株(HLT17103、NGS21751、YKZ51712和WSWL51721)和玫烟色棒束孢菌株(WSWH31836、WSWL51831、WTS101822、NGS118310和WSWL21837)接种西花蓟马成虫10 d后,西花蓟马成虫的累积校正死亡率分别为68.45%~75.60%、67.35%~82.65%和61.45%~70.67%.球孢白僵菌WSWL21836、黄绿绿僵菌WSWL51721和玫烟色棒束孢WSWL21837菌株以1.0×104~1.0×108孢子/mL的孢子悬浮液接种西花蓟马成虫后,第10 d时西花蓟马成虫的累积校正死亡率分别为56.67%~82.33%、56.67%~89.67%和48.33%~76.67%;各菌株的毒力回归方程分别为Y=3.2543+0.3332X(r=0.9167)、Y=3.5878+0.2874X(r=0.9656)和Y=3.8188+0.2082X(r=0.9925),致死中浓度(LC50)分别为2.63×104、4.17×104和7.85×105孢子/mL,在1.0×108孢子/mL浓度下对西花蓟马成虫侵染致病的致死中时间(LT50)分别为5.67、4.91和6.12 d.[结论]黄绿绿僵菌菌株WSWL51721和球孢白僵菌菌株WSWL21836对西花蓟马成虫具有较强的毒力,可作为西花蓟马生防制剂开发的潜力菌株.     

广西桉蝙蛾病原真菌的鉴定

【目的】进行广西桉蝙蛾病原真菌的种类鉴定,筛选致病性强的优势菌株,为桉蝙蛾的生物防治奠定基础。【方法】采用常规的组织分离法进行病原菌的分离,对分离纯化获得的菌株进行致病性测定,根据形态特征和rDNA ITS序列分析确定病原菌的分类地位。【结果】从桉蝙蛾虫尸上分离纯化获得206个真菌菌株,这些菌株分属于白僵菌（Beauveria）、镰刀菌（Fusarium）、拟青霉（Paecilomyces）、曲霉（Aspergillus）、青霉（Penicillium）、毛霉（Mucor）和Evlachovaea,其中白僵菌分离率为87.4%,其他真菌分离率较低。经致病性测定,白僵菌是桉蝙蛾幼虫强致病菌,镰刀菌和Evlachovaea是弱致病菌,其他4类真菌为非致病菌。以形态学特征和rDNA ITS序列分析结果为依据,鉴定球孢白僵菌[B.bassiana（Balsamo）Vuillemin]、尖孢镰刀菌（F.oxysporum Schlecht）和Evlachovaea sp.为桉蝙蛾幼虫的致病菌,其中Evlachovaea sp.在中国首次被记载。【结论】广西桉蝙蛾的病原真菌为球孢白僵菌、尖孢镰刀菌和Evlachovaea sp.,其中球孢白僵菌为优势菌,具有较高的开发利用价值。     

重庆地区3株球孢白僵菌的分离鉴定

我国是农业和林业大国,农林害虫的危害造成了严重的经济损失,同时化学防治也导致了环境污染等诸多问题.因此,开发基于虫生真菌的生物农药意义重大.为了丰富虫生真菌菌种资源,以野外感染白僵菌的蝽蟓及室内感染的家蚕僵虫样品为实验材料,采用多种培养基,分离获得了3株虫生真菌菌株,分别为来自蝽蟓的NB-1,PW-1菌株和来自家蚕的JCY菌株,形态学观察结果表明,各菌株的培养特征与白僵菌属菌株较为一致;分子生物学鉴定表明,各菌株rDNA ITS序列与GenBank中白僵菌属球孢白僵菌多个菌株同源性高达99%,因此将菌株NB-1,PW-1和JCY均鉴定为球孢白僵菌(Beauveria bassiana);生物学特性观察发现不同菌株间分生孢子产生量存在显著差异,分离自蝽蟓僵虫的球孢白僵菌PW-1,NB-1分生孢子产量分别为(7.55±0.15)×10~7个/mL,(6.30±0.40)×10~7个/mL,均高于家蚕分离株JCY,其产孢量仅为(3.02±0.22)×10~7个/mL.结论为后续研发针对包括草地贪夜蛾在内的农林害虫生物杀虫剂奠定了菌种基础.     

土壤中纤维素降解真菌的筛选及酶活性分析

[目的]筛选降解小麦秸秆纤维素的真菌并分析C/N比对纤维素酶活力的影响。[方法]应用刚果红鉴定培养基和滤纸条降解度分析法筛选菌株,通过比对真菌rDNA的ITS区域序列鉴定菌株类型,通过调节培养基葡萄糖和(NH4)2SO4的比例研究了纤维素降解酶活性。[结果]从土壤中筛选出有2株分解纤维素能力较强的真菌,分别命名为NY01和NY02;真菌ITS保守序列比对结果显示,NY01与木霉的相似性最高达99%,NY02与毛霉的相似性高达99%;培养基中C/N比值在8∶1时2个菌株的CMC和FPA酶活性均达到最高。[结论]该研究为进一步探索秸秆纤维素降解奠定了基础。     

两种新疆羊肚菌的分类学鉴定

[目的]对新疆霍城县大西沟采集的两种形异羊肚菌(XJURML4和XJURML5)进行分类鉴定.[方法]用真菌专一引物ITS1f和ITS4扩增两菌ITS区并进行序列分析.[结果]XJURML4 ITS片段1 130 bp( EU086775),XJURML5 ITS片段1 127 bp(EU086776).两菌的ITS2区100;相似,而ITS1区仅有4 bp差异.BLAST比对测序结果发现XJURML4和XJURML5与近缘种宽圆羊肚菌(MorcheLLa esculenta (L.:Fr.)Pers.var.rotunda Pers.:Fr.)的同源性为99.28;和98.65;;NJ法构建进化树分析ITS序列,两菌也跟宽圆羊肚菌类聚在一起.随机引物OPA3进行RAPD扩增,共产生出六条带,二条相同,剩余四条为多态性条带,表明两菌基因组上也有差异.[结论]ITS区序列和进化树分析、OPA3 - RAPD标记技术均表明两菌是宽圆羊肚菌种内的新变种,而与传统形态学鉴定结果不一致.     

1 株拟盘多毛孢菌的培养·纯化及其ITS区的克隆测序

[目的]为拟盘多毛孢菌分离、纯化及ITS区克隆测序相关研究提供依据。[方法]对鸡枞菌内生拟盘多毛孢菌进行分离、纯化,并通过形态学及分子生物学的方法进行鉴定,对其ITS区进行PCR扩增和克隆测序分析。[结果]形态学鉴定结果显示没有已报道的拟盘多毛孢菌与其相似,系统发育树结果也表明其属于一单独分支中。[结论]建立拟盘多毛孢菌的ITS序列数据库是十分必要的。     

一株野生大型真菌的菌种分离及ITS序列鉴定

[目的]寻找适宜杨树林下栽培的野生食用菌菌种。[方法]对采集自辽宁省阜新市蒙古族自治县银中杨林下的野生大型真菌进行菌种分离,同时研究不同分离部位对菌丝生长的影响,并对获得菌丝进行了rDNA ITS序列分析。[结果]菌盖与菌柄连接处为菌种最佳分离部位。对分离株rDNA ITS片段进行PCR扩增,扩增产物长度为692 bp,登录NCBI与GenBank中已知的菌种进行Blast比对,序列与Agaricus bitorquis(Quél.)Sacc的Query cover为97%~100%,ident均为99%。[结论]鉴定分离菌种为蘑菇科、蘑菇属、大肥菇。该研究可为下一步开展杨-食用菌复合经营提供菌种准备。     

我国部分区域链格孢属rDNA ITS区序列分析(英文)

[Objective] The study aimed to identify Alternaria Nees. from some areas of China at molecular level by analyzing the rDNA ITS sequence.[Method] The DNA sequences coding for the 5.8S rDNA and the flanking internal transcribed spacers (ITS1 and ITS2) were amplified by PCR with universal primers ITS4 and ITS5 and subsequently sequenced for 34 Alternaria isolates from different areas of China.[Result] Sequences analysis showed that 5.8S rDNA was 159 bp and no variation in tested 34 isolates. There had variables sites in ITS. The isolates that had same sequences as A.tenuissima or A.alternata all put up eurytopicity to area and host. The variables sites of the isolates showed the diversity of Alternaria in the hosts of Oleaceae, Rosaceae and Solanaceae. At the same time that ITS could not clearly separated the isolates was indicated. The results indicated that the phylogenetic relationship were not closely related to the geographical origin and hosts of these isolates.[Conclusion] The sequence analysis of ITS region could provide theory basis for the identification of Alternaria Nees..     

我国部分区域链格孢属 rDNA ITS区序列分析

[目的]对我国部分区域链格孢属rDNA ITS序列进行分析,从而在分子水平上对其进行鉴定。[方法]使用通用引物ITS4和ITS5对分离自我国部分区域不同寄主链格孢属（AlternariaNees）34个菌株进行ITS基因（ITS1-5.8S-ITS2）的PCR扩增和测序。[结果]序列分析结果表明：5.8S rDNA全长为159 bp,保守程度高,参试的34株菌均一致;ITS区变化相对较大。与A.tenuissima或A.alternata100%同源的分离菌株均表现出对地域和基质的广适性;菌株在5.8S/ITS存在的差异,说明寄主本犀科的丁香叶、蔷薇科、茄科等部分植物的链格孢具有一定的多样性。但同时也发现ITS序列标记在链格孢属部分种间应用有一定的局限性;基于序列ITS1-5.8S-ITS2聚类关系与其地理来源和寄主相关性不大。[结论]ITS序列分析法可为链格孢属的分子鉴定提供理论依据。     

5种虫生拟青霉高产VE菌株的筛选及优化

[目的]为从真菌中开发利用天然VE提供一定的科学依据和参考。[方法]用紫外分光光度法测定5种虫生拟青霉中天然VE的含量,采用正交试验对细脚拟青霉进行高产VE培养基的优化。[结果]细脚拟青霉中的天然VE含量最高;所得优化的培养基碳源为甘露糖,氮源为尿素,微量元素为铁,pH值自然。[结论]该研究中的真菌资源具有开发脂溶性物质的极大潜力。     

产甘草苷内生真菌HGE5的鉴定及抑菌活性研究

[目的]研究甘草内生真菌HGE5及其活性代谢产物,为深入开发利用该菌株提供依据。[方法]选取12种受试致病菌,测定内生真菌HGE5的抑制活性,并采用形态特征观察法及r DNA ITS序列同源性分析对内生真菌HGE5进行鉴定,利用HPLC法对HGE5发酵液进行分析。[结果]甘草内生真菌HGE5对8种受试致病菌有较强的抑菌作用,内生真菌HGE5为尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum);该菌发酵液中含有甘草苷。[结论]HGE5是甘草苷产生菌,该菌的获得可为甘草苷成分的生产提供新方法。     

我国部分区域链格孢属rDNA ITS区序列分析

1材料与方法 1．1菌株来源菌株来源见表1。 1．2菌丝体培养将链格孢菌株接种到PDA培养基上,25℃恒温、倒置培养7d左右,用灭菌的刀片将菌丝从培养基上刮下,以备DNA提取用。     

马铃薯炭疽病菌分离与鉴定

[目的]对进境船舶上携带的带病马铃薯薯块进行了病原真菌的分离鉴定,明确其检疫重要性,并对病菌的快速鉴定方法进行研究。[方法]通过形态学观察和ITS序列分析对病菌进行了鉴定,并对已有的巢式PCR方法进行了验证。[结果]形态学观察和ITS序列分析表明,病原菌为球炭疽菌（Colletotrichum coccodes）。巢式PCR中用特异性引物Cc1NF1/Cc2NR1扩增C.coccodes得到了349bp特异性条带。[结论]巢式PCR方法可以用来对C.coccodes进行快速鉴定,该病原菌是进境植物检疫潜在危险性病原真菌,在国内口岸属首次截获。