苏姜猪Lrh-1基因PCR-SSCP多态性及其与产仔数的关系

为深入研究苏姜猪肝受体类似物质-1(Lrh-1)基因的多态性及其与产仔数性状间相关性,依据NCBI数据库中猪Lrh-1基因核酸序列设计2对引物,采用聚合酶链式反应-单链构象多态性(PCR-SSCP)方法对苏姜猪Lrh-1基因进行多态性检测。检测结果显示,引物P1 PCR扩增产物存在7种SSCP条带型,共有4个碱基突变位点,分别为27287662、27287593、27287535和27287511位;引物P2 PCR扩增产物存在2种SSCP条带型,碱基突变位于27423038位;将扩增序列与猪Lrh-1CDS区进行比对分析,其中27287662、27287593和27423038位的碱基突变位于配体结合域(LBD)区内,且突变均属同义突变,表明LBD区对于Lrh-1基因功能稳定具有重要作用;不同碱基突变位点的基因频率经群体遗传学分析,除27287511位点处于群体不平衡状态(P0.05)外,其他位点均达群体平衡状态(P0.05);Lrh-1基因P1和P2扩增区SSCP不同类型苏姜猪第1胎和第2胎平均产仔数间无显著差异(P0.05)。     

牛卵泡AGTR2序列结构及表达特性分析

【目的】研究牛卵泡发育过程中关键调控蛋白CART的候选受体AGTR2的分子特征和立体结构,并结合AGTR2在不同生理状态牛卵泡的表达特性分析其功能。【方法】 同期发情处理后,经B超声波连续监测（每12 h 一次）采集牛双侧卵巢,分离优势卵泡（dominant follicles, DF）和从属卵泡（subordinate follicles, SF）;其中3头牛DF和SF分别分离颗粒细胞（granulosa cells, GCs）,抽提总RNA后,经反转录、引物特异性扩增、胶回收及测序,获得AGTR2基因全CDS区;生物信息学方法对其序列结构、亲缘关系及立体结构进行分析;设计AGTR2和内参基因RPLP0 qRT-PCR引物,分析AGTR2在牛DF和SF的差异表达情况;另1头牛DF和SF经4%多聚甲醛固定后,设定阳性、阴性对照组和试验组,应用免疫组织化学技术对AGTR2进行表达和定位分析。【结果】 AGTR2 CDS区全长1 089 bp,编码362个氨基酸;牛卵泡AGTR2氨基酸序列与NCBI数据库获得的其他24种动物对应的氨基酸序列BLAST分析表明,该序列与印度水牛序列相似性最高（99.4%）,与其他动物序列相似性为92.0%—98.9%;立体结构和功能域分析表明,AGTR2立体结构中包含有7个横跨细胞膜的平行的α螺旋结构,符合G蛋白偶联受体（G-protein-coupled receptors, GPCRs）的典型特征;qRT-PCR分析结果表明AGTR2 mRNA在DF的表达量极显著高于SF（P<0.01）,且差异表达倍数达7.47倍;免疫组织化学分析结果表明AGTR2在牛DF和SF颗粒层、膜层细胞均有表达,特异性显色强度表明AGTR2在SF膜层细胞表达量高于DF。【结论】 AGTR2属于G蛋白偶联受体,符合神经肽CART受体的基本特征;本试验为进一步研究AGTR2在牛卵泡发育过程中调控信号通路和激素分泌的机理奠定基础,同时,对后期鉴定CART的受体、深入阐明CART调控牛卵泡发育的作用机理具有重要意义。     

绒山羊RORα基因2种亚型的结构与进化分析

为深入研究绒山羊RORα基因的结构及功能,利用cDNA末端快速扩增法（RACE）结合转录组获得了绒山羊（Capra hircus）维甲酸相关孤核受体（retinoic acid receptor-related orphan receptorα,RORα）基因的2个亚型:RORα1和RORα2（GenBank登录号分别是HM₀61155和HM₃58053）。序列分析表明,RORα1序列全长1 620bp,包括5′端非翻译区（untranslated region,UTR）29bp、3′端非翻译区211bp和开放阅读框（open reading frame,ORF）1 380bp,共编码459个氨基酸,分子质量约为52.3ku,理论等电点6.25。RORα2序列全长1 694bp,包括5′UTR 76bp、3′UTR 211bp和ORF 1 407bp,共编码468个氨基酸;与人RORα4的长度相同,相似性达99%,分子质量约为53.4ku,理论等电点为6.37。结果显示:1)RORα1氨基酸序列缺少大多数核受体具有的调节区（A/B区）,预测的二级结构少一个β-折叠基序（YFV）;2)RORα的DNA结合区到配体结合区部分属于纯化选择,A/B区在长度和序列方面变异都很大。     

作物水肥耦合类型量化方法在华北冬小麦水氮配置中的应用

【目的】研究一种作物水肥耦合类型量化方法及基于这种方法的华北冬小麦水氮优化配置,丰富作物水肥耦合分析方法,为促进冬小麦水肥协同高效生产提供理论基础和实践依据。【方法】根据作物相对产量的真实值与理论值的差异显著性来判定某一具体水肥组合的耦合类型。2006—2016连续10年在黄淮北部进行了冬小麦季不同水氮处理的大田定位试验。裂区设计,灌水量为主区,设春灌1水（拔节期75 mm,W₁）和2水（拔节期和开花期各75 mm,W₂）两个处理;施氮量为副区,设5个水平,分别为0 （N₀）、60（N₆₀）、120（N₁₂₀）、180（N₁₈₀）、240 kg·hm ^-2（N₂₄₀）,共10对水氮组合。研究冬小麦不同水氮组合的耦合类型及其年际转换特征,确选适宜的水氮配置。【结果】某一水肥组合相对产量真实值经统计检验显著高于其理论值,此水肥组合的水肥耦合类型即为“协同”（水肥互相促进）;真实值显著小于理论值,水肥耦合类型即为“拮抗”（水肥互相限制）;真实值与理论值没有显著差异,水肥耦合类型即为“加和”（水肥互不影响）。冬小麦W₂与不同施氮水平（N_x）组成的水氮组合的耦合类型及其年际变化特征受施氮水平的影响显著。W₂N₆₀水氮耦合类型10年平均为“拮抗”,定位第1—2年灌水限制施氮的增产作用,施氮限制了灌水的增产作用,水氮“拮抗”;定位第3 ^-25年耦合类型转变成“增水促氮,增氮促水”的“协同”;定位第6—10年又转为“拮抗”。W₂N₁₂₀的耦合类型在定位第1—4年为“加和”,第5年起就转为“协同”,10年平均为“协同”。施氮超过120 kg·hm ^-2的两水氮组合W₂N₁₈₀与W₂N₂₄₀的耦合类型各年度均为水氮互不影响的“加和”。【结论】基于作物相对产量真实值与理论值差异的显著性来定量判定某一特定水肥组合的耦合类型具有较强的可行性。黄淮北部冬小麦生产中, W₂N₁₂₀组合水氮协同增产效果显著,耦合类型长期为“协同”,因此,在一定年限内可作为该区冬小麦季适宜的水氮配置,年均产量水平维持在8.5 t·hm ^-2左右。     

紫花苜蓿盐诱导类受体蛋白激酶基因MsSIK1的克隆及功能分析

【目的】对紫花苜蓿（Medicago sativa L. cv. Zhongmu-1）stress-induced protein kinase gene 1（MsSIK1）进行克隆与表达研究,了解该基因的分子机制及其应用。【方法】以紫花苜蓿叶片总RNA为模板,根据同源克隆设计简并引物,利用RT-PCR结合RACE技术,获得MsSIK1的编码序列。利用同源性比对进行序列分析。通过SMART网站（http://smart.embl-heidelberg.de/）模拟该基因的蛋白结构。构建MsSIK1的亚细胞定位瞬时表达载体,使用基因枪转化法将MsSIK1与GFP在洋葱表皮细胞中融合瞬时表达并观察其亚细胞定位荧光信号。通过Real time-PCR分析MsSIK1在NaCl、ABA和干旱处理条件下的表达特征。利用农杆菌侵染方法获得转基因拟南芥植株,通过RT-PCR对转基因植株进行表达鉴定,获得转基因植株后,利用转基因株系进行盐处理进而对成苗期转基因拟南芥性状鉴定。在盐胁迫处理下,测定野生型与转基因株系的叶绿素含量、MDA含量进而验证该基因的抗盐功能。【结果】获得MsSIK1编码序列2 478 bp,编码825个氨基酸。该蛋白C端与多种植物激酶具有相当高的同源性,模拟蛋白结构发现该基因具有类受体蛋白激酶高度保守的丝氨酸/苏氨酸结构域、跨膜结构域和富含亮氨酸重复序列的膜外结构域。Real time-PCR分析表明该基因在NaCl、ABA和干旱处理条件下上调表达,其中在盐处理条件下,MsSIK1表达先升高后降低,在处理4 h时达到最大值（约为对照值的7倍）。在干旱胁迫处理时,MsSIK1受诱导表达增强明显,当处理2 h时表达量达到最大值（约为对照值的6倍）;ABA处理时,MsSIK1被诱导表达明显,当处理3 h时表达量达到最大值,约为对照值的6.8倍。MsSIK1与GFP融合瞬时表达的洋葱表皮细胞中的荧光信号主要集中于质膜附近,转化空载体的洋葱表皮细胞中的荧光信号分布于细胞各个部位。转基因植株的RT-PCR鉴定表明,T₁代6个株系中所得到的MsSIK1条带明显、亮度高,且T₁-10中表达量最高;但在野生型中检测不到该条带,说明外源基因已经整合到拟南芥染色体中并能遗传到子代。成苗期转基因拟南芥盐处理后发现T₃-2、T₃-6、T₃-10转基因株系较野生型植株长势好,说明MsSIK1的转入提高了拟南芥的抗盐性。与对照相比,转MsSIK1拟南芥在NaCl处理下,叶绿素含量下降较少,其中,野生型叶绿素含量降低了77%,T₃-3降低了53%,T₃-6降低了44%,T₃-10降低了35%;同样盐胁迫下,3个转基因株系的MDA含量积累较少,其中,野生型MDA的含量是T₃-10株系的1.3倍。【结论】MsSIK1作为一个类受体蛋白激酶受多种逆境胁迫诱导,该基因的过量表达提高了拟南芥的抗盐性。     

草甸草原区退耕地的牧草-水分-氮肥耦合机制

【目的】 通过在呼伦贝尔建植不同种植模式的人工草地,研究补水、施氮和牧草类型3个因素对人工草地群落生物量、植物营养成分和土壤质量的影响,旨在揭示呼伦贝尔地区退耕地人工草地的水肥耦合机制,筛选建植管理的最优模式。【方法】 试验在呼伦贝尔草原生态系统国家野外科学观测研究站进行,2016年6月6日试验开始,设置3个因素试验,即牧草类型（Pasture）、施氮水平（Nitrogen）和补水处理（Irrigation）。牧草类型设紫花苜蓿单播（P₁）、无芒雀麦单播（P₂）、紫花苜蓿无芒雀麦1﹕1混播（P₃）3个处理;施氮水平设不施氮（N₀）、低氮（N₁:75 kgN·hm^-2·a^-1）和高氮（N₂:150 kgN·hm^-2·a^-1）3个水平,每年追施氮肥（化学纯尿素）两次分别于成苗（返青）期和分蘖期撒施;补水设不补水（I₀）和补水（I₁）两个水平,每年6、7、8月补水3次,补水20 mm·m^-2。重复4次,共计72个试验小区,每个试验小区面积7 m×10 m,行距1 m。在2016、2017年测定草地生物量、营养成分（植物粗蛋白、中性洗涤纤维和酸性洗涤纤维）以及土壤养分（土壤全氮、有机碳和pH）。【结果】 （1）播种当年（2016年）的产量对（N）、（I）、（P）和（P×I）等试验因素的响应均达到显著水平（P<0.05）,2017年两次测定的产量对（N）、（P）、（P×I）、（P×N）、（N×I×P）等试验因素的响应均达到显著水平（P<0.05）,并且混播（P₃）在不补水（I₀）条件下低氮（N₁）处理的产量显著高于其余处理组（P<0.05）,平均达到17 801.19 kg·hm^-2。（2）2016年和2017年的粗蛋白（CP）含量均表现为P₁处理>P₃处理>P₂处理,2016年P₁、P₂和P₃处理在补水条件相同时均表现为CP含量随着氮水平增加而增加,其中P₁N₂I₀显著高于P₁N₀I₀、P₁N₁I₀ 、P₁N₁I₁（P<0.05）,达到最大（19.08%）;2017年P₃在I₀条件下N₁水平的粗蛋白（CP）含量（15.12%）显著高于N₀（P<0.05）。（3）施氮和补水均倾向于促使土壤有机碳（SOC）含量负增长,全氮（TN）含量正增长,pH值负增长,其中表层土壤SOC增长量苜蓿和无芒雀麦显著高于混播（P<0.05）,表层土壤全氮（TN）增长量苜蓿显著高于无芒雀麦和混播（P<0.05）。2016年表层和亚表层的土壤碳氮比（C/N）均高于2017年,表层平均高出17.39%,亚表层平均高出15.18%,表层土壤碳氮比的变化更为明显,其中表层土壤碳氮比2016年P₁N₀I₁处理最高,为8.15,2017年P₁N₂I₀处理最高,为5.67,亚表层土壤碳氮比2016年P₁N₂I₁处理最高,为6.36,2017年P₃N₂I₁处理最高,为5.67。【结论】 在呼伦贝尔退耕人工草地在播种第二年,牧草-水分-氮肥的耦合作用对草地生物量具有显著影响,水氮耦合具有一定促进牧草的养分积累的协同效应,其中建植豆-禾混播草地最有利于提高牧草的生物量与营养品质。人工草地的建植会导致C/N降低,土壤品质下降,在不同牧草类型、补水及施氮水平下均会表现出0-20 cm土层SOC含量、pH值的降低以及土壤TN含量的上升,表明土壤出现酸化现象,豆-禾混播土壤pH值降低幅度小于单播,而高氮和补水会明显加剧土壤pH值的降低。     

烟粉虱味觉受体基因BtabGR1和BtabGR2的克隆与表达模式分析

【目的】烟粉虱（Bemisia tabaci）为世界性分布的重要农林入侵害虫,寄主植物种类众多,但对不同寄主植物存在嗜性差异,而味觉受体（gustatory receptor,GR）基因在其取食选择等行为中发挥重要作用。本研究通过克隆烟粉虱味觉受体GR1和GR2基因,明确其在烟粉虱不同发育期和成虫不同组织中的表达特性,为基因功能的深入研究提供依据。【方法】从烟粉虱MED隐种成虫头部转录组中筛选获得味觉受体基因序列,利用巢式PCR技术克隆获得两个味觉受体基因的完整开放阅读框（open reading frame,ORF）序列,两个基因分别命名为BtabGR1和BtabGR2,运用生物信息学软件对其编码氨基酸序列特征、结构域等信息进行预测,基于邻接法构建BtabGR1、BtabGR2与其他半翅目昆虫味觉受体基因的系统进化树,并利用实时荧光定量PCR方法分析两个基因在烟粉虱不同发育期（卵、1—4龄若虫和雌、雄成虫）和雌、雄成虫不同组织（头、胸、腹、足）中的表达情况。【结果】克隆获得BtabGR1和BtabGR2基因序列（GenBank登录号：OL845904和OL845905）,完整开放阅读框为1 287和1 344 bp,分别编码428和447个氨基酸,预测蛋白分子量为 48.54和51.50 kD,理论等电点为8.85和8.74,具有4个和6个跨膜结构域。氨基酸序列比对和系统进化分析结果显示,BtabGR1 和BtabGR2与其他半翅目昆虫GR28b和GR43a-like基因亲缘关系较近。发育期表达谱分析表明,BtabGR1和BtabGR2在烟粉虱的不同发育历期均有表达,其中BtabGR1在成虫中表达量高于其他发育期,而BtabGR2在卵中的表达量最高;组织表达谱结果表明,BtabGR1和BtabGR2在烟粉虱雌、雄成虫不同组织中均有表达,且均在成虫头部高表达。【结论】BtabGR1和BtabGR2具有昆虫味觉受体基因的典型特征,二者均在烟粉虱成虫头部高表达,推测两基因在烟粉虱寄主植物适应过程中发挥重要作用,可作为烟粉虱新型防控措施的潜在靶标。     

瓜类作物枯萎病病原菌的分类鉴定及其ITS序列差异性分析

 【目的】鉴定福建省几种重要瓜类作物枯萎病菌,比较和分析它们的ITS序列差异和种内群体分化状况。【方法】通过分子鉴定结合形态鉴定,确定瓜类作物枯萎病菌的种类;通过它们的ITS序列亲缘关系和多重比较分析,分析该病原菌种内群体分化特点。【结果】供试的26个菌株属于两种镰孢菌：尖孢镰孢（Fusarium oxysporum）和串珠镰孢（Fusarium moniliforme）,其中F.oxysporum占54%,为优势种;这两种类型菌株的ITS序列差异较大,且主要表现在ITS2区间,差异达20.4%,而ITS1区间的序列完全相同或只有1个碱基的差异;F.oxysporum种内存在3类ITS序列,类型I与类型Ⅱ在376 bp处有1个碱基（C/T）的差异,类型Ⅱ比类型Ⅲ少1个碱基（A）;F.moniliforme种内也存在3类,类型Ⅰ与类型Ⅱ在320 bp处有1个碱基差异（T/C）,类型Ⅰ与类型Ⅲ有3个碱基的差异,分别是在38 bp处有1个碱基差异（A/C）,在395 bp处有1个碱基差异（T/C）,在429 bp处有1个碱基的差异（T/A）。【结论】福建省瓜类作物枯萎病菌为F.oxysporum和F.moniliforme。这两种镰孢菌种间的ITS序列差异较大且主要差异在ITS2区间,但是这两种类型镰孢菌种内ITS序列差异却很小。     

水氮互作对冬油菜氮素吸收和土壤硝态氮分布的影响

【目的】针对西北地区冬油菜蕾薹期干旱频发,农民大量灌溉和施氮导致的环境问题,探究西北地区冬油菜蕾薹期适宜的灌溉量和施氮量。【方法】通过2年田间试验,研究分析蕾薹期不同灌溉量（不灌溉（I₀）、灌60 mm（I₁）和灌120 mm（I₂））和施氮量（不施氮（N₀）、施氮80 kg·hm^-2（N₁）和施氮160 kg·hm^-2（N₂））下,地上部干物质量、籽粒产量、氮素吸收与分配、土壤硝态氮分布和氮素利用效率的差异,其中全生育期不施氮（不基施、不追施）和不灌溉为对照处理（CK）。【结果】蕾薹期灌溉或施氮能显著提高冬油菜的地上部干物质量、籽粒产量、产油量和氮素吸收量。土壤硝态氮峰值所在的土层深度随灌水量的增加而明显下移,且峰值随施氮量的增加而明显增加,表现出明显的淋洗趋势。I₁N₁处理的土壤硝态氮累积量与I₀N₀处理间不存在显著差异,但与I₂N₂相比,却显著降低41.9 kg·hm^-2。I₀、I₁和I₂处理土壤硝态氮主要分布在0-40、40-80和80-160 cm。2个冬油菜生长季,I₂N₁处理的籽粒产量和产油量均最大,平均为3 385和1 429 kg·hm^-2;CK最小,平均为1 391和585 kg·hm^-2。与I₂N₁相比,2012-2013年（干旱年）I₁N₁处理的籽粒产量显著降低,但产油量无显著差异;2013-2014年（平水年）二者的籽粒产量和产油量均不存在显著差异。2年I₁N₁处理平均籽粒产量和产油量分别为3 264和1 358 kg·hm^-2,仅比I₂N₁降低3.6%和4.7%。I₁N₁处理的平均氮肥农学利用率比I₂N₁降低7.2%。【结论】为提高冬油菜籽粒产量和氮素利用效率,减轻土壤硝态氮的下移趋势和下移量,I₁N₁处理（灌溉60 mm,施氮80 kg·hm^-2）为较优的灌溉施氮策略。     

陆地棉GhPKE1的生物信息学分析及功能验证

为研究棉花重金属结构域基因GhPKE1在棉花中的作用，采用生物信息学方法对GhPKE1 DNA序列的结构特性及其编码蛋白质的理化性质、疏水性和蛋白二级结构等进行分析，并根据GhPKE1的结构特点构建了GhPKE1的病毒诱导基因沉默（VIGS）载体侵染棉花。结果表明，GhPKE1基因序列全长1 048 bp，蛋白质相对分子质量27.54 kD，等电点9.3，不稳定系数35.56。分别用硫酸钠（Na₂SO₄）和氯化镉（CdCl₂）胁迫处理沉默GhPKE1的三叶期棉苗，处理后植株表现出明显的表型差异。qRT-PCR表达模式分析表明，用pYL156：GhPKE1侵染过的棉花中GhPKE1转录水平与对照相比显著降低；与对照相比，沉默GhPKE1棉花幼苗的抗Na₂SO₄和抗CdCl₂性显著减弱。综上所述，GhPKE1基因在棉花响应逆境胁迫过程中发挥重要作用，为进一步研究棉花的抗逆机制奠定基础。     

Lrh-1基因在湖羊HPG轴中表达量变化研究

[目的]揭示湖羊发情周期不同阶段下丘脑-垂体-性腺(HPG)轴组织中Lrh-1基因的表达变化规律。[方法]建立了湖羊Lrh-1基因的实时荧光定量(qRT-PCR)检测体系,测定其在发情前期、发情期、发情后期和间情期湖羊的下丘脑、垂体和卵巢间质组织中的表达量,分析Lrh-1基因在湖羊HPG轴的表达随发情周期变化的规律。[结果]建立的湖羊组织Lrh-1 mRNA检测体系扩增效率为92.44%,扩增效果良好。在湖羊的下丘脑、垂体和卵巢间质组织中均检测到Lrh-1基因mRNA的表达。其中,在发情后期下丘脑和卵巢间质组织中Lrh-1 mRNA相对表达量显著高于其他阶段的表达量(P0.05),垂体组织中Lrh-1 mRNA相对表达量在发情周期不同阶段间差异不显著(P0.05)。[结论]Lrh-1基因参与发情周期湖羊下丘脑、垂体和卵巢功能的行使,并且该基因的表达量变化可能与湖羊发情周期有关。     

猪口蹄疫病毒受体整合素β8亚基配体结合域的原核表达和多克隆抗体制备

病毒受体是决定病毒宿主特异性和组织嗜性的重要因素.利用原核细胞表达了猪口蹄疫病毒受体整合素β8亚基的配体结合域(LBD)片段,分离纯化目的蛋白后免疫兔,制备兔多克隆抗体.以含有猪β8亚基全长cD-NA的质粒为模板,经PCR扩增得到位于β8成熟肽氨基端的LBD基因片段,与带有GST标签的原核表达载体pGEX 4T-1相连,构建原核表达质粒pGEX/β8LBD,测序确认读码框正确后,将其转化感受态细胞BL21(DE3),以IPTG诱导表达重组β8LBD融合蛋白.通过SDS-PAGE和Western blot鉴定后提取包涵体,以电泳分离纯化的重组融合蛋白免疫新西兰白兔制备多克隆抗体,鉴定血清效价和特异性.结果显示,实现了重组猪β8LBD融合蛋白在大肠杆菌中的高效表达,SDS-PAGE显示分子量约为46 000,主要以包涵体形式存在于菌体中.制备的兔多克隆抗体效价达1∶12 800以上,该血清可与目的蛋白发生特异性反应.这将为进一步研究猪整合素β8亚基在宿主体内的分布及其在口蹄疫病毒致病过程中的作用奠定基础.     

柱型苹果MdCoLBD1/2基因生物信息学及SNP分析

柱型苹果(Columnar apple)是苹果株型育种的珍贵资源.利用同源基因克隆方法,以柱型苹果"威塞克旭"一年生枝上休眠期芽cDNA为模板,克隆得到了LOB DOMAIN家族(LBD)的2个同源基因,命名为MdCoLBD1/2,分别编码195和240个氨基酸.该基因有LBD家族的典型结构域,如C盒、GAS盒、亮氨酸拉链(Leu zipper)结构以及LOB Domain区域等.MdCoLBD1/2分别定位于第10条染色体Chr10:18985568..19005801和MdCoLBD2 Chr10:18985594..19005850区间.MdCoLBD1/2与白梨、葡萄、草莓、椰子、梅、核桃的氨基酸的相似性均在60%以上.聚类分析表明MdCoLBD1和白梨、梅、草莓亲缘关系较近,MdCoLBD2与葡萄、核桃亲缘关系较近,MdCoLBD1/2与亚洲棉、陆地棉的聚类关系均较远.通过测序分析了MdCoLBD1/2基因在30个不同类型材料中的碱基序列差异,得到MdCoLBD1有8个碱基差异位点,MdCoLBD2有5个碱基差异位点.     

人雄激素受体LBD基因高效表达条件的优化及产物纯化

人雄激素受体激素结合部的ｃＤＮＡ片段克隆到表达载体ｐＴｒｘＦｕｓ内,在大肠杆菌ＧＩ７２４中可被诱导表达。通过改变诱导培养时间,诱导剂浓度,诱导温度及培养基的ＰＨ,在３４－３７℃,ＰＨ６．４－７．７的培养基中,用１００μｇ／ｍｌＴｒｐ诱导培养４ｈ,可获得高效表达的ＬＢＤ融合蛋白产物。     

家蚕卵黄原蛋白受体BmVgR的体外表达

【目的】克隆家蚕卵黄原蛋白受体（vitellogenin receptor, VgR）,分析其在昆虫细胞中的表达特征,了解正常VgR和突变VgR的表达模式,为阐明其生物学功能提供参考依据。【方法】基于家蚕VgR的基因编码序列设计特异引物,扩增的目的片段连接到载体pET28a上,构建原核表达载体,转化E. coil BL21（DE3）表达菌株,IPTG诱导获得目的蛋白;用镍柱亲和层析方法纯化诱导表达的家蚕VgR肽蛋白;将纯化后的肽蛋白制备BmVgR的兔源多克隆抗体;PCR扩增获得大造和突变型白妙卵（scanty vitellin,vit）的LBD1+EGF1结构域（C11D和C11V）片段,连接到细胞表达载体上,通过细胞转染表达目的蛋白,采用细胞免疫组化检测大造和突变型vit的VgR在细胞里的表达情况;通过Western blot检测细胞培养液中大造和突变型vit VgR的表达量。【结果】原核表达获得了一个大小约为22 kD的融合蛋白,以包涵体形式表达;镍柱亲和层析初纯化得到BmVgR的肽蛋白,进一步切胶纯化后,以此为抗原制备BmVgR的兔源多克隆抗体,其抗体效价＞1﹕512 000,纯度为95%以上。转录水平检测表明Sf9和Spli221昆虫细胞中没有BmVgR和BmVg内源基因的表达;在Sf9昆虫细胞中成功表达了家蚕野生型和突变型vit BmVgR的结构域SP+LBD1+EGF1肽段,家蚕突变型vit在BmVgR第1个表皮生长因子同源区域的第3个ClassB区域有编码50个氨基酸残基的核酸序列缺失;细胞免疫组化试验表明,突变型和正常型的C11V和C11D都能在Sf9细胞质中正常表达;制备的BmVgR兔源多克隆抗体和Myc标签抗体同时检测到细胞表达的目的蛋白,表明试验所制备的VgR抗体特异性较好;由于SP+LBD1+EGF1肽段存在信号肽,细胞表达的蛋白会分泌进入细胞培养液中,Western blot对培养液进行蛋白检测,表明突变型vit存在氨基酸缺失,但并不影响肽蛋白的正常表达,且表达量没有明显差异。【结论】EGF1结构域的缺失并不影响SP+LBD1+EGF1肽蛋白的正常表达,可能是其蛋白功能异常导致突变型vit表型产生。     

番茄LBD基因家族的全基因组序列鉴定及其进化和表达分析

【目的】从番茄全基因组中鉴定LBD基因,并进行基因进化、基因结构、染色体定位以及组织表达和诱导表达分析,为番茄LBD基因的功能研究与利用奠定基础。【方法】利用番茄基因组数据库,通过生物信息学手段,鉴定番茄LBD家族成员;采用MEGA5软件进行系统进化树分析;通过perl程序、MapDRAW及GSDS工具进行基因结构及染色体定位分析;利用已有的番茄芯片数据进行组织表达谱和基因表达响应分析。【结果】系统分析鉴定了 46 个番茄LBD 家族基因,根据基因结构及系统进化分析将其分成class I与class II两类,细分为5个亚家族（Ia、Ib、Ic、Id与II）。基因定位表明,12 条染色体中的 10 条均有LBD 基因,该基因家族的分布具有广泛性。各个发育阶段表达谱的分析结果表明,LBD 家族基因具有不同的组织表达模式,在各个发育时期均有LBD 基因的表达。基因响应分析发现,不同LBD基因响应不同的外界信号。【结论】通过全基因组分析,番茄LBD家族基因包括 46 个成员,在进化上分为两大类,5 个亚家族,分布于 10 条染色体上,组织表达模式及基因响应具有多样性。这些信息为番茄LBD基因家族的功能分析奠定了基础。     

薄壳山核桃全基因组LBD基因家族的生物信息学分析

  目的  研究薄壳山核桃Carya illinoensis LBD基因家族结构特征、进化模式和在胚发育过程中的表达模式。  方法  运用生物信息学手段鉴定薄壳山核桃LBD基因,分析该基因结构特征、系统发生学关系、显花植物中的进化历史和在胚发育过程中3个关键阶段的表达模式。  结果  薄壳山核桃全基因组中一共鉴定到52个候选LBD基因。根据基因结构、系统发生学最大似然树和Motif分析可分为3类:GroupⅠ、GroupⅡ和GroupⅢ。多序列比对分析中,52个LBD基因LOB结构域中鉴定出3个重要的结构:CX₂CX₆CX₃C锌指结构、高度保守的甘氨酸GAS结构和亮氨酸拉链(zipper-like)结构,并且在3类内都分别发生了特异性的的变异或者缺失。根据代表性显花植物LBD基因家族的系统发生学分析,从变异程度看GroupⅠ和GroupⅡ相对较为保守,而GroupⅢ内的所有LBD基因共享1支较长的分支,它们已发生了较大的变异,可能已经分化出新的功能。表达分析结果显示:LBD基因家族参与调控胚发育过程,通常控制子叶的发育和形态建成。薄壳山核桃LBD基因中又有在整个胚发育过程中都高表达的一簇基因,这些基因可能在胚发育过程中发挥了更加重要的作用。  结论  薄壳山核桃全基因组中共获得LBD基因52个,共可分为3个亚家族,不同的亚家族具有不同的基因结构、蛋白质结构、进化模式和表达模式,转录组表达分析显示:不同亚家族之间在胚发育不同阶段具有差异性表达,它们共同参与调控薄壳山核桃胚发育过程。图5表2参47     

A single amino acid mutation contributes to adaptive beach mouse color pattern

Natural populations of beach mice exhibit a characteristic color pattern, relative to their mainland conspecifics, driven by natural selection for crypsis. We identified a derived, charge-changing amino acid mutation in the melanocortin-1 receptor (Mc1r) in beach mice, which decreases receptor function. In genetic crosses, allelic variation at Mc1r explains 9.8% to 36.4% of the variation in seven pigmentation traits determining color pattern. The derived Mc1r allele is present in Florida's Gulf Coast beach mice but not in Atlantic coast mice with similar light coloration, suggesting that different molecular mechanisms are responsible for convergent phenotypic evolution. Here, we link a single mutation in the coding region of a pigmentation gene to adaptive quantitative variation in the wild.     

逍遥抗癌解郁方对乳腺癌并发抑郁症小鼠海马CRHR1、GR、BDNF mRNA表达的影响

目的 研究复方中药逍遥抗癌解郁方对乳腺癌并发抑郁症（breast cancer related depression,BCRD）小鼠海马促肾上腺皮质激素释放激素受体1（corticotropin releasing hormone receptor 1,CRHR1）、糖皮质激素受体（glucocorticoid receptor,GR）、脑源性神经营养因子（brain-derived neurotrophic factor,BDNF） mRNA的调控作用,阐明其对海马组织的可能保护机制。方法 通过腋下注射4T1炎性乳腺癌细胞联合背部皮下注射皮质酮建立BCRD小鼠模型并随机分为模型组、紫杉醇组、紫杉醇+氟西汀组、逍遥抗癌解郁方组、紫杉醇+逍遥抗癌解郁方组,同时设正常组。采用悬尾实验和强迫游泳实验检测小鼠抑郁样行为,HE染色观察小鼠海马的病理结构变化,实时荧光定量PCR检测CRHR1、GR、BDNF mRNA的表达。结果 与正常组相比,模型组小鼠悬尾实验、强迫游泳实验中不动时间显著增加（P<0.01）,海马结构损伤明显,GR、BDNF mRNA表达显著下降（P<0.01）,CRHR1 mRNA表达显著上升（P<0.01）;给予逍遥抗癌解郁方干预后,模型小鼠悬尾实验、强迫游泳实验中不动时间下降（P<0.05）,海马结构损伤得以恢复,GR、BDNF mRNA表达显著上升（P<0.01）、CRHR1 mRNA表达显著下降（P<0.01）。结论 逍遥抗癌解郁方可以改善BCRD小鼠的抑郁症状,保护海马组织,其作用机制与上调GR、BDNF和下调CRHR1的mRNA表达有关。