根癌农杆菌介导的玉米幼胚遗传转化体系

为建立以潮霉素为选择标记的农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导的玉米高效遗传转化体系,本研究利用携带p MDC141-CYP79A1(含GUS基因)质粒的农杆菌浸染玉米A188幼胚,共培养7d后通过GUS基因瞬时表达率,研究农杆菌的菌液浓度、热激时间和浸染时间等因素对玉米幼胚遗传转化效率的影响。研究结果表明:随着农杆菌的菌液浓度的增加、热激时间和浸染时间的延长,GUS表达效率均呈现先增后减的趋势;当农杆菌菌液的OD_(600)为0.8、热激预处理时间3min和浸染时间5min时,其GUS瞬时表达率均最高,分别为46.8%、46.4%和51.7%。并在最佳条件下将GUS基因转入到玉米幼胚,以潮霉素为选择标记,进行3次选择培养,将重新分化的抗性愈伤组织进一步分化成苗,获得56株潮霉素抗性植株,经PCR分子鉴定,获得22株阳性植株,初步建立根癌农杆菌介导的高效玉米幼胚遗传转化体系,为以抗潮霉素基因作为筛选标记的玉米遗传转化和基因功能验证提供技术基础,获得的抗潮霉素转化植株为玉米育种提供新材料。     

农杆菌介导的紫穗槐茎段愈伤组织遗传转化研究

采用农杆菌介导法对紫穗槐茎段诱导的愈伤组织进行遗传转化研究。确定了卡那霉素临界耐受浓度为40mg/L。菌液浓度与侵染时间的正交试验结果表明:侵染菌液OD600为0.8、侵染时间为30min时转化效率最高,达17.95%。GUS染色检测分析表明:含pBI121-GUS质粒DNA农杆菌侵染转化的愈伤组织其抗性不定芽和再生植株根和叶均呈蓝色。转化植株叶PCR检测结果表明外源GUS基因已整合到紫穗槐基因组中。以上结果表明建立了以茎段诱导愈伤组织为转化受体、农杆菌介导的紫穗槐高效遗传转化体系。为了验证其可重复性,又进行了pBI121-GFP基因的转化,T0代再生植株PCR检测整合率达85%,在488nm蓝光源激发下转化株的顶芽产生绿色荧光,说明转入的基因在35S启动子下过量表达。此遗传转化体系可应用于转基因育种。     

根癌农杆菌介导的葡萄风信子遗传转化体系

【目的】以葡萄风信子亚美尼亚(Muscari armeniacum)的胚性愈伤组织为受体系统,建立高效稳定的葡萄风信子遗传转化体系,为葡萄风信子遗传改良及相关基因功能的研究奠定基础。【方法】通过GUS(β-葡萄糖苷酸酶)瞬时表达率,研究根癌农杆菌的菌液浓度、侵染时间、共培养时间和超声波预处理时间等4个因素对葡萄风信子GUS瞬时表达效率的影响,并在最佳条件下将GUS基因转入葡萄风信子,获得稳定表达转化植株。【结果】葡萄风信子胚性愈伤组织GUS染色结果表明,随着根癌农杆菌菌液浓度的增加及侵染时间、共培养时间和超声波预处理时间的延长,GUS瞬时表达效率均呈现先增后降趋势;当根癌农杆菌菌液OD600为0.5、侵染时间20min、共培养4d、80W功率超声波预处理3min时,其GUS瞬时表达效率最高,分别为14.43%,13.73%,10.85%和75.36%;在最佳转化体系下将GUS基因转入葡萄风信子,获得207株潮霉素抗性植株。GUS组织化学检测结果表明:在抗性植株的不同部位都呈现不同程度的蓝色,PCR检测有7株为阳性植株,阳性率为7%;反转录PCR检测显示,7株阳性植株中有3株扩增出GUS基因目的条带。【结论】初步建立了根癌农杆菌介导的葡萄风信子遗传转化体系,该体系能显著提高葡萄风信子GUS瞬时表达效率。     

种子真空侵染法遗传转化体系的建立与优化

针对植物遗传转化体系中周期长、表达效率低等的局限性,在拟南芥中建立并优化了一种新的遗传转化体系,称为发芽种子真空侵染法。以发芽种子作为真空侵染的材料,在拟南芥中成功地表达了β-葡萄糖苷酸酶(β-Glucuronidase,GUS),并对影响基因表达的侵染条件进行了优化。结果表明:当农杆菌细胞浓度(OD_(600))为1.2,真空泵的压强为0.07 MPa时,植物中GUS基因的表达效率更高。RT-PCR检测结果表明,利用这种体系在紫花苜蓿(Medicago sativa L.)中有效表达了外源基因GUS。这种体系具有快速和高效的优势,为农杆菌介导的植物遗传转化体系提供了新的途径。     

农杆菌介导茎尖转化体系对不同基因型棉花转化率的影响

选用两种不同基因型陆地棉华抗6号和06S62为材料,以无菌黄化苗茎尖为受体,用农杆菌介导法进行转化,对不同的菌液浓度、浸染时间和负压处理等进行了比较试验,探讨农杆菌介导对两种不同基因型棉花遗传转化率的影响.结果表明,农杆菌介导棉花转化的适宜条件是:对于华抗6号,菌液浓度OD600达到0.7、浸染时间10 min、负压处理10 min时,转化效果较好;对于06S62,菌液浓度OD600达到0.9、浸染时间15-min、负压处理15 min时,转化效果较好;华抗6号的转化率高于06S62,其最高转化率为8.81%.通过该茎尖遗传转化体系,将bar导入上述两种基因型棉花获得了抗除草剂的转基因植株.     

农杆菌介导台农17号菠萝遗传转化相关因素优化

为建立稳定的农杆菌介导的菠萝遗传转化体系,以台农17号菠萝幼嫩愈伤组织为试验材料,以GUS基因瞬时表达率为遗传转化效果评价指标,应用单因素试验法,研究了卡那霉素对台农17号菠萝愈伤组织不定芽分化的影响以及不同菌株、菌液浓度、共培养时间和乙酰丁香酮的添加等转化相关因素对菠萝遗传转化的影响.结果表明,80mg/L卡那霉素浓度可完全抑制不定芽分化,农杆菌菌株采用LBA4404,菌液浓度OD600为0.8,共培养4d时遗传转化效果最佳,GUS基因瞬时表达率达到39.44％,而菌液中添加乙酰丁香酮未明显提高GUS基因瞬时表达率.研究初步建立了农杆菌介导的台农17号菠萝遗传转化体系,为开展菠萝关键基因功能验证和品种改良搭建了遗传转化平台.     

露地菊脚芽农杆菌真空渗透转化技术体系的建立

[目的]建立露地菊脚芽农杆菌真空渗透转化技术体系,为菊花品质改良提供参考依据.[方法]采用农杆菌真空渗透和浸染转化法对露地菊火焰的脚芽进行目的基因遗传转化,分析其PCR结果,以抗性分化苗叶片进行β-葡萄糖苷酸酶(β-glucuronidase,GUS)组织染色验证转基因植株,分析农杆菌真空渗透转化率.[结果]将含AtLFY基因和AtCO基因的表达载体分别转入露地菊根部脚芽中,通过PCR检测GUS染色鉴定后,真空渗透1次的平均转化率为11.97%,真空渗透2次的平均转化率为15.86%,菌液浸染10 min的平均转化率为3.64%,菌液浸染20 min的平均转化率为11.14%,总体嵌合率为14.58%.[结论]建立的露地菊脚芽农杆菌真空渗透转化技术体系对露地菊的遗传转化效率高,可操作性强.     

芦笋茎尖遗传转化体系的建立与优化

通过优化根癌农杆菌 EHA105(含有pBI121表达载体)介导的茎尖遗传转化条件,包括抑菌抗生素类型及浓度、农杆菌浓度、侵染时间、共培养时间、卡那霉素浓度等影响因素,建立芦笋品种‘达宝利’遗传转化体系。以0.1～0.3 cm长的芦笋茎尖为转化受体,用MS液体培养基(MS+蔗糖3%+乙酰丁香酮150μmol·L~(-1))悬浮菌体至OD_(600)为0.6,侵染茎尖15 min,20℃避光共培养4 d;抗性茎尖在筛选培养基(1/2 MS+IBA 0.5mg·L~(-1)+KT 0.1mg·L~(-1)+嘧啶醇0.5mg·L~(-1)+羧苄青霉素200mg·L~(-1)+卡那霉素50mg·L~(-1))上诱导长芽与生根,可获得抗性植株,经PCR、 GUS组织化学染色和qRT-PCR检测,获得阳性植株。     

基于GUS基因瞬时表达优化云南杜鹃(Rhododendron yunnanense Franch.)遗传转化方法

本研究以云南杜鹃无菌叶片和愈伤组织为受体材料,运用正交试验设计,通过组织染色分析法研究了预培养时间、菌液密度、侵染时间、共培养时间对农杆菌介导的GUS基因瞬时表达的影响。结果表明:叶片是云南杜鹃较理想的遗传转化受体材料,无菌叶片预培养0 d,菌液OD_(600)值0.5,侵染时间40 min,共培养5 d,GUS基因瞬时表达率最高,平均表达率为70%。试验结果为云南杜鹃遗传转化研究提供了快速可靠的依据。     

棉花茎尖农杆菌转化体系的建立

[目的]建立高效的以草甘膦为选择剂的棉花茎尖农杆菌遗传转化体系。[方法]以中棉35号、中棉27号、石远321和珂字312号4个陆地棉品种茎尖为遗传转化受体材料,采用农杆菌介导转化法,结合草甘膦筛选,探讨了影响棉花茎尖遗传转化效率的几个重要因素。[结果]棉花茎尖对草甘膦极为敏感,所有品种棉花茎尖均在60μmol／L草甘膦浓度下停止生长。对茎尖用OD600=1．0菌液浸染20min、预培养2d、恢复培养1周和共培养72h的处理能显著提高棉花遗传转化效率。对所有成活转基因棉株进行PCR检测的结果表明,所有植株均能扩增出目的基因aroA—M1 1．3kh的特定条带。[结论]该研究为进一步加速转基因棉花的产业化进程奠定基础。     

农杆菌介导玉米幼胚遗传转化体系的建立

以玉米(Zea mays L.)HiII的幼胚为外植体,β-葡萄糖苷酸酶基因(GUS)为报告基因,通过农杆菌介导转化法对影响遗传转化体系的外植体大小、农杆菌浓度、热预处理温度、侵染时间、共培养及恢复培养时间、抗生素、筛选剂等因素进行优化,以建立农杆菌介导玉米幼胚遗传转化体系。结果表明,幼胚大小为1.0~1.5 mm,农杆菌菌液的OD600 nm为0.5,40℃热处理3 min,侵染8 min,共培养3 d和恢复培养4 d,100 mg/L羧苄青霉素作为抑菌剂,双丙氨膦作为筛选剂时为最佳遗传转化条件。通过该优化体系已获得多种转基因玉米材料,表明该体系具有较高的可重复性和可靠性。     

正交设计优化根癌农杆菌介导的玉米遗传转化体系

采用GUS基因瞬时表达检测的方法,利用正交试验法对玉米根癌农杆菌介导的玉米遗传转化体系的菌液OD值、侵染时间、AS浓度、共培养时间4个因素在3个水平上进行优化试验。通过对试验结果进行直观分析,方差分析和因素内多重比较分析,得到了稳定的转化体系,即菌液OD值0.6,侵染时间30min,AS浓度200μmol/L,共培养时间2d。采用优化后的玉米转化体系进行试验,通过PCR验证,得到了转基因植株,初步建立了农杆菌介导的玉米遗传转化体系。     

农杆菌介导茄子叶转基因体系的建立

本文选择3份茄核心种质,研究Hyg B浓度、农杆菌浓度(OD600)、侵染时间、共培养时间对茄遗传转化效果的影响。同时,选择7份核心种质进行转化研究,以确定茄遗传转化的最佳受体。结果表明,筛选阳性植株的最适Hyg B浓度为50mg/L;菌液浓度(OD_(600))0.6,侵染外植体15min和共培养4d时,抗性愈伤百分率最高;获得的Hyg B抗性植株,经PCR检测及GUS组织化学鉴定,确认外源基因GUS已成功整合到茄基因组中;不同茄遗传型转化效果差异较大,最高转化率可达到10%。     

绿色棉花再生体系研究(摘要)(英文)

[目的]对农杆菌法介导的绿色棉花茎尖转化体系进行筛选优化,为基因工程辅助彩棉育种提供参考。[方法]以天然绿色棉花的茎尖作为受体,采用农杆菌介导的转化方法,筛选绿棉茎尖再生体系的最佳条件,包括茎尖外植体最佳苗龄的筛选,激动素(KT)最适浓度的筛选,卡那霉素(Kan)敏感浓度的筛选,农杆菌菌液最佳侵染浓度的筛选以及真空渗透条件的优化筛选。[结果]3日龄的绿棉茎尖为最佳转化外植体;在OD600值为0.5的农杆菌菌液中侵染10min,同时辅助真空渗透的侵染效果最佳;在茎尖最适培养基MS+lmg/LKT,pH值5.8上共培养24h,转至Kan浓度梯度为30、50、70mg/L的筛选培养基上选择培养,茎尖分化苗阳性率达34.6%,并获得了绿棉9804的Kan阳性苗。[结论]绿色棉花比白色棉花更有利于进行遗传转化。     

农杆菌介导的VgDGAT1a基因棉花茎尖转化体系优化研究

为了将斑鸠菊(Vernonia galamensis)二酰甘油酰基转移酶基因(VgDGAT1a)导入棉花,创制转基因高油棉花种质,优化建立农杆菌介导的棉花茎尖转化体系,以‘中棉所49’茎尖为外植体,以HptⅡ基因为筛选标记,VgDGAT1a为目的基因,用农杆菌介导法,研究外植体培养时间、浸菌侵染时间、共培养时间及吸光度A600值等对棉花茎尖转化的影响。结果表明,在外植体培养3～5d、生长点纵切、菌液吸光度A600值0.6～0.9、浸菌40～60min、浸菌后暗培养1d和使用MSB+活性炭1g/L+头孢霉素400mg/L作为生根培养基的条件下能高效获得再生转化植株,从而为转基因高油棉花种质的创制提供了一种有效的方法。     

绿色棉花再生体系建立的研究

[目的]对农杆菌法介导的绿色棉花茎尖转化体系进行筛选优化,为基因工程辅助彩棉育种提供参考。[方法]以天然绿色棉的茎尖作为受体,采用农杆菌介导的转化方法,筛选绿棉茎尖再生体系的最佳条件。[结果]3日龄的绿棉茎尖为最佳转化外植体;在OD600值为0.5的农杆菌菌液中侵染10 min,同时辅助真空渗透的侵染效果最佳;在茎尖最适培养基MS＋l mg/LKT,pH值5.8上共培养24 h,转至Kan浓度梯度为30-50-70 mg/L的筛选培养基上选择培养,茎尖分化苗阳性率达34.6%,并获得了绿棉9804的Kan阳性苗。[结论]绿色棉花比白色棉花更有利于进行遗传转化。     

农杆菌侵染条件对玉米单倍体遗传转化的影响

以玉米诱导系HHI69诱导玉米自交系获得的单倍体愈伤组织为受体材料,GUS基因为报告基因,采用农杆菌介导法进行遗传转化,对影响转化效率的侵染条件进行了研究。结果表明:继代8 d后的愈伤组织最适宜农杆菌转化;农杆菌菌株EHA105的侵染力好于LBA4404;侵染液浓度OD_(600)为0.7、侵染时间为30 min时,GUS瞬时表达率最高,达到了65.31%。     

根癌农杆菌介导的甘蔗遗传转化体系的研究

采用根癌农杆菌介导法将苏云金氏芽孢杆菌毒蛋白B.t基因cryIA转入甘蔗胚性愈伤组织中,建立农杆菌转化甘蔗的遗传转化体系,获得13棵再生植株。经GUS及PCR检测,cryIA确实已转移到甘蔗幼苗中,GUS在再生植株中也得到瞬时表达。     

根癌农杆菌介导的甘蔗遗传转化体系的研究

采用根癌农杆菌介导法将苏云金氏芽孢杆菌毒蛋白B.t基因cryIA转入甘蔗胚性愈伤组织中,建立农杆菌转化甘蔗的遗传转化体系,获得13棵再生植株。经GUS及PCR检测,cryIA确实已转移到甘蔗幼苗中,GUS在再生植株中也得到瞬时表达。     

农杆菌介导大豆萌动种子遗传转化的影响因素研究

[目的]提高农杆菌介导大豆遗传转化效率。[方法]以萌发1 d的半片大豆种子为目标组织,通过GUS瞬时表达检测,研究乙酰丁香酮、菌液的浓度及侵染时间对转化效率的影响。[结果]在共培养基中添加200μmol/L的乙酰丁香酮时,GUS瞬时表达效率最高。当农杆菌生长到对数生长期(D600 nm=0.5)时,转化效率最高,平均每个外植体上出现9.4个蓝色斑点。农杆菌侵染时间不宜过长,以30~60 min较好。[结论]乙酰丁香酮浓度、农杆菌菌液浓度和侵染时间均影响农杆菌介导大豆遗传转化效率。