根癌农杆菌介导的葡萄风信子遗传转化体系

【目的】以葡萄风信子亚美尼亚(Muscari armeniacum)的胚性愈伤组织为受体系统,建立高效稳定的葡萄风信子遗传转化体系,为葡萄风信子遗传改良及相关基因功能的研究奠定基础。【方法】通过GUS(β-葡萄糖苷酸酶)瞬时表达率,研究根癌农杆菌的菌液浓度、侵染时间、共培养时间和超声波预处理时间等4个因素对葡萄风信子GUS瞬时表达效率的影响,并在最佳条件下将GUS基因转入葡萄风信子,获得稳定表达转化植株。【结果】葡萄风信子胚性愈伤组织GUS染色结果表明,随着根癌农杆菌菌液浓度的增加及侵染时间、共培养时间和超声波预处理时间的延长,GUS瞬时表达效率均呈现先增后降趋势;当根癌农杆菌菌液OD600为0.5、侵染时间20min、共培养4d、80W功率超声波预处理3min时,其GUS瞬时表达效率最高,分别为14.43%,13.73%,10.85%和75.36%;在最佳转化体系下将GUS基因转入葡萄风信子,获得207株潮霉素抗性植株。GUS组织化学检测结果表明:在抗性植株的不同部位都呈现不同程度的蓝色,PCR检测有7株为阳性植株,阳性率为7%;反转录PCR检测显示,7株阳性植株中有3株扩增出GUS基因目的条带。【结论】初步建立了根癌农杆菌介导的葡萄风信子遗传转化体系,该体系能显著提高葡萄风信子GUS瞬时表达效率。     

农杆菌介导bar基因转化玉米幼胚的研究

通过农杆菌介导法,采用抗除草剂基因(bar)转化3个玉米自交系的幼胚,并对遗传转化影响因素进行优化。结果表明,2,4-D浓度为2 mg·L-1时,胚性愈伤组织诱导率较高;农杆菌最佳的侵染时间为20 min;乙酰丁香酮(AS)明显提高了幼胚的GUS瞬时表达频率,适宜浓度为200μmol·L-1;温和选择方法适于幼胚转化,不定芽诱导培养基、芽伸长培养基和生根培养基中潮霉素的浓度分别为8、6、2 mg.L-1;获得7株PCR检测以及除草剂抗性试验阳性植株。     

农杆菌介导的玉米幼胚遗传转化体系的建立

采用玉米幼胚为受体材料,利用农杆菌介导植物表达载体p CAMBIA1300-35S-GUS-Nos侵染玉米幼胚,以GUS基因瞬时表达率为指标,通过单因素试验及四因素三水平正交试验研究了基因型、幼胚大小、侵染菌液浓度及侵染时间对幼胚遗传转化率的影响。结果表明:各因素对幼胚遗传转化率影响的大小依次为基因型幼胚大小侵染菌液浓度侵染时间;最佳侵染组合基因型为H99、幼胚为1.1~2.0 mm、侵染菌液OD600=0.6、侵染时间为30 min,GUS基因对幼胚的瞬时表达率可达(34.44±1.11)%。     

农杆菌介导的2mG_2-epsps基因转化玉米自交系18-599R幼胚的研究

【目的】对农杆菌介导的抗草甘膦新基因2 mG2-epsps转化玉米18-599R幼胚的体系进行优化,以获得具有明显草甘膦抗性的转基因植株。【方法】以玉米18-599R幼胚为受体,采用农杆菌介导法,对转化时的预处理条件、菌液浓度×浸染时间、草甘膦筛选浓度设置处理,以优化转化体系;并用PCR、实时荧光定量PCR和喷洒草甘膦鉴定外源基因在转基因植株中的表达情况。【结果】热激处理对抗性愈伤率没有明显的提高作用,离心处理会降低抗性愈伤率;菌液浓度为OD600=0.6,浸染时间为10 min时,平均抗性愈伤率最高,为37.33%;草甘膦浓度为2.0mmol/L是比较理想的筛选浓度;实验共得到46株再生植株,5株PCR检测呈阳性,阳性率为10.87%;实时荧光定量PCR表明外源基因在T2代植株的根、茎、叶中均有表达;对T2代转基因植株喷洒1.5g/L的草甘膦,表现出耐受性。【结论】实验成功将2 mG2-epsps导入18-599R基因组,并获得了明显的草甘膦抗性。     

农杆菌介导水稻幼胚转化体系的建立

利用根癌农杆菌介导的转化方法对 3个粳稻品种的幼胚进行转化。在对影响根癌农杆菌转化水稻效率的多种因素进行比较研究后 ,优化转化条件 ,改进技术 ,建立了农杆菌介导的水稻幼胚转化体系。利用该体系 ,水稻品种秀水 11号的幼胚经预培养 4～ 7d得到的愈伤组织 ,用农杆菌EHA10 5 /pCAMBIA13 0 1感染后 ,筛选出潮霉素抗性愈伤组织并获得转化植株 ,潮霉素抗性愈伤组织获得率为 70 .76%。GUS染色及转基因植株总DNA的PCR检测结果表明 ,T -DNA上的外源基因已整合进了转基因水稻基因组中。     

农杆菌介导玉米幼胚遗传转化体系的建立

以玉米(Zea mays L.)HiII的幼胚为外植体,β-葡萄糖苷酸酶基因(GUS)为报告基因,通过农杆菌介导转化法对影响遗传转化体系的外植体大小、农杆菌浓度、热预处理温度、侵染时间、共培养及恢复培养时间、抗生素、筛选剂等因素进行优化,以建立农杆菌介导玉米幼胚遗传转化体系。结果表明,幼胚大小为1.0~1.5 mm,农杆菌菌液的OD600 nm为0.5,40℃热处理3 min,侵染8 min,共培养3 d和恢复培养4 d,100 mg/L羧苄青霉素作为抑菌剂,双丙氨膦作为筛选剂时为最佳遗传转化条件。通过该优化体系已获得多种转基因玉米材料,表明该体系具有较高的可重复性和可靠性。     

高羊茅转OsWAX2—1基因的研究

以高羊茅品种强劲为受体材料,通过农杆菌介导法将OsWAX2-1,基因导入高羊茅胚性愈伤组织,建立了农杆菌介导的高羊茅遗传转化体系,获得了转OsWAX2-1基因高羊茅植株.最优化参数为:预培养3 d,农杆菌工程菌液OD600=0.8,pH值5.2,浸染时间30min,100μM乙酰丁香酮,共培养时间3 d,潮霉素延迟筛选10d.     

根癌农杆菌介导的甘蔗遗传转化体系的研究

采用根癌农杆菌介导法将苏云金氏芽孢杆菌毒蛋白B.t基因cryIA转入甘蔗胚性愈伤组织中,建立农杆菌转化甘蔗的遗传转化体系,获得13棵再生植株。经GUS及PCR检测,cryIA确实已转移到甘蔗幼苗中,GUS在再生植株中也得到瞬时表达。     

根癌农杆菌介导的甘蔗遗传转化体系的研究

采用根癌农杆菌介导法将苏云金氏芽孢杆菌毒蛋白B.t基因cryIA转入甘蔗胚性愈伤组织中,建立农杆菌转化甘蔗的遗传转化体系,获得13棵再生植株。经GUS及PCR检测,cryIA确实已转移到甘蔗幼苗中,GUS在再生植株中也得到瞬时表达。     

根癌农杆菌介导的玉米萌动胚NPR1基因遗传转化

以玉米萌动胚为外植体,研究了影响根癌农杆菌介导的玉米NPR1基因遗传转化的若干因素。结果表明,在感染液和共培养基中分别都加入100μmol/L乙酰丁香酮,根癌农杆菌LBA4404的菌液,浸染时间12 h,40 mg/L潮霉素进行转化苗筛选,为转化的适宜条件。对转化苗进行PCR检测,证明外源目的基因已整合到玉米基因组中。     

Hi-Ⅱ玉米的NGc抗虫基因遗传转化研究

为促进转基因抗虫玉米研究,通过农杆菌介导的玉米幼胚遗传转化法将目的基因转入玉米材料Hi-Ⅱ中,通过外植体侵染、共培养以及分化筛选,培养具有CryNGc抗虫基因的玉米植株,并研究外源基因在后代的遗传表达及抗性情况.结果表明:玉米幼胚大小在1.2～1.8mm时侵染效果最好,并成功获得了10株具有Cry NGc抗虫基因的阳性...     

农杆菌介导台农17号菠萝遗传转化相关因素优化

为建立稳定的农杆菌介导的菠萝遗传转化体系,以台农17号菠萝幼嫩愈伤组织为试验材料,以GUS基因瞬时表达率为遗传转化效果评价指标,应用单因素试验法,研究了卡那霉素对台农17号菠萝愈伤组织不定芽分化的影响以及不同菌株、菌液浓度、共培养时间和乙酰丁香酮的添加等转化相关因素对菠萝遗传转化的影响.结果表明,80mg/L卡那霉素浓度可完全抑制不定芽分化,农杆菌菌株采用LBA4404,菌液浓度OD600为0.8,共培养4d时遗传转化效果最佳,GUS基因瞬时表达率达到39.44％,而菌液中添加乙酰丁香酮未明显提高GUS基因瞬时表达率.研究初步建立了农杆菌介导的台农17号菠萝遗传转化体系,为开展菠萝关键基因功能验证和品种改良搭建了遗传转化平台.     

IPT基因遗传转化谷秆两用稻的研究

采用农杆菌介导的方法,将嵌合基因PSAG12-IPT导入谷秆两用稻201幼胚诱导的胚性愈伤组织中,经潮霉素筛选,抗性愈伤分化成苗,共获得46个抗性愈伤克隆,126株转基因植株.对这些植株进行PCR检测和GUS染色分析,确定其中80株为阳性植株.     

根癌农杆菌介导 hGLP1基因转化摩尔多瓦葡萄的研究

以摩尔多瓦葡萄早期体细胞胚为受体,通过农杆菌介导辅以超声波处理转化 hGLP1基因。结果表明,摩尔多瓦葡萄体细胞胚的卡那霉素临界致死质量浓度为10 mg/L,农杆菌浸染时辅以超声波处理可显著提高GUS瞬时表达效率（高达69.4%）。采用此体系对摩尔多瓦葡萄进行转化,获得高瞬时表达和稳定表达的转化子,进一步筛选培养获得7株抗性再生植株。利用PCR扩增的方法进行检测,其中2株PCR检测呈阳性,初步证实 hGLP1基因已整合到摩尔多瓦葡萄基因组。     

超声波辅助农杆菌转化OT百合‘罗宾娜’的研究

【目的】通过超声波处理辅助农杆菌转化OT百合小鳞片,提高农杆菌介导法转化百合的效率。【方法】以OT百合‘罗宾娜’(Lilium tenuifoliumoriental×tumpet‘Robina’)的再生小鳞片为外植体,分别以80W功率的超声波处理1,2,3,4,5min,通过超声波处理辅助根癌农杆菌进行外源基因的转化,同时以未进行超声波处理为对照;利用GUS组织化学法,分别检测转化脱菌后筛选培养7d的外植体和筛选培养60d后形成的潮霉素抗性再生植株叶片、小鳞片、根系的GUS瞬时表达和稳定表达,提取潮霉素抗性植株基因组DNA进行GUS和HPT基因的PCR扩增分析。【结果】超声波处理的农杆菌介导转化的百合外植体经GUS组织化学染色,多数可见蓝色斑点,且以3min超声波处理的蓝色最深;3min超声波处理的外植体对潮霉素的抗性率最高达48.85%,未经超声波处理的仅为15.56%,二者差异达显著水平。从53个潮霉素抗性再生植株的DNA样品中扩增得到了GUS基因和HPT基因的扩增片段,其中超声波处理3min的PCR阳性植株转化率最高,为28.30%,而未进行超声波处理的PCR阳性植株转化率仅为5.66%,初步证明外源基因可能整合到百合基因组中。【结论】20℃条件下80W功率超声波处理3min,可以有效提高农杆菌介导法转化OT百合的效率。     

Agrobacterium-mediated Cryl Ab/Ac gene transformation in maize

转基因技术的迅速发展有效地打破了物种间的遗传壁垒,从而加快了优良基因定向聚合的进程,然而遗传转化率低及转基因安全问题成为制约其进一步发展的限制因素.基于此,本研究以玉米自交系H99为材料,将Ac/Ds双元表达载体(包含抗虫Cryl Ab/Ac基因和gfp报告基因等)通过农杆菌介导法转入由110粒玉米幼胚诱导出的愈伤组织中,获得28株抗性转基因植株.经PCR及RT-PCR的验证结果显示,其中8株为含有Cryl Ab/Ac目的基因且该基因有效表达的阳性植株,转化效率达7％.通过农杆菌介导法所获得的玉米转基因植株为今后剔除抗生素筛选标记,从而获得安全的玉米抗虫新种质提供了遗传材料.     

反义Waxy基因转化籼稻9311的初步研究

以籼稻品种9311为材料,研究了不同诱导培养基对籼稻9311的诱导率,以及农杆菌浓度、浸染时间和干燥处理时间对抗性愈伤率的影响,进而采用农杆菌介导的共转化方法将含有反义Waxy基因的p13W8质粒和含有潮霉素抗性标记基因的p1300质粒同时转化受体材料.结果表明:籼稻9311成熟胚在含质量浓度为3.0 mg/L的2,4-D的N6基本培养基上具有较高的愈伤组织诱导率,且愈伤的胚性性状良好;愈伤组织在OD600值为0.6的农杆菌菌液中浸染10 min、干燥1.5～2.0 h处理后能够获得较多的抗性愈伤组织;对转化水稻的再生植株进行PCR检测表明,反义Waxy基因已整合进T0代水稻基因组中.     

正交设计优化根癌农杆菌介导的玉米遗传转化体系

采用GUS基因瞬时表达检测的方法,利用正交试验法对玉米根癌农杆菌介导的玉米遗传转化体系的菌液OD值、侵染时间、AS浓度、共培养时间4个因素在3个水平上进行优化试验。通过对试验结果进行直观分析,方差分析和因素内多重比较分析,得到了稳定的转化体系,即菌液OD值0.6,侵染时间30min,AS浓度200μmol/L,共培养时间2d。采用优化后的玉米转化体系进行试验,通过PCR验证,得到了转基因植株,初步建立了农杆菌介导的玉米遗传转化体系。     

口蹄疫抗原决定簇融合基因转化拟南芥初步研究

利用根癌农杆菌介导法将携带有0型和A型口蹄疫抗原决定簇融合基因O21-O14-A21的双元表达载体对拟南芥外植体进行遗传转化,并探讨了不同侵染时间和菌液浓度对农杆菌遗传转化效率的影响.通过潮霉素筛选,共获得522块抗性愈伤组织,经再生培养得到36棵再生苗,对部分再生植株进行PCR检测,结果表明目的基因已整合到拟南芥基因组中.     

高赖氨酸蛋白基因遗传转化水稻的研究

采用农杆菌介导的方法将高赖氨酸蛋白基因导入台粳9号幼胚诱导的胚性愈伤组织中,经潮霉素筛选,抗性愈伤分化成苗,共获得2株转基因植株.对这些植株及后代植株进行GUS染色和PCR及PCR Southern b lot检测分析,确定高赖氨酸蛋白基因已整合到台粳9号基因组中,并能稳定遗传表达.经检测,转基因水稻糙米赖氨酸含量为0.349%,比对照提高29.3%;转基因水稻秸秆赖氨酸含量为0.341%,比对照提高8.3%.