利用RNA沉默抑制子HC-Pro提高基因表达的策略

利用植物生物反应器生产药用蛋白具有独特的发展优势,但外源基因在受体内会发生基因沉默现象而影响基因的表达。由于基因沉默抑制子能有效抑制外源基因的沉默反应,本研究利用沉默抑制子蚜传辅助因子(helper component-proteinase,HC-Pro)转基因烟草有效提高了外源基因的表达。采用叶片注射法将携带表达载体p35S-30B-GFP的农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)重悬液分别侵染野生型烟草(Nicotiana bentamiana)和HC-Pro转基因烟草(N.bentamiana),通过蛋白电泳检测和Western blot检测技术对绿色荧光蛋白(GFP)表达进行比较。研究结果表明,与野生型烟草Nb相比,HC-Pro转基因烟草中GFP的表达水平显著增加。本研究为基因沉默抑制子在植物生物反应器中的应用提供了理论依据。     

非生物胁迫诱导拟南芥中防御基因表达的分子机制

以缺水处理、低温胁迫和盐胁迫的拟南芥(Arabidopsis thaliana)植物作为试验材料,采用实时荧光定量多聚核苷酸链式反应(RT-qPCR),检测水杨酸(SA)途径调控基因AtACD6和下游防御基因AtPR5的表达水平。分析结果证实了非生物胁迫处理的植物中这些防御基因的表达水平明显增加。亚硫酸盐测序结果证明非生物胁迫诱导AtACD6基因启动子区域的DNA去甲基化,导致该基因的转录激活。进一步研究证实,沉默抑制因子1(ROS1)介导的DNA去甲基化,在低温诱导AtACD6基因表达的过程中起重要作用。揭示了植物水杨酸途径防御基因应答非生物胁迫相关的分子机制中ROS1起重要作用,为探索植物适应不利环境的表观调控机制提供参考。     

种子真空侵染法遗传转化体系的建立与优化

针对植物遗传转化体系中周期长、表达效率低等的局限性,在拟南芥中建立并优化了一种新的遗传转化体系,称为发芽种子真空侵染法。以发芽种子作为真空侵染的材料,在拟南芥中成功地表达了β-葡萄糖苷酸酶(β-Glucuronidase,GUS),并对影响基因表达的侵染条件进行了优化。结果表明:当农杆菌细胞浓度(OD_(600))为1.2,真空泵的压强为0.07 MPa时,植物中GUS基因的表达效率更高。RT-PCR检测结果表明,利用这种体系在紫花苜蓿(Medicago sativa L.)中有效表达了外源基因GUS。这种体系具有快速和高效的优势,为农杆菌介导的植物遗传转化体系提供了新的途径。     

大豆解螺旋酶基因GH1的克隆与载体构建

非生物胁迫（高盐、低温、干旱）严重限制植物的生长与发育。研究表明,高等植物中的DEAD-box RNA解螺旋酶广泛参与植物非生物胁迫应答,过表达解螺旋酶基因可明显改良转基因植株的抗逆能力。目前,大豆的RNA解螺旋酶基因序列也已发现,但其具体功能还不明晰,有待进一步研究确定。本实验以大豆为实验材料,根据Genbank发表的RNA解螺旋酶基因GH1的序列设计引物,通过RT-PCR的方法将其体外扩增并构建相应的表达载体,为下一步的研究奠定基础。