红麻不育系与保持系基因组DNA甲基化比较分析

为分析红麻不育系中甲基化模式,以红麻不育系UG93A和保持系UG93B为试验材料,分别提取2个材料的苗期叶片、四分体时期和双核期花药的基因组DNA(gDNA),采用甲基化敏感扩增多态性(MSAP)技术和实时荧光定量PCR(qRT-PCR)方法分析比较其不同生长发育时期基因组DNA甲基化的变化规律,并研究甲基化变化基因的表达模式。结果表明:1)红麻生长发育过程中基因组DNA甲基化呈现一定的时空动态变化规律,不育系UG93A和保持系UG93B苗期叶片的甲基化率分别为56.79%(全甲基化率为44.25%,下同)和58.89%(43.24%);花药发育的四分体时期的甲基化率分别为48.08%(36.24%)和44.25%(33.22%);花药发育的双核期的甲基化率分别为45.30%(34.15%)和48.78%(37.98%);2)不育系UG93A基因组DNA的甲基化率在苗期最高、花药败育发生前的四分体期次之、败育后的双核期最低,在整个生长发育过程中呈现先高后低的趋势;保持系UG93B基因组DNA的甲基化率在苗期最高、花药发育的四分体期最低、双核期次之,在整个生长发育过程中呈现先高后低、再缓慢上升的趋势。保持系UG93B基因组DNA的甲基化水平总体上高于不育系UG93A,但在花药败育发生前的四分体时期,不育系的甲基化水平明显高于保持系;3)ATP8、SCL13、SRF6和植物磺肽素受体2等基因在不育系UG93A与保持系UG93B中存在甲基化差异。qRT-PCR分析结果表明,甲基化发生变化的基因在不育系和保持系之间的表达差异显著,推测这些基因的甲基化变化在红麻细胞质雄性不育(CMS)中发挥重要的作用。     

红麻线粒体基因NAD3和COB的RNA编辑与表达分析

以红麻细胞质线粒体近等基因系UG93A(不育系)、UG93B(保持系)及UG93A×福红992(恢复系)的F1代为材料,研究花药线粒体基因NAD3和COB的转录与表达。结果发现,在3种供试材料中,基因NAD3的CDS区在DNA水平和RNA编辑水平上均无差异;不育系与保持系的COB基因DNA编码序列无差异,但在RNA水平上发生了编辑,8个位点的编辑均发生于密码子的第一或第二位碱基,且导致氨基酸种类变化,主要为亲水性氨基酸转变为疏水性氨基酸;COB基因在UG93A中的RNA编辑频率低于UG93B;NAD3和COB基因在3种材料中的转录本大小基本相同,但在表达水平上表现为不育系显著低于保持系和F1代。由此推测NAD3和COB基因在红麻花药发育过程中有着重要的作用。     

水稻线粒体基因atp6启动子突变导致的一种细胞质雄性不育型

内江杂交水稻科技开发中心从恢复系 "万恢88/内恢92-4" 杂交组合F2代不育株选育的细胞质不育系,被暂时定名为"万恢88型水稻细胞质雄性不育系".利用PAGE电泳、琼脂糖凝胶电泳和克隆测序等技术对其不育系和保持系线粒体基因组进行研究,分析其雄性不育的分子基础和分子机理.通过PAGE电泳发现,其不育系线粒体基因组PCR带型与野败型(WA)、印水型(ⅡA)、D型(Di)、冈型(GA)存在差异.对其不育系内香2A和保持系内香2B的差异片段回收测序,获得两条667 bp长度的mtDNA片段2A和2B,通过序列比对和电子杂交分析,获得片段为atp6基因的部分序列及其上游序列.2A和2B相比有3个碱基不同,分别是第57位G→T,第100位T→C,第161位C→T.功能分析第100 位T-C点突变使atp6基因启动子核心序列遭到破坏.通过对atp6基因上游序列的RT-PCR分析,发现不育系内香2A的atp6基因不能正常表达.故而推测万恢88型水稻细胞质雄性不育是由于不育系线粒体atp6基因核心启动子区域发生点突变,导致atp6基因不能正常转录,致使线粒体供能不足,最后导致花粉败育.     

红麻细胞质雄性不育系UG93A和保持系UG93B cox1的克隆和表达分析

利用hiTAIL-PCR技术扩增红麻cox1全长及侧翼序列,结果表明,在红麻不育系UG93A和保持系UG93B中分别获得长度为2 149和3 244bp的序列,包含cox1基因CDS全长及其5′和3′部分侧翼序列,通过分析得出不育系和保持系中cox1的CDS序列长度为1 602bp,编码533个氨基酸残基,分子量为58.31ku。BLAST序列比对发现,UG93A和UG93Bcox1的CDS序列虽然存在4个碱基差异,但推导的氨基酸序列一样,并且UG93A和UG93Bcox1两端侧翼序列结果一致。RNA Blot分析显示cox1基因在红麻UG93A、UG93B和F1(UG93A/992)的转录本大小基本相同,推测cox1基因不是导致红麻CMS(cytoplasmic male sterility)的直接因子。qRT-PCR结果表明,UG93A中cox1的表达量显著低于UG93B和F1(UG93A/992),推测cox1在红麻花粉发育能量代谢过程中有着重要的作用。     

红麻线粒体基因atp6过表达载体的构建与转化

【目的】构建红麻线粒体基因atp6过表达载体遗传转化体系,为红麻线粒体基因的遗传转化及功能研究打下基础。【方法】以红麻UG93A花药cDNA为模板,通过同源克隆技术克隆atp6基因编码区(CDS)的全长序列;利用In-Fusion基因融合技术构建植物过表达载体,通过农杆菌介导法转化野生型烟草,并对转基因阳性烟草植株进行抗性筛选和PCR验证。【结果】红麻UG93A的atp6基因CDS全长为1182 bp,成功构建红麻atp6基因全长过表达载体pBI121-atp6-EGFP,并获得4株转基因烟草植株(B1、B2、B3和B4),使用过表达载体上3对不同位点的引物组合对转基因植株进行PCR验证,发现有2株转基因烟草植株在3对不同引物中稳定表达,即获得2株含pBI121-atp6-EGFP的T_0代转基因阳性植株(B1和B2)。【结论】构建的红麻线粒体基因atp6过表达载体遗传转化体系,可用于指导后续atp6基因调控红麻细胞质雄性不育(CMS)分子机理研究。     

洋葱atp6基因的克隆与系统进化分析

细胞质雄性不育(CMS)在作物遗传育种研究中占有重要地位,多种植物的细胞质雄性不育均与线粒体基因结构变异及新嵌合基因的产生有关。为探索线粒体atp6基因与洋葱CMS的关系,以13份不育系和11份保持系为材料克隆洋葱atp6基因编码序列,测序结果表明不同材料atp6基因间存在一个C/A多态性位点,该多态性位点在不育系和保持系间随机出现,而不是不育系与保持系的特征差异。蛋白质分析表明这一多态性位点的变异并未改变atp6蛋白跨膜结构。进一步的蛋白比对分析揭示了atp6蛋白在物种间有一定的保守性,特别是第IV跨膜结构域的Arg在所有物种中是高度保守的,也是H+转运所必需的。基于atp6蛋白序列的系统进化树显示细菌和病毒位于树的基部,其次是真菌、低等藻类以及原生生物,然后高等藻类、苔藓和蕨类,高等绿色开花植物处于树的顶端,单子叶植物处于树的最顶端。     

棉花线粒体atp9基因的克隆和转录研究

以三系杂交棉胞质雄性不育系P30A、保持系P30B和恢复系Y18为材料,通过Tail-PCR从可育胞质获得线粒体atp9基因序列,并利用Northern blot分析了atp9基因在棉花幼蕾的的转录情况。结果显示:在三系中atp9基因均存一个0.5 kb的强杂交带和一个1.0 kb的弱杂交带,杂交结果无明显差异;三系中atp9基因编码区共有7个编辑位点,第7个编辑位点密码子由于编辑转变为终止密码子使翻译提前终止;atp9基因在保持系中幼蕾的编辑频率要明显低于不育系和恢复系;发现atp9基因的编辑与棉花胞质形式相关,而且不同的核背景也会影响编辑率,推测线粒体atp9基因与棉花的胞质雄性不育具有一定的相关性,但有待更进一步分析。     

同核异质大豆叶绿体DNA的SNP分析

在前期对大豆细胞质雄性不育系JLCMS9A和其相应的保持系JLCMS9B这2个同核异质的材料叶绿体基因组高通量测序数据分析的基础上,以可育系细胞质PI437654(GenBank:DQ317523.1)和保持系JLCMS9B叶绿体基因组序列为对照,挖掘了不育系JLCMS9A叶绿体基因组特有的位于基因区和非编码区的SNP,并对不育系JLCMS9A基因区特有的2个SNP所对应基因的功能、结构及其对大豆育性可能的影响进行了分析。提取JLCMS9A和JLCMS9B的叶片RNA,对不育系JLCMS9A基因区特有的2个位于基因区的SNP基因进行了qPCR的表达分析,发现在不育系材料中matK基因表达量明显高于保持系,而ycf1基因表达量在不育系和保持系中相近,推测不育系JLCMS9A位于叶绿体基因区特有的SNP基因matK的表达,会对大豆育性产生影响。     

洋葱异源胞质雄性不育候选基因atp6的克隆与表达分析

以异源胞质洋葱不育系及其保持系为材料,克隆洋葱atp6基因,并对其在DNA、蛋白质二级结构和花发育各时期表达量等方面进行分析比较。结果表明:获得的atp6基因全长均为1414bp,与保持系进行序列比对发现,不育系开放阅读框第92碱基处由C突变为A,该突变导致编码氨基酸由酪氨酸突变为丝氨酸;二者编码的氨基酸在二级结构组成及蛋白质残基溶剂可接触性上也存在不同程度的差异;其表达量在小花蕾和大花蕾时差异不大,中花蕾时不育系却明显高于保持系,表达上调。     

棉花细胞质雄性不育系‘07-113A’与其保持系线粒体差异基因发掘与表达分析

为发掘棉花细胞质雄性不育相关基因,采用RFLP分子标记、Northern blot、同源克隆及RT-qPCR的方法,对离核木棉细胞质雄性不育系‘07-113A’及其保持系‘07-113B’进行线粒体差异基因发掘和表达分析。结果表明:1)以12个线粒体基因为探针,结合EcoRⅠ和HindⅢ2种限制性内切酶对不育系和保持系进行RFLP分析,发现atpA/EcoRⅠ及ccmB/EcoRⅠ2个基因/酶组合存在RFLP多态性;2)以atpA和ccmB为探针,对‘07-113A’和‘07-113B’进行Northern blot分析,检测到atpA、ccmB在不育系和保持系中转录本大小均相同;3)获得atpA的CDS全长及其部分侧翼序列,比对结果表明,不育系和保持系的atpA编码序列相同;与保持系相比,不育系5′端侧翼序列有2个碱基的变异,3′端侧翼序列有4个碱基的变异;4)RT-qPCR分析发现,不育系中atpA在败育后的表达量是保持系的0.44倍,极显著低于保持系。推测‘07-113A’花粉败育可能与atpA的异常表达相关。     

红麻雄性不育系的选育和不育基因的ISSR分子标记

 红麻不育系的选育为红麻杂种优势的利用提供了新的途径。红麻雄性不育基因的分子标记，可用于优良不育系或保持系的选择。采用单株选择回交的方法进行不育系的选择，用BSA法进行ISSR引物的筛选。利用中国农业科学院麻类研究所红麻育种课题组在海南三亚发现的红麻不育株AT-1做母本分别与15-4，04K1做杂交，再用父本回交4次，选育出2个高度不育的不育系。用CTAB法提取红麻单株DNA，利用BSA法构建近等基因池—不育池和可育池，以近等基因池DNA为模板，进行ISSR引物的筛选，筛选出一条能在不育池和可育池间产生稳定差异带的ISSR引物U859。对不育系鉴定表明，不育系为质核互作型雄性不育，且不育性稳定。通过不育和可育单株对ISSR引物的鉴定表明，U859是与雄性不育基因连锁的ISSR分子标记。     

AS型小麦雄性不育系研究初报

为了探求小麦新的不育类型,从普通小麦(T.aestivum L.)种内的一些品种和变种中,选取了10个具有不同特点的材料,以77(2)—1为共同亲本,进行了正反杂交和正反回交,并对其后代进行了考查。考查结果发现77(2)—1和印度矮生(T.sphaer-ococcum Perc.)的正反杂交后代和正反回交后代育性表现显著不同。当以77(2)—1做母本与印度矮生杂交时 F_1代表现为低不育,F_2代的育性发生分离,可育与不育的比例呈3:1。用印度矮生做父本与其 F_1代连续回交,则 BC_1、BC_2和 BC_3的后代全为不育株,从此便成为新的稳定的 AS 型小麦雄性不育系。由于新不育系是由栽培普通小麦的细胞质和印度矮生的核组配而成,故用此二变种名的第一个字母结合而命名为 AS 型。然而,反交结果大不相同。当以印度矮生做母本与77(2)—1杂交,F_1代表现育性正常,F_2代育性无分离,仍为全育。用77(2)—1做父本与其 F_1代连续回交,BC_1和 BC_2的后代也为全育。令人惊异的是:用反交 F_2代分离出来的性状与77(2)—1相似的可育单株,也能保持先正交、再回交后代中分离出来的全不育株,得到了全保持系。从上述初步结果可以看出:①栽培普通小麦种内某些品种或某些变种的细胞质存在着一定程度的分化,这种分化在特定的质核搭配组合中对育性能产生质的差异。②利用这种分化,为在普通小麦种内找到稳定的新不育质源以创造新型三系提供了可能。     

白菜型油菜细胞核雄性不育三系选育研究

在白菜型油菜细胞核雄性不育研究中,一般只能获得不育率50%的两型系.将两型系的相应保持株自交,自交子代100%可育的原两型系称杂合两型系;自交子代出现1/4不育株的原两型系称纯合两型系.用纯合两型系中的不育株,与杂合两型系内的可育株测交,可获得100%不育株的全不育系.全不育系与原父本回交,回交子代出现50%的可育株,所以把杂合两型系中的可育株称为临保系.用全不育系与恢复系测交,选育出强优势的杂种组合.     

陆地棉胞质雄性不育系与保持系线粒体基因组RFLP分析

【目的】研究棉花细胞质雄性不育（CMS）系与保持系线粒体基因组的差异,为克隆棉花CMS基因奠定基础。【方法】以atpA, atp6, atp9, ccmB, ccmC, ccmFN1, cob, coxI, coxII, coxIII, matR, nad1bc, nad2, nad4, nad5, nad6, nad7c, nad9, rpl5, rrn18等20个线粒体基因保守序列为探针,利用Southern blot方法对棉花细胞质雄性不育系、保持系线粒体基因组进行RFLP分析。【结果】发现atpA、atp9、ccmB、nad1bc、nad6、nad7c、rrn18等基因在棉花不育系和保持系间存在明显RFLP多态性,其中atpA的差异最明显。【结论】atpA是棉花CMS系和保持系线粒体基因组间的一个明显差异位点。CMS系比保持系缺失一个rrn18拷贝。     

白菜细胞核雄性不育基因向菜心品种早-49的转育研究

根据大白菜复等位基因遗传假说,利用现有白菜雄性不育系(99029-2)作为不育源,以早-49菜心品种为目标亲本,经过杂交、自交、测交、兄妹交等转育方法,将核不育基因向菜心品种转育,得到了含有早-49遗传基因的新甲型两用系、临时保持系和雄性不育系。     

甘蓝型油菜双低显性细胞核+细胞质雄性不育系DGCMS-3A的构建及遗传模式研究

 【目的】验证显性核不育两用系与波里马三系的基因型,明确Gd1AB和D3AB显性核不育的遗传模式,并构建显性细胞核+细胞质不育系统。【方法】通过显性核三系与波里马三系相互杂交验证其基因型,分析Mf和Rfc基因的等位性,采用临保系与显性纯合两用系×显性核不育恢复系F2代核不育株测交的方法,推论显性纯合两用系Gd1AB和D3AB的遗传控制模式。C3B为轮回父本与不育胞质的显性核不育株定向回交,以创建显性核不育+细胞质不育。【结果】鉴别了Gd1AB和D3AB的遗传控制模式,确定甘蓝型油菜显性纯合两用系Gd1AB由一对复等位遗传模式控制,而显性纯合两用系D3AB由两对基因互作控制。初步构建出双低显性杂合核不育+细胞质不育系统DGCMS-3A,并证实了选育显性纯合核不育+细胞质不育系的可行性。【结论】显性抑制基因Mf与波里马恢复基因Rfc不等位,Gd1AB的基因型为N（MsMsrfcrfc）×N（MsMfrfcrfc）),D3AB的基因型为N（MsMsmfmfrfcrfc）×N（MsMsMfmfrfcrfc）。显性核不育+细胞质不育可细分为四种遗传模式：双位点互作显性杂合核不育+细胞质不育[S（Msmsmfmfrfcrfc）+S（msmsmfmfrfcrfc）]、单位点复等位显性杂合核不育+细胞质不育[S（Msmfrfcrfc）+S（mfmfrfcrfc）]、双位点互作显性纯合核不育+细胞质不育[S（MsMsmfmfrfcrfc）+S（MsMsMfmfrfcrfc）]、单位点复等位显性纯合核不育+细胞质不育[S（MsMsrfcrfc）+S（MsMfrfcrfc）]。     

Application of Molecular Markers Linking to Cytoplasmic Male Sterile Loci to Assist Maintainer Line Selection and Their Selection Efficiency in Welsh Onion （Allium fistulosum L.）

Cytoplasmic male sterility exists widely in most natural populations of welsh onion （Alliumfistulosum L.）, which makes it possible to breed out many male sterile lines for heterosis utilization. Unfortunately, the breeding of cytoplasmic male sterility in welsh onion has a little progress due to the limitation of its biological characteristic and traditional selection approach. To study the feasibility and the efficiency of utilizing marker assisted selection for male sterile lines in welsh onion, one SCAR marker, SCS13, and one RAPD marker, S2002400, which could distinguish between N and S cytoplasm in several welsh onion cultivars, were identified. The two markers were then confirmed by Southern blotting, and used to screen the N or S cytoplasm of individual plants in seven welsh onion cultivars in this study. Male sterile and fertile plants were evaluated by aceto-carmine dying. The frequency of N-cytoplasmic plants and maintainer genotype was calculated in the seven open populations of welsh onion. The minimum number of plants needed to identify a maintainer was evaluated to be 95% reliable. Results showed that 20 to 80% decrease of crosses and self-crosses for identifying a maintainer genotype could be achieved by the marker-assisted selection compared with traditional selection method. It was proved that the molecular markers could precisely identify cytoplasmic types individually, performed by one generation of cross and two generations of testcrosses and self-crosses. Finally, several maintainer genotype plants were selected with the help of the two markers in the seven cultivars. The screened markers could assist and accelerate sterile and maintainer lines selection with less labor and cost.