熊蜂抗冻蛋白基因序列分析及表达特性研究

[目的]本研究旨在探究熊蜂Bombus terriestris抗冻蛋白基因(Antifreeze protein,BtAFP)的序列特征和表达规律,为该基因功能的研究提供理论基础。[方法]利用多种生物信息学软件对BtAFP序列进行分析,并采用荧光定量PCR方法对熊蜂不同发育阶段、不同组织以及不同低温胁迫下的mRNA表达量进行检测。[结果]序列分析结果表明,BtAFP包含1 143bp的开放阅读框区域,编码380个氨基酸,理论蛋白分子量为38kDa。该蛋白包含信号肽结构但无跨膜结构域,其二级和三级结构主要为α螺旋,与鱼type-I型AFPs的结构相似。BtAFP基因的5’UTR区域包含1个启动子序列和多个与环境变化相关的转录因子。进化树分析结果表明,BtAFP与蜜蜂科昆虫抗冻蛋白亲缘关系最近,氨基酸序列一致性为74%。荧光定量PCR结果表明,BtAFP表达量在熊蜂不同的发育阶段和组织中存在显著差异(P0.05),BtAFP mRNA在熊蜂褐眼蛹期的表达量最高,该基因在熊蜂工蜂成虫触角、翅膀和足中的表达量较高。BtAFP的表达受低温胁迫的诱导,其在-20℃和0℃低温下分别持续20min、16h的mRNA表达量显著高于其它时间点(P0.05)。[结论]BtAFP基因在熊蜂生长发育和抵御寒冷时发挥着重要的生理作用,可作为熊蜂抗寒研究的候选基因。     

芹菜肉桂酰辅酶A还原酶基因的克隆与表达分析

[目的]肉桂酰辅酶A还原酶CCR(cinnamoyl-Co A reductase)在植物木质素代谢中起重要的作用,能够将羟基肉桂酸还原生成肉桂醛。本文目的是研究不同芹菜中肉桂酰辅酶A还原酶基因AgCCR在芹菜中组织表达和非生物胁迫过程中的响应情况。[方法]以2个芹菜品种‘六合黄心芹’和‘文图拉’为材料,分别克隆出编码肉桂酰辅酶A还原酶的基因AgCCR。利用荧光定量PCR分析不同芹菜组织和2种芹菜在高温、低温、干旱和盐胁迫下AgCCR的表达情况。[结果]序列分析表明,‘六合黄心芹’和‘文图拉’中AgCCR基因均含有1个长度为1 014 bp的开放阅读框,编码337个氨基酸,二者的核苷酸位点有3个位点的差异,编码的氨基酸有1个位点的差异。对2个芹菜中的AgCCR基因进行多重比对并绘制进化树,发现其编码的氨基酸序列与其他15种植物的CCR蛋白同源性较高,氨基酸高度保守。荧光定量PCR(qRT-PCR)分析表明,芹菜AgCCR基因在‘六合黄心芹’和‘文图拉’叶中的表达水平较高,AgCCR基因在高温和低温下表达上调,在干旱处理下表达下调。[结论]芹菜AgCCR基因对多种非生物胁迫均有响应。特别是低温下该基因响应明显,表明AgCCR基因或许与芹菜抗寒机制相关。     

低温贮藏条件下木薯种茎可溶性糖与干旱胁迫耐受性的相关性研究

【目的】研究木薯种茎在不同温度贮藏不同时间后的失水状况、可溶性糖含量以及相关糖代谢信号通路中有关酶基因表达量的变化,分析不同温度下海藻糖含量与种茎失水率的相关性。【方法】以‘木薯60444’种茎为试验材料,采后分别贮藏于低温(20±2)℃、常温(36±2)℃0～30 d,测定种茎失水率、相关可溶性糖含量,运用实时荧光定量PCR分析种茎糖代谢相关基因的表达,木薯种茎海藻糖含量和失水率的相关性分析采用Pearson法。【结果】低温贮藏组种茎失水率在10、20、30 d显著低于常温贮藏组(P<0.01)。低温与常温贮藏种茎海藻糖含量随贮藏时间的延长整体呈不同程度地提升,且低温贮藏组在10、20、30 d显著低于常温贮藏组(P<0.05);蔗糖、葡萄糖、果糖、麦芽糖含量均随贮藏时间的延长整体呈下降趋势。相关性分析表明,低温贮藏组与常温贮藏组种茎海藻糖含量与种茎失水率呈强线性相关,且2个贮藏组回归方程存在显著差异,低温贮藏组相关系数低于常温贮藏组。实时荧光定量PCR分析表明,低温贮藏不同程度地降低了糖酵解相关基因表达,低温贮藏组海藻糖–6–磷酸合成酶基因(MeTPS-1)的表达量在贮...     

不结球白菜醛酮还原酶BcAKR4C9基因的克隆及表达分析

[目的]本文旨在探究醛酮还原酶AKR4C亚家族BcAKR4C9基因在不同激素处理及逆境胁迫中的表达模式,从而分析BcAKR4C9基因在不结球白菜作物中的生长代谢和逆境胁迫中可能发挥的作用。[方法]以不结球白菜‘苏州青’为材料,克隆了BcAKR4C9基因的全长,应用生物信息学分析了其氨基酸序列,并通过实时荧光定量PCR技术分析BcAKR4C9基因在不同组织,高温、低温、NaCl胁迫、伤害胁迫,以及水杨酸、茉莉酸甲酯和脱落酸等处理下的基因表达变化。[结果]序列分析表明,BcAKR4C9基因包含1个长度为948 bp的开放式阅读框(ORF),编码315个氨基酸。氨基酸序列多重比对和进化树分析表明,BcAKR4C9与其他植物AKR4C9基因同源性较高,具有高度保守性。荧光定量PCR分析表明,BcAKR4C9在叶片中的表达量高于根中,高温和低温处理下表达上调,且具有相似的表达模式。在0~20 g·L~(-1) NaCl质量浓度范围内基因相对表达量随NaCl质量浓度的升高而升高,伤害处理后能够迅速产生应激响应,并能够被水杨酸、茉莉酸甲酯和脱落酸诱导表达。[结论]不结球白菜BcAKR4C9基因能够被不同激素诱导表达,并且参与到多种逆境胁迫响应。     

马铃薯块茎低温反应抑制差减文库的构建及鉴定

本研究以4℃(Tester)和20℃(Driver)处理的马铃薯野生种Solanum berthaultii的无性系CW2-1块茎为材料,构建马铃薯块茎低温反应抑制差减文库以进一步筛选差异表达基因。通过PCR鉴定后,获得了含有2 112个阳性克隆的差减杂交文库。采用反向Northern方法对差减文库进行筛选鉴定,得到274个含有显著表达差异基因（P/N>3）的阳性克隆。从274个克隆中挑选了53个克隆进行测序和同源比对分析,合并后获得29个代表不同基因的非重复序列片段,表明文库具有较高质量。并随机选取了其中4个EST进行基因表达分析,结果显示,在耐低温糖化的S. berthaultii块茎中,4℃下贮藏的块茎基因表达强度高于20℃贮藏的块茎;同在4℃贮藏条件下,S. berthaultii和易低温糖化栽培种E1的块茎中基因的表达量亦存在差异,证明所构建的差减文库富集了马铃薯块茎对低温响应的基因。     

不洁贮藏对葡萄果肉衰老相关基因表达的影响

[目的]研究不洁贮藏对葡萄果肉衰老相关基因表达的影响。[方法]以巨峰葡萄果实为材料,应用实时荧光定量PCR技术对不同处理的相对表达量进行测定。[结果]ACC氧化酶基因、ACC合成酶基因、苯丙氨酸解氨酶基因表达量明显上调;脱落酸调控基因表达量明显下调。[结论]该试验为从基因水平上研究葡萄保鲜机理奠定了基础。     

EGTA结合热处理对香蕉果实CBF冷应答 途径相关基因表达的影响

[目的]探讨EGTA[乙二醇双(2-氨基乙基醚)四乙酸]结合热处理对香蕉果实CBF冷应答途径相关基因表达的影响,为研究热处理提高香蕉果实抗冷性的机理提供理论参考.[方法]分别采用热处理(HWD)和EGTA结合热处理(EGTA+HWD)两种方法处理香蕉果实,将处理的香蕉果实置于20℃恒温箱中贮藏3.0 h,然后置于7℃恒温箱中冷藏120.0 h,期间定期采集香蕉果皮,利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测MaDREB1D、MaDREB2C、MaDREB3和MaCOR413基因在20和7℃下不同取样时间点的表达情况.[结果]HWD处理的香蕉果实MaDREB1D、MaDREB2C、MaDREB3和MaCOR413基因在20℃贮藏0.5 h时表达量迅速升高,之后又迅速降低,7℃冷藏下这4个基因的表达量整体上呈升高趋势.与HWD处理相比,EGTA+HWD处理明显抑制MaDREB1D基因在20℃贮藏0.5 h时的表达,也降低了MaDREB1D基因在7℃冷藏过程中的表达量;EGTA+HWD处理的MaDREB2C、MaDREB3和Ma-COR413基因在20℃贮藏和7℃冷藏中的表达量一直维持在较低水平.[结论]EGTA能抑制香蕉果实CBF冷应答途径相关基因的表达,推测钙信号参与香蕉果实CBF冷应答途径.     

紫苏PfPDAT1基因序列及表达特性分析

[目的]发掘脂肪酸代谢关键酶基因,了解其编码蛋白的理化性质,探究该基因在紫苏不同组织中及不同逆境胁迫下的表达特性,为紫苏分子育种提供基因元件。[方法]利用生物信息学技术对转录组测序数据库中获得的紫苏PfPDAT1基因序列进行了分析,并采用qRT-PCR技术研究了不同逆境胁迫下该基因的表达特性。[结果]PfPDAT1基因cDNA全长序列为2 097 bp,包含1 554 bp的开放阅读框,编码517个氨基酸残基,通过预测将PfPDAT1基因编码蛋白定位于细胞质;多序列比对分析显示,PfPDAT1基因编码蛋白与芝麻和油橄榄具有较高的同源性,序列相似性分别为89%和83%;实时荧光定量PCR分析结果表明,PfPDAT1基因在‘晋苏1号’不同组织中均有表达,且在种子中表达量最高;PfPDAT1基因在NaCl、PEG6000和低温胁迫诱导时,其相对表达量有显著差异,且均在胁迫6 h时表达量达到最高。[结论]PfPDAT1基因在紫苏生长发育及抵御逆境胁迫过程中起重要作用。     

低温胁迫对番茄RNA解旋酶SlDEAD34基因表达的影响

利用生物信息学方法和实时荧光定量PCR技术对番茄RNA解旋酶SlDEAD34的蛋白结构特征、SlDEAD34基因的组织表达模式和低温胁迫条件下的基因表达情况进行了研究。结果表明,SlDEAD34包含9个保守基序,是DEAD-box型RNA解旋酶,与拟南芥LOS4高度同源,三维结构非常类似;SlDEAD34基因在生长6周的番茄根、茎和叶中均有表达,且根茎叶,在生长5个月的番茄9种组织器官中均有表达,其中在果实中表达量最高,在根中表达量最低;4℃处理时,番茄根中SlDEAD34基因下调明显,叶中表达量变化不明显,12℃处理时,番茄根和叶中SlDEAD34基因表达量变化均不明显。DEAD-box型RNA解旋酶SlDEAD34经低温4℃处理后基因表达量明显下调,暗示SlDEAD34基因响应低温胁迫,推测SlDEAD34基因可能参与调控低温逆境胁迫过程。     

玉米蔗糖转运蛋白基因ZmSUT4克隆及其低温胁迫下的表达模式

[目的]克隆玉米蔗糖转运蛋白基因ZmSUT4,并明确其组织表达特性及在低温胁迫下的表达模式,为深入研究SUT4基因响应低温胁迫的作用机理提供理论依据.[方法]以玉米自交系黄早四幼苗为材料,采用RT-PCR克隆其ZmSUT4基因,分析其生物学信息,构建系统发育进化树,并采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测其组织表达特异性及低温胁迫(4℃)下不同组织中的表达模式.[结果]克隆获得的ZmSUT4基因(GenBank登录号MK541991)全长为1621 bp,开放阅读框(ORF)长度为1506 bp,编码501个氨基酸,编码蛋白的分子量53.36 kD,理论等电点(pI)8.84,具有12个跨膜结构,定位于细胞膜上,既属于易化扩散载体(MFS)家族成员,也属于蔗糖/H+共转运体(GPH)超家族成员,其中第25~447位氨基酸是MFS家族蛋白的保守结构域,第17~484位氨基酸是GPH超家族成员的蔗糖运转子保守结构域GPH-sucrose.ZmSUT4蛋白的氨基酸序列与单子叶植物SUT4蛋白同源性较高,为86%~96%,聚集在同一分支上;与双子叶植物SUT4蛋白同源性较低,为62%~65%,说明该类蛋白在不同物种间高度保守.ZmSUT4基因在玉米的根、茎和叶中均有表达,以根中的表达量最高,其次是叶,茎中的表达量最低.低温胁迫下,ZmSUT4基因在不同组织中表达量模式不同,根和叶中ZmSUT4基因表达量均在胁迫24 h达最大值,分别是低温胁迫前(0 h)表达量的2.21和2.62倍,茎中的ZmSUT4基因表达量在胁迫6 h达最大值,是低温胁迫前表达量的3.01倍.[结论]ZmSUT4基因受低温胁迫诱导表达,推测其是调控玉米响应低温胁迫的关键基因.     

‘黄冠梨’钾转运体基因PbKT8的克隆与表达分析

[目的]本文旨在克隆‘黄冠梨’钾转运体PbKT8基因,对基因定位及表达特征进行初步分析,为其功能研究提供基础。[方法]从‘黄冠梨’果实中克隆PbKT8基因的cDNA全长序列,利用生物信息学对其同源序列进行分析,构建含GFP载体并通过激光共聚焦显微镜精确定位蛋白位置,实时荧光定量PCR分析不同施钾处理下该基因在果实成熟期的表达特征。[结果]钾转运体PbKT8基因序列全长2 328 bp,编码775个氨基酸,PbKT8蛋白与苹果(Malus domestica)进化关系最相近,同源序列相似性高达99.10%;亚细胞定位结果显示,PbKT8蛋白定位于细胞膜上;PbKT8基因转化酵母突变菌株R5421在低于5 mmol·L~(-1) K~+培养基上恢复生长;qRT-PCR结果表明,PbKT8基因在果实和叶片中相对表达量随施钾水平增加而上升。[结论]PbKT8蛋白定位在质膜上具有转运钾离子的功能,在果实成熟期受高钾响应表达。     

紫菜薹BrbHLH49基因克隆与功能分析

[目的]本文旨在研究紫菜薹BrbHLH49基因在花青素合成中的功能。[方法]以紫菜薹为材料,通过同源克隆获得BrbHLH49基因全长序列,并与其他物种中的同源序列进行进化树分析;构建pEarlyGate101-BrbHLH49-YFP载体并转化导入烟草叶片中,研究BrbHLH49蛋白的亚细胞定位;采用荧光定量PCR(RT-qPCR)技术分析BrbHLH49基因在紫菜薹和‘四九菜心’(‘CX-49’)不同组织中的表达情况,同时分析野生型和35S∶BrbHLH49-YFP转基因拟南芥中花青素合成相关基因的表达。[结果]BrbHLH49基因含有1 431 bp开放阅读框,编码476个氨基酸,其编码的蛋白定位于细胞核中。在进化过程中BrbHLH49编码的氨基酸序列与甘蓝型油菜和野甘蓝(原变种)同源性最高,亲缘关系最近。RT-qPCR结果表明,紫菜薹的薹和叶中BrbHLH49相对表达量均显著高于‘CX-49’,且BrbHLH49转基因拟南芥植株中花青素合成相关基因的表达量显著高于野生型。[结论]BrbHLH49蛋白定位于细胞核中。BrbHLH49基因在紫菜薹的薹和叶中高表达,且拟南芥中过表达该基因能显著提高花青素的合成。     

菜粉蝶HSP20基因的克隆及温度胁迫下表达分析

[目的]克隆分析菜粉蝶(Pieris rapae)热激蛋白20基因(HSP20),并检测其在温度胁迫下的表达情况,为探析菜粉蝶适应温度胁迫机制提供参考.[方法]以菜粉蝶为试验材料,采用RT-PCR和RACE克隆获得菜粉蝶HSP20基因cDNA全长,并通过生物学软件分析其序列,明确其基因结构特征和亲缘关系;采用实时荧光定量PCR检测菜粉蝶HSP20基因在低温(-20~0℃)和高温(5~45℃)胁迫下的表达响应.[结果]菜粉蝶HSP20基因全长725 bp,5'-端非编码区105 bp,3'-端非编码区109 bp,开放阅读框531 bp,编码176个氨基酸,预测蛋白分子量19.5 kD,理论等电点6.61;其编码氨基酸序列中含有1个典型的HSP20家族结构域(位于第60~142位氨基酸)、1个α-晶体蛋白(位于第60~157位氨基酸)和1个Allato allatostatin(位于第14~24位氨基酸);基序列相似度分析其与二化螟、家蚕和甘蓝夜蛾HSP20蛋白氨基酸相似度较高并聚为一族.该基因随环境温度的升高或降低发生变化,在-5和40℃诱发该基因高效表达.[结论]低温和高温均能诱导菜粉蝶HSP20基因高效表达.     

大豆GmMYB46基因的克隆、定位及表达分析

[目的]本文旨在研究MYB类转录因子基因GmMYB46的结构特征和定位,并阐述其对不同胁迫的响应,为明确其在逆境胁迫下的作用奠定基础。[方法]从大豆品种‘晋豆21’中克隆出GmMYB46的CDS序列,采用生物信息学方法对该基因及其编码蛋白进行分析,并利用PlantCARE软件分析GmMYB46基因启动子元件。通过洋葱表皮细胞瞬时表达系统对GmMYB46蛋白质全长及不同结构域M1(aa1～123)和M2(aa124～334)进行亚细胞定位分析。采用实时荧光定量PCR检测GmMYB46在不同逆境处理下的表达情况。[结果]GmMYB46 CDS序列全长为1 005 bp,编码334个氨基酸,蛋白质相对分子质量为82.53×10~3,氨基酸序列中含有2个高度保守的SANT结构域。进化树分析表明该基因编码的蛋白与野生大豆Gs MYB46亲缘关系最近。GmMYB46包含MBS、ABRE、GARE、TCA、LTR等逆境胁迫应答元件。亚细胞定位结果显示,p BIN-GmMYB46-GFP及p BIN-GmMYB46M1-GFP融合蛋白在细胞核中表达,p BIN-GmMYB46M2-GFP绿色荧光遍布整个细胞。实时荧光定量PCR分析表明,在干旱、盐(200 mmol·L~(-1)NaCl)、低温(4℃)、ABA(200μmol·L~(-1))、SA(500μmol·L~(-1))、GA(100μmol·L~(-1))处理下均能诱导GmMYB46基因在大豆根、茎、叶中的上调表达。[结论]GmMYB46基因的保守结构域对亚细胞定位起决定性作用,该基因可能参与大豆对非生物胁迫的响应。     

青蛤(Cyclina sinensis)ERK基因的克隆及其在Poly I:C刺激下的表达分析

[目的]研究青蛤(Cyclina sinensis) ERK基因的克隆及在Poly I:C刺激下的表达情况。[方法]在已建立的青蛤转录组文库中筛选得到青蛤细胞外调节蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases)基因类似序列。运用生物信息学软件在线对该基因进行结构分析。采用PCR技术克隆基因,并使用实时荧光定量PCR技术克隆得到Cs ERK基因在青蛤5个不同组织中的表达情况及在干扰素诱导剂PolyI:C的刺激下ERK基因在青蛤血淋巴中的时序性表达情况。[结果]ERK基因序列全长为2 407 bp,开放阅读框长1 338 bp,共编码445个氨基酸。ERK基因在青蛤的血淋巴、外套膜、闭壳肌、肝脏和鳃5个组织中均表达,在血淋巴中表达量最高,闭壳肌中表达量最低。青蛤ERK基因在Poly I:C胁迫下表达量在6 h时达到最大值,与对照组相比差异极显著(P<0.01)。[结论]ERK基因所指导合成的蛋白是青蛤重要的免疫信号通路蛋白。     

凡纳滨对虾HSP10基因序列与低温表达分析

[目的]克隆分析凡纳滨对虾HSP10基因,为研究其在寒冷耐受过程中发挥调控功能提供参考依据.[方法]搜索EST库获得凡纳滨对虾HSP10基因序列,再通过RACE-PCR扩增获得凡纳滨对虾HSP10基因cDNA全长序列,对其进行生物信息学分析,并通过荧光定量PCR分析HSP10基因的组织表达及低温胁迫下表达量的变化.[结果]凡纳滨对虾HSP1基因cDNA全长720 bp,包含306 bp的开放阅读框,编码102个氨基酸.以各物种的HSP10蛋白序列构建系统进化树,能较好反映各物种间的进化关系.荧光定量PCR分析结果显示,凡纳滨对虾HSP10mRNA在各组织中呈遍在表达,其中以肌肉中的表达量最高.低温表达谱分析结果显示,凡纳滨对虾HSP10mRNA在低温处理凡纳滨对虾的各组织中均呈下调表达,当处理温度降至13℃,其在肝胰腺中表达量降至最低.[结论]凡纳滨对虾HSP10在结构和进化上较保守,其mRNA表达量在低温胁迫下呈下降趋势,可能在寒冷耐受过程中发挥负调控作用.     

荔枝果皮LcMn-SOD、LcCu/Zn-SOD-1、LcCu/Zn-SOD-2、LcPRDX5的表达特性分析

为探讨Lc Mn-SOD(荔枝Mn-SOD)、Lc Cu/Zn-SOD-1(荔枝Cu/Zn-SOD-1)、Lc Cu/Zn-SOD-2(荔枝Cu/Zn-SOD-2)、Lc PRDX5(荔枝过氧化物还原酶5)与荔枝低温贮藏过程中果皮褐变的关系,该文以‘井冈红糯’和‘怀枝’为试验材料,采用实时荧光定量PCR对4个基因的表达特性进行分析。结果表明,在‘井冈红糯’和‘怀枝’低温贮藏前期,二者的褐变指数上升较缓慢,同时Lc Mn-SOD、Lc Cu/Zn-SOD-1、Lc Cu/Zn-SOD-2、Lc PRDX5的表达量下降;贮藏21d后,4个基因的表达量升高,褐变指数迅速上升,贮藏后期严重褐变果皮中Lc Mn-SOD、Lc Cu/Zn-SOD-1、Lc Cu/Zn-SOD-2、Lc PRDX5表达量比贮藏前期高。低温贮藏过程中,‘井冈红糯’的耐贮性高于‘怀枝’,与之对应的Lc Mn-SOD、Lc Cu/Zn-SOD-1、Lc Cu/Zn-SOD-2、Lc PRDX5的表达也高于‘怀枝’,但2个品种种4个基因表达的变化趋势大致相同,Lc Mn-SOD、Lc Cu/Zn-SOD-1、Lc Cu/Zn-SOD-2、Lc PRDX5与荔枝果皮褐变密切相关。     

羽衣甘蓝BoRACK1基因克隆、亚细胞定位及表达分析

[目的]克隆羽衣甘蓝蛋白激酶C1受体(RACK1)基因(BoRACK1)序列,并对其进行亚细胞定位及表达分析,为研究RACK1基因在植物生长发育过程中的调控机制提供理论参考.[方法]PCR扩增BoRACK1基因,构建其亚细胞定位表达载体,通过基因枪法转化洋葱表皮细胞后在激光共聚焦显微镜下观察绿色荧光蛋白(GEP)的分布情况.利用荧光定量PCR(qRT-PCR)检测BoRACK1基因在不同组织中及在非生物胁迫(200 mmol/L NaCl、100 μmol/L ABA和1 mmol/L H2O2溶液)下幼苗中的表达情况.[结果]PCR扩增获得BoRACK1基因的开放阅读框(ORF)序列,其cDNA全长980 bp,编码326个氨基酸,氨基酸序列与其他植物的RACK1具有较高同源性,在65%以上,尤其与拟南芥的同源性高达93%.BoRACK1基因在羽衣甘蓝的根、茎、叶、花和种子中均有表达,其中在根、叶和种子中的表达量较高,而在花、幼芽和茎的表达量较少.BoRACK1基因在ABA、H2O2和NaCl胁迫下的表达量整体上呈下调趋势,其中NaCl胁迫下其表达量在6 h时降至最低,而其他胁迫下其表达量均在4 h时降至最低.BoRACK1定位于细胞质、细胞核和细胞质膜.[结论]BoRACK1基因表达无组织特异性,除了与羽衣甘蓝花、果实及营养器官的发育存在关联外,还可能参与了植物的抗逆性调控过程.     

杏鲍菇采后木质化相关基因实时定量PCR中内参基因的选择

【目的】筛选出合适的内参基因,为分析不同贮藏时期杏鲍菇(Pleurotus eryngii)子实体中木质化相关基因的表达提供支持。【方法】以4℃低温贮藏0,3,6,9,12,15和18d的杏鲍菇子实体为材料,采用实时荧光定量PCR(Quantitative real-time PCR,RT-qPCR)技术,分析了β-actin、18SrRNA、β-tubulin、ELF和GAPDH 5个候选内参基因在不同贮藏时期杏鲍菇的表达情况;通过GeNorm和NormFinder 2种软件筛选出最稳定的内参基因;选取最佳内参基因,采用相对表达定量法对木质素合成途径中的关键酶,即苯丙氨酸转氨酶(Phenylalanina ammonia-lyse,PAL)基因的表达进行定量分析。【结果】5个内参基因均能特异扩增,其中GAPDH基因表达丰度较低,不适合用作内参基因;经GeNorm软件分析计算,β-actin、β-tubulin、ELF、18SrRNA表达稳定度平均值M分别为0.527,0.527,0.584,0.875,最适内参基因组合为β-actin、β-tubulin和ELF;由NormFinder软件分析计算,β-actin、β-tubulin、ELF、18SrRNA稳定值S分别为0.221,0.356,0.583,1.092,β-actin稳定性最高;综合分析认为β-actin的表达稳定性最高,为最佳内参基因;以β-actin为内参基因,发现4℃低温贮藏3,6,9,12,15和18d的杏鲍菇子实体中PAL基因表达量分别比新鲜样品(0d)增加了11.3%,10.8%,11.3%,11.5%,11.4%,10.7%。【结论】β-actin可作为杏鲍菇子实体采后贮藏条件下品质变化相关基因表达研究的内参基因。     

甘蔗ABA生物合成关键酶SoNCED基因克隆及表达分析

[目的]克隆甘蔗体内9-顺式环氧类胡萝卜素双加氧酶(9-cis-epoxycarotenoid dioxygenase,NCED)基因,分析其基本生物学信息及在逆境胁迫下的表达分析,为进一步探讨SoNCED基因在甘蔗脱落酸(ABA)生物合成途径中的作用提供理论依据.[方法]以甘蔗品种桂糖21号为材料,待蔗苗长至5~6片叶时分别进行干旱、低温、高盐和氧化胁迫处理,利用反转录PCR(RT-PCR)和cDNA未端快速扩增(RACE-PCR)克隆SoNCED基因,应用生物信息学方法对获得的氨基酸序列进行分析,构建原核表达载体并进行目的蛋白的诱导表达,通过实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分析SoNCED基因在受到不同逆境胁迫时的表达情况.[结果]克隆获得的SoNCED基因(GenBank登录号JQ314108),cDNA全长为2521 bp,包含1个1827 bp的开放阅读框(ORF),编码608个氨基酸.多重序列比对及系统发育进化树分析结果表明,SoNCED基因编码的氨基酸序列与其他植物有一定的相似性,尤其与禾本科C4植物高粱和玉米的同源性最高,均达96%.成功构建SoNCED基因的原核表达载体pET-SoNCED,且通过IPTG诱导时可得到约66.0 kD的蛋白,确定该蛋白为SoNCE基因的表达蛋白.qRT-PCR结果分析表明,SoNCED基因在干旱、低温、高盐和氧化胁迫下均能诱导表达,其中氧化胁迫下其表达量在6h时达峰值,其他胁迫方式下其表达量在12h时达峰值.[结论]成功克隆获得甘蔗SoNCED基因,并从不同逆境下的表达情况推测该基因在甘蔗体内参与了干旱、低温、高盐和氧化等非生物胁迫的调控过程.