氮素和红蓝复合光配比对苋菜幼苗亚硝酸还原酶活性及其基因表达的影响

为了研究苋菜亚硝酸还原酶基因NiR对不同铵硝配比及红蓝复合光配比调控氮代谢的响应,采用RT-PCR结合qRT-PCR的方法从大红苋菜中克隆出一个NiR基因,命名为AtrNiR (GenBank登录号:MT374155),对其相对表达量进行分析,并测定材料NiR酶活性。结果表明:1)苋菜AtrNiR基因含一个1 785bp开放阅读框,编码594个氨基酸;2)生物信息学分析表明,苋菜AtrNiR的蛋白分子式为C_(2937)H_(4692)N_(828)O_(873)S_(28),相对分子质量为66.47ku,AtrNiR为亲水性较强的蛋白;3)系统进化树分析表明,苋菜AtrNiR蛋白序列与甜菜、藜麦和菠菜的NiR蛋白同源性最高,具有类似的功能;4)苋菜幼苗NiR酶含量分析表明,不同铵硝配比处理3d时,硝态氮(NH_4~+-N)与铵态氮(NO_3~--N)摩尔比值为10∶0时NiR酶活性最高,处理6d时,NH_4~+-N与NO_3~--N摩尔比值为3∶7时NiR酶活性最高;不同红蓝光配比处理3d时,红光(Red)∶蓝光(Blue)=2∶8处理下NiR酶活性最高,可见,NO_3~--N和蓝光能提高苋菜幼苗NiR酶活性;5)qRT-PCR分析结果表明,不同铵硝配比处理3d时,NH_4~+-N与NO_3~--N摩尔比值为5∶5时AtrNiR表达量最高;不同红蓝复合光配比处理3d时,R∶B=2∶8处理下AtrNiR表达量最高。研究表明,适宜比例的氮素和红蓝复合光能提高AtrNiR转录水平,改善苋菜幼苗的氮代谢,为优质苋菜工厂化生产提供理论支撑。     

棉花体细胞胚胎发生相关基因——亚硝酸还原酶基因的克隆与生物信息学分析

利用生物信息学方法,以水稻的NiR基因序列为基础,克降棉花亚硝酸还原酶基因的开放阅读框,并对序列进行氨基酸组成、二级结构、疏水性及信号肽进行等预测分析,同时与4个物种的NiR基因进行了同源性比较.结果成功地克隆了NiR基因,该研究结果对研究棉花体细胞胚胎发生和基因的关系奠定了一定的基础.     

黄瓜CsGASA4基因克隆及生物信息学分析

选取霜霉病与棒孢叶斑病两种病害胁迫后,在抗病品种中上调表达、感病品种中下调表达的基因克隆。通过生物信息学分析,初步开展该基因编码蛋白理化性质分析、亲疏水性预测、亚细胞定位预测、蛋白质结构预测。结果表明,该基因编码区全长315 bp,编码104个氨基酸,编码蛋白属于GASA super-family,具有跨膜结构,存在明显信号肽。系统进化树显示与大马士革玫瑰亲缘关系最近,同源性最高。根据其编码蛋白将该基因命名为Cs GASA4,亚细胞定位于分泌系统囊泡中。研究为进一步探究该基因功能及挖掘黄瓜双抗基因奠定基础。     

鳗鲡疱疹病毒FJ株ORF51基因的克隆及生物信息学分析

为了解本课题组分离的鳗鲡疱疹病毒福建株（AngHV-FJ） ORF51的结构特征,扩繁了 AngHV-FJ ,提取其基因组DNA ,经PCR扩增,获得ORF51基因,将其克隆至pMD19-T载体中,进行DNA测序,用生物信息学方法分析AngHV-FJ ORF51基因及其编码蛋白的结构和功能。结果显示,扩增到长约720 bp的ORF51基因序列,其与GeneBank上鳗鲡疱疹病毒欧洲株（AngHV-1） ORF51基因的序列完全一致。该基因编码239个氨基酸;预测ORF51基因编码蛋白的分子量为26107.1 Da ,等电点为7.66,是疏水性蛋白且偏碱性;有4个跨膜域;抗原表位预测显示抗原性较好;结构预测显示,存在1个N-糖基化位点、1个O-糖基化位点、10个磷酸化位点;亚细胞定位预测显示其主要存在于内质网。本研究为解析ORF51的功能及开展AngHV的基因工程疫苗研究奠定了基础。     

猪链球菌rpoE基因克隆及生物信息学分析

本研究旨在克隆猪链球菌rpoE基因,并通过生物信息学软件预测分析猪链球菌rpoE基因编码蛋白功能及其调节机制。以猪链球菌基因组为模板扩增rpoE基因,成功测序后通过生物信息学软件预测该基因编码蛋白的理化性质、抗原表位等。结果表明,成功克隆的猪链球菌rpoE基因全长582 bp,编码一种富含谷氨酸、天冬氨酸及丝氨酸的亲水性胞质蛋白;二级结构分析显示,RpoE蛋白主要结构元件为α-螺旋和无规则卷曲,分别占52.3%和36.3%。综合分析认为,RpoE蛋白上存在5个优势抗原表位。     

花生谷氨酸脱氢酶基因AhGDH1的克隆与生物信息学分析

运用电子克隆技术获得花生1个谷氨酸脱氢酶基因cDNA序列,同时设计引物以花生cDNA为模板进行扩增,经测序得到证实,命名为AhGDH1,GenBank登录号:KT933119。采用生物信息学方法,对该基因编码蛋白从氨基酸组成、基本理化性质、亚细胞定位、跨膜结构域、信号肽导肽、二级结构和三级结构等方面进行了预测和分析。结果表明:该基因cDNA序列长度为1 713bp,包含1个1 236bp开放阅读框,编码411个氨基酸;该编码蛋白含有谷氨酸脱氢酶两个典型的保守结构域。同源比对分析显示,该基因编码的氨基酸序列与鹰嘴豆等植物的谷氨酸脱氢酶基因具有高度的相似性,进一步确定该蛋白为谷氨酸脱氢酶。     

毛果杨 RAV/PLC 基因生物信息学分析

【目的】利用生物信息学手段,对毛果杨(Populus trichocarpa)RAV/PLC基因编码蛋白质结构和特征进行预测。【方法】以PLC(Phospholipases C)为关键字在Phytozome数据库搜索毛果杨磷脂酶C基因序列,以RAV/PLC基因及其蛋白质序列为研究对象,利用多种生物信息学分析工具对其基因结构及蛋白功能进行分析。【结果】在毛果杨PLC编码基因中发现了一个可编码RAV和PLC结构域的特殊基因,该基因在Phytozome数据库中编号为Potri.018G109200,ORF区域长度为1 650 bp,编码549个氨基酸,预测分子量为62.72338 ku,理论等电点为9.16;该基因在茎中表达量最高,芽中表达量其次之根和叶中表达量较低。其编码蛋白包含1个AP2结构域、1个B3结构域和1个PLC-X结构域,AP2/B3结构域和PLC-X结构域之间可能存在一个跨膜区;启动子元件分析表明,RAV/PLC基因可能与光应答及激素应答相关;String软件预测RAV/PLC基因可能与MYB103、WRKY49、ABI5、DXS2存在功能关联;KEGG分析表明,该基因主要与RAV转录因子信号通路有关;同时利用同源建模方法获得了RAV/PLC的完整三维模型。【结论】通过对RAV/PLC基因结构和蛋白功能预测,为该基因克隆及参与信号通路分析提供参考。     

茄子谷氨酸酯-1-半醛2,1氨基变位酶基因克隆和序列分析

基于茄子基因组数据库,以番茄同源基因序列为探针,通过电子克隆手段获得茄子谷氨酸酯-1-半醛2,1氨基变位酶基因,命名为SmGSA。对该基因编码蛋白从氨基酸组成、蛋白的各级结构及其理化性质等方面进行了预测和分析。结果表明,该基因包含一个长度为1 044 bp的开放阅读框,共编码347个氨基酸,蛋白质分子式预测为C_(3 137)H_(5 232 )N_(1 044)O_(1 322)S_(211),分子量大小为85.5 KDa,为亲水性蛋白;α-螺旋、延伸链和无规卷曲是该蛋白结构的主要构成元件;该蛋白中共存在9处跨膜区,内部到外部螺旋发现4个,外部到内部螺旋发现5个。     

麦洼牦牛NPM1基因的克隆及生物信息学分析

采用分子克隆技术获得麦洼牦牛NPM1基因编码区序列,并通过普通PCR法检测NPM1基因在麦洼牦牛各组织中的表达分布,同时采用生物信息学方法对该基因及其编码蛋白的基本理化性质进行预测分析。结果表明:麦洼牦牛NPM1基因包含一个长度为885bp的开放阅读框,编码294个氨基酸,与普通牛NPM1基因序列的的同源性为99.4%,且与家犬(93.1%)、人(93.2%)也有较高同源性。根据DNAStar翻译出氨基酸序列,发现麦洼牦牛NPM1基因编码氨基酸序列第239位和261位发生了突变,分别由R变为K和L变为P;所编码的蛋白属于亲水性蛋白,二级结构主要有α-螺旋和无规卷曲;Interpro在线工具对牦牛NPM1基因编码蛋白进行结构域预测,第12~118位间有完整的核质蛋白核心结构域。系统进化树表明麦洼牦牛与黄牛、家犬及人遗传距离最近。     

山茶花翻译控制肿瘤蛋白CjTCTP基因的电子克隆及生物信息学分析

采用电子克隆方法从山茶花的EST数据库中获得了一条TCTP基因,并命名为CjTCTP,使用生物信息学方法对该基因编码蛋白从氨基酸组成、理化性质、跨膜结构域、疏水性/亲水性、信号肽、亚细胞定位、高级结构及功能域和进化树等方面进行了预测和分析。结果表明:山茶花CjTCTP基因全长706bp,包含507bp的完整开放阅读框,编码168个氨基酸;编码蛋白含有TCTP1及TCTP2保守域,是TCTP superfamily家族;从信号肽的预测可知,该蛋白不存在信号肽,可能为可溶性蛋白;亚细胞定位显示其可能位于细胞质中;同源性分析表明,该蛋白序列与拟南芥、橡胶树、玉米等物种TCTP蛋白序列的相似度达80%以上。     

施氮量和种植密度对优质晚稻稻米品质的调控效应及其机制

以‘玉针香’为材料,设计4个施氮量处理,分别为N1(不施氮)、N2(尿素180 kg/hm2)、N3(尿素126 kg/hm2)、N4(180 kg/hm2尿素+生物炭200 t/hm2),2个种植密度处理,分别为D1(18 cm×25 cm)、D2(14 cm×25 cm),于2020—2021年开展大田试验,研究施氮量、种植密度及其互作对稻米品质与叶片氮代谢特征的影响。结果表明：种植密度对稻米出米率、直链淀粉含量、胶稠度、蛋白质组分均无显著影响,D2处理各指标均略高于D1处理;施氮提高了出米率与各蛋白质组分含量,降低了垩白粒率和垩白度,以N4处理的效果最好;施氮量与种植密度互作对稻米品质影响显著,N4D2处理的稻米加工品质与外观品质最优,胶稠度最长,蛋白质组分含量最高;种植密度对叶片含氮量、硝态氮含量以及硝酸还原酶(NR)、亚硝酸还原酶(NiR)活性均无显著影响;D2处理的叶片含氮量以及NR、NiR活性较高;施氮提高了叶片全氮含量、硝态氮含量以及NR、NiR活性,以N4处理的最高;相关性分析结果表明,叶片全氮含量、NR活性、NiR活性与整精米率、直链淀粉含量、胶稠度、蛋白组分含量呈显著或极显著正相关,与垩白粒率和垩白度呈显著或极显著负相关;增施生物炭可显著提高整精米率,显著降低垩白度和垩白粒率。本试验条件下,N4D2处理对优质稻稻米品质的调控效应最好,其调控机制在于提高了叶片全氮含量和氮代谢酶活性。     

玉米不同类型愈伤组织分化中硝态氮代谢的差异分析

以玉米自交系齐319幼胚产生的Ⅰ型和Ⅱ型愈伤组织为材料,对其分化过程中的硝酸盐、亚硝酸盐含量及硝酸还原酶(NR)、亚硝酸还原酶(NiR)活性进行了测定,并对2种类型的愈伤组织在硝态氮代谢方面的异同进行了比较。结果表明,2种愈伤组织刚转入分化培养基时NR活性显著增强,之后逐渐下降;在分化过程中,Ⅱ型愈伤组织的NiR活性始终高于Ⅰ型;2种愈伤组织的硝酸盐含量在分化中没有明显差别;从分化第6天到第19天,Ⅱ型愈伤组织的亚硝酸盐含量一直低于Ⅰ型。分析可知,Ⅱ型愈伤组织的幼苗分化率高于Ⅰ型,与愈伤组织的硝酸盐含量关系不大,主要与亚硝酸盐含量有关,而亚硝酸盐含量的高低直接决定于NiR的活性,因此,NiR的活性对玉米愈伤组织分化具有重要的影响。     

枳NLP转录因子响应干旱胁迫并与NRE顺式作用元件互作

【目的】探讨枳氮素含量在干旱条件下的变化,以及氮代谢途径枳亚硝酸还原酶基因(NiR)和NLP转录因子的响应表达,分析确定枳NLP转录因子与NiR启动子区域硝酸盐响应顺式作用元件(nitrate-responsive cis-element,NRE)位点绑定互作。【方法】以一年生的砧木枳为试验材料,进行干旱处理直至植株叶片开始萎蔫,并设置对照。利用凯氏定氮仪检测干旱条件下枳叶片和侧根的全氮含量,并同步利用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)和2-ΔΔCT法分析PtNiR、PtNLP2、PtNLP4、PtNLP7及PtNLP8在枳叶片和侧根的表达情况。通过基因克隆并检索与比对分析,获取PtNiR启动子区域的硝酸盐响应顺式作用元件序列,之后利用同源克隆方法构建用于酵母单杂交的pHIS2-4×NRE和p GADT7-Rec-NLP载体,将构建的pHIS2-4×NRE和p GADT7-Rec-NLP载体质粒共同转化到酵母菌株Y187中,在氨基酸缺失培养基(SD/-Trp/-Leu,以及SD/-His/-Trp/-Leu/+120 mmol·L~(-1) 3-氨基三唑)上30℃恒温培养3—5 d,观察酵母的生长情况,以确定枳NLP转录因子(PtNLP2、PtNLP4、PtNLP7及PtNLP8)与NRE的互作关系。【结果】受干旱的影响,枳叶片全氮含量表现出先升高再下降的趋势,而侧根中全氮含量则显著下降;在对照中,枳叶片和侧根全氮含量均显著上升。RT-qPCR分析表明,PtNiR的表达水平在叶片中先上调然后再显著下调,而在侧根中则随着干旱程度的增加显著下调;PtNLP2、PtNLP4及PtNLP7在枳叶片和侧根中的表达也均呈现不同程度的先上调然后再受到抑制的规律,而PtNLP8在枳叶片和侧根中的表达则在一定程度上受到干旱抑制。通过克隆测序分析,在枳NiR启动子区域-196至-154的位置发现了疑似NRE。酵母单杂交分析表明,转化pHIS2-4×NRE-HIS3载体和p GADT7-Rec-NLP载体的Y187酵母在对照培养基(-Trp/-Leu)和含有120 mmol·L~(-1) 3-氨基三唑的三缺培养基(-His/-Trp/-Leu)上均能正常生长。【结论】枳侧根中的全氮含量受干旱的影响而显著下降,以对照为参比,枳侧根和叶片中的全氮含量均随着干旱时间的延长而相对减少。氮代谢途径的枳NiR和NLP转录因子在叶片和侧根中的表达对干旱有不同程度的响应。PtNLP2、PtNLP4、PtNLP7及PtNLP8转录因子均能与PtNiR启动子中的硝酸盐响应顺式作用元件(NRE)位点绑定互作,从而激活下游基因的表达。     

氮胁迫对水稻营养生长期氮代谢及相关基因表达量的影响

通过对水稻品种日本晴进行0、1h和1、3、7d的缺氮胁迫,以及缺氮7d后,恢复供氮生长2h和1d,研究氮素同化相关酶的基因表达及其活性的动态变化情况。结果表明:缺氮胁迫下,根部NH4+、NO3-含量显著下降。短期缺氮胁迫下,地上部NR1、NR2、NiR2、GS2、Fd-GOGAT、GDH2、GDH3以及根部NR1、NR2、GDH4的表达量均有增加;随着缺氮胁迫时间延长,上述基因的表达量均大幅下降。缺氮胁迫下,植株GS、Fd-GOGAT、地上部NR和根部NADH-GOGAT的活性下降,地上部NADPH-GDH活性增加,根部NR、GDH活性先增加后下降,地上部NiR活性先下降后增加。植株缺氮7d后,恢复供氮生长1d时,NR、NiR、GS、GOGAT、GDH的基因表达量及活性基本趋于恢复正常水平,部分基因表达量有所增加。     

稀土对沙田柚叶片某些生理特性的影响

稀土处理提高了沙田柚叶片的Ｆｖ／Ｆｍ、ΦＰＳⅡ和ＱＮ,从而增强了光合系统的光能转换效率;提高叶片的硝酸还原酶（ＮＲ）、亚硝酸还原酶（ＮｉＲ）和谷氨酸脱氢酶（ＧＤＨ）活性在最适稀土浓度处理下,ＮＲ和ＮｉＲ比对照提高了１４８％和６４％,达到极显著水平,表明稀土可以明显促进叶片氮代谢水平超氧化物岐化酶（ＳＯＤ）、过氧化氢酶（ＣＡＴ）和抗坏血酸过氧化物酶（ＡＰＸ）活性在最适稀土浓度处理下比对照提高了６５％、２４％和９４％,说明稀土增强了沙田柚叶片抗氧化能力高浓度稀土处理（１５００ｍｇ／ｋｇ）对沙田柚表现出抑制效果,建议稀土处理浓度为６００～８００ｍｇ／ｋｇ     

不同土层土壤理化生性状与反硝化酶活性N_2O排放通量的相关性研究

采用田间试验方法研究了干旱半干旱地区小麦田不同土层土壤理、化、生等因素与土壤反硝化酶活性、N2O排放通量的相关性。结果表明,在冬小麦生育期内,0—5cm土层土壤硝酸还原酶活性与相应土层土壤亚硝酸还原酶活性呈显著正相关,0—5cm,5—10cm土层土壤的温度与相应土层土壤硝酸还原酶活性呈显著负相关,土壤硝态氮含量和pH与土壤反硝化还原酶活性的相关性因土壤的不同土层而有差异;0—5cm,5—10cm土层土壤含水量,0—5cm,10—20cm土层土壤脲酶活性,5—10cm有机碳含量,硝酸还原酶活性与土壤中N2O排放通量呈显著正相关;5—10cm土层土壤温度、pH和10—20cm土层土壤磷酸酶活性、pH与之呈显著负相关。土壤N2O的排放主要是土壤反硝化作用的结果。     

灰飞虱原肌球蛋白的基因克隆、原核表达及多克隆抗体制备

【目的】通过筛选灰飞虱cDNA酵母表达文库发现原肌球蛋白（tropomyosin,Tm）能与水稻黑条矮缩病毒（Rice black-streaked dwarf virus,RBSDV）P10蛋白发生互作。研究旨在克隆灰飞虱原肌球蛋白基因（Tm）,将其在原核细胞中进行表达,纯化Tm蛋白,免疫大白兔并制备其多克隆抗体,为进一步分析Tm在灰飞虱与RBSDV互作过程中的作用提供抗体条件。【方法】根据与之高度同源的Tm基因信息确定灰飞虱Tm的开放阅读框（open reading frame,ORF）。提取灰飞虱总RNA,采用RT-PCR方法从灰飞虱中克隆Tm的ORF,连接至pMD-18T载体后进行测序分析,利用DNAstar软件分析该基因序列及其编码的蛋白特性。将测序验证正确的Tm通过EcoR V和BamH I限制性内切酶酶切连接至原核表达载体pET-32a (+)。重组质粒转化大肠杆菌BL21 (DE3),经终浓度为0.4 mmol?L^-1的IPTG诱导表达4 h后检测Tm融合蛋白的表达情况。离心收集诱导表达的大肠杆菌菌液,进行超声波破碎处理,收集上清及沉淀,采用SDS-PAGE分析融合蛋白的表达。利用Ni-NTA Agarose纯化上清中的可溶性融合蛋白,经100 mmol?L^-1咪唑洗脱和0.01 mol?L^-1 PBST溶液透析后获取纯化的Tm融合蛋白,免疫大白兔,制备多克隆抗血清,并采用间接ELISA法检测抗血清效价。纯化的Tm融合蛋白及灰飞虱总蛋白经SDS-PAGE分离后,用制备的Tm多克隆抗体进行Western blotting检测,分析抗体的特异性。【结果】序列分析显示,灰飞虱Tm的ORF大小为852 bp。采用RT-PCR克隆获得此ORF并进行测序分析,结果表明扩增所得灰飞虱Tm的ORF长为852 bp,编码283个氨基酸,理论分子量大小为32.6 kD。序列比对结果发现所编码蛋白在不同物种间保守。将Tm ORF克隆入pET-32a (+)表达载体后在大肠杆菌BL21 (DE3)中进行诱导表达,表达产物经SDS-PAGE分析显示,融合蛋白大小约为55 kD,主要以可溶性蛋白形式表达,在包涵体中也有少量表达。纯化上清中的可溶性Tm融合蛋白,免疫大白兔,制备了多克隆抗体。抗体效价测定结果显示该抗体具有较好的灵敏度,效价大于1﹕409 600。采用制备的Tm多克隆抗体检测纯化的Tm融合蛋白及灰飞虱总蛋白,分别检测到1条约55 kD和约37 kD的特异性条带,表明该抗体有较强的特异性。【结论】克隆获得了灰飞虱Tm的ORF,并在大肠杆菌BL21 (DE3)中进行了诱导表达,纯化获得了Tm融合蛋白,制备了高效价的Tm多克隆抗体。     

百合单萜合成酶基因的克隆与序列分析

单萜化合物是‘西伯利亚’百合花香的主要成分,为了研究百合单萜化合物的合成与代谢机理,以百合的花瓣为材料,根据GenBank发表的单萜合成酶基因的保守区设计1对简并引物,通过RT-PCR与RACE相结合的方法,克隆得到一个单萜合成酶基因的cDNA序列,命名为Li-mTPS2。该基因全长为1 766bp,包含1 608bp的基因开放阅读框(ORF),45bp的5′UTR和113bp的3′UTR,编码535个氨基酸,含有萜烯合成酶(TPS)保守序列DDxxD以及TPSb亚家族共有的RRx8W基序。氨基酸同源性分析表明该基因所编码蛋白的氨基酸序列与小苍兰芳樟醇合成酶、姜花单萜合成酶、六出花月桂烯合成酶的同源性分别为55%,53%,51%。     

黄瓜花叶病毒西番莲分离物RNA3 的cDNA全长克隆和序列分析

采用RT-PCR方法克隆了黄瓜花叶病毒西番莲致死分离物（CMV-PE）全长RNA3.经核苷酸序列测定，明确PE分离物 RNA3全长2216 nt，含有2个开放阅读框（ORF），其中5'端的ORF（121-963 nt）编码279 aa的3a蛋白，3'端ORF（1260-1916 nt ）编码218 aa的CP蛋白.5'端非编码区（NR）长120 nt,基因间隔区（IR）长296 nt，3'端NR区含301个碱基.PE分离物编码的3a蛋白中最明显的特征是在136-141位有一个独特的VWCLSS区域.将CMV-PE的RNA3的核苷酸序列及其编码蛋白的氨基酸序列与同属CMV亚组I的其它分离物进行比较，发现症状相似的CMV分离物的非编码区具有很高的序列同源性，说明非编码区序列与症状有关.