杂合抗菌肽基因的设计及表达载体的构建

为高效表达具有高抗菌活性的抗菌肽,根据Magainin 2(MA)、Sapecin(SA)和Melittin (ME)基因核心序列,设计杂合抗茵肽MA-SA-ME(MSM)基因并进行密码子优化.生物信息学分析显示,该抗茵肽具有很好的抗茵作用.将MSM基因与毕赤酵母表达载体pPICZQ-A连接,构建重组表达载体pPICZ...     

新型抗菌肽CAMa的制备及其在断奶仔猪生产中的应用

根据毕赤酵母(Pichia pastoris)偏爱密码子对设计的新型抗菌肽CAMa进行基因合成,将合成的CAMa基因克隆至载体pPICZαA上,构建穿梭载体pPICZαA-CAMa,电转化酵母菌X-33,经甲醇诱导表达,测定重组CAMa的抗菌活性,并通过断奶仔猪饲喂试验评价抗菌肽CAMa代替抗生素的效果。结果表明:新型抗菌肽CAMa在毕赤酵母X-33中获得分泌表达,并且对金黄色葡萄球菌CowanⅠ、大肠杆菌K12D31、猪大肠杆菌K88、猪大肠杆菌K99、猪大肠杆菌987P和猪沙门氏菌C782均有较好的抑杀活性。抗菌肽CAMa试验组和硫酸抗敌素对照组在仔猪增重、平均日增重、腹泻发生率上无显著差异(P 0.05),可作为抗生素类饲料添加剂替代品使用。     

鸡源抗菌肽Folicidin-3在毕赤酵母中的分泌表达及其生物学活性鉴定

【目的】研究鸡源重组抗菌肽Fowlicidin-3的生物学特性,并为重组抗菌肽在临床上的应用奠定基础。【方法】根据抗菌肽数据库中Fowlicidin-3的氨基酸序列,选用毕赤酵母的偏嗜密码子,设计抗菌肽的基因,通过SOE法合成得到全长为114bp的Fowlicidin-3基因。将Fowlicidin-3基因克隆入pPICZα-A质粒,构建分泌型重组酵母表达载体pPICZα-A-F。将线性化重组表达载体pPICZα-A-F通过电击法转入毕赤酵母宿主菌X-33中,构建分泌型重组酵母表达菌株。【结果】获得分泌型重组酵母表达菌株,Fowlicidin-3多肽表达量达到170mg·L-1,对致病性大肠杆菌K99和鸡白痢沙门氏菌显示出较好的抑制活性,抑菌圈直径分别为1.9cm和2.2cm。优化表达条件结果显示,转接到BMMY培养基中(pH6.0),每24h补加2%甲醇,29℃培养72h后,Fowlicidin-3抗菌肽获得高效表达。【结论】成功构建分泌型重组酵母表达菌株,并获得了具备高效表达能力和较好生物学活性的抗菌肽。     

抗菌肽MagaininⅡ基因的克隆及其在E.coli BLP中的融合表达

采用SOE法人工设计和合成抗菌肽MagaininⅡ基因,定向克隆至表达载体pET 28a,将构建的重组质粒pET 28a-Mag转化至E.coliBLP,Amp抗性筛选的阳性克隆用IPTG诱导融合表达。利用Tricine-SDS-PAGE确定了产物的正确性,利用琼脂孔穴扩散法证明表达产物具有抗菌活性。     

抗菌肽MagaininⅡ基因的克隆及其在E.coil BLP中的融合表达

采用SOE法人工设计和合成抗菌肽MagaininⅡ基因,定向克隆至表达载体pET28a,将构建的重组质粒pET28a-Mag转化至E．coli BLP,Amp抗性筛选的阳性克隆用IFFG诱导融合表达。利用Tricine-SDS-PAGE确定了产物的正确性,利用琼脂孔穴扩散法证明表达产物具有抗菌活性。     

马属抗菌肽hepcidin在酵母系统中的表达与鉴定

根据GenBank上马属抗菌肽hepcidin的氨基酸序列,设计并合成全长279 bp的hepcidin基因,将该基因插入pPICZαA中构建真核表达载体,PCR鉴定的阳性质粒电转化毕赤酵母菌X-33,用不同浓度Zeocin筛选高拷贝阳性重组菌,甲醇诱导表达,表达上清液经超滤膜纯化后,利用SDS-PAGE电泳和抑菌试验...     

杂合肽基因的合成及在大肠杆菌中的表达

将LfcinB15-Ma12杂合肽基因克隆到载体pET32a上,构建抗菌肽LfcinB15-Ma12杂合肽基因,并在大肠杆菌中表达融合蛋白。根据已报道的抗菌肽LfcinB和Magainin基因的氨基酸序列,推导出其cDNA序列,将两者连接为杂合基因并克隆到载体pET32a上,IPTG诱导表达。构建了LfcinB15-Ma12杂合肽基因重组质粒,经PCR扩增和DNA测序分析,成功构建了LfcinB15-Ma12杂合肽基因重组质粒,经IPTG诱导,成功表达了杂合肽LfcinB15-Ma12。这为利用基因工程表达其他抗菌肽奠定了基础。     

重组家蝇抗菌肽Des-HF在酵母中的表达及对金黄色葡萄球菌的抗菌活性

参考家蝇防御素抗菌肽基因序列(AY260152) 设计4条引物,用降落PCR方法获得家蝇防御素抗菌肽成熟肽基因.将基因克隆人酵母表达载体pPICZα-A,构建分泌型重组酵母表达载体pPIC-Des-HF,转化Pichia pastoris受体菌SMD1168,在醇氧化酶(AOX) 启动子调控下,相对分子质量约5 000的重组抗菌肽Des-HF获得表达.抗菌试验结果表明,该表达产物对金黄色葡萄球菌有较好的抑菌活性.以小鼠为试验模型研究重组抗菌肽对金黄色葡萄球菌的体内抗菌活性,试验结果表明,240μg重组Des-HF可分别保护小鼠免受10倍最小致死浓度的金黄色葡萄球菌(ATCC26003) 和Cowan I的攻击.     

来航鸡FOXL2基因的真核表达及纯化

【目的】对来航鸡FOXL2基因进行真核表达及纯化,为其生物学功能研究奠定基础。【方法】根据GenBank已发表的来航鸡FOXL2基因序列(GenBank登录号:JF_708868.1)设计引物,以来航鸡全血DNA为模板,PCR扩增FOXL2基因,经EcoRⅠ和XbaⅠ双酶切后定向克隆于pPICZαA中,获得pPICZαA-FOXL2真核表达载体。将pPICZαA-FOXL2转化毕赤酵母菌GS115,用甲醇进行诱导表达,对表达产物进行SDS-PAGE和Western blotting检测。【结果】克隆了918bp的FOXL2基因;成功构建了pPICZαA-FOXL2真核表达载体;实现了FOXL2基因在毕赤酵母菌GS115中的融合表达,获得了分子质量约为37ku的重组蛋白FOXL2,经Western blotting检测其具有较好的生物学活性。【结论】成功地在毕赤酵母中表达了来航鸡FOXL2基因。     

鸡神经肽Y（NPY）基因在毕赤酵母中的表达

为通过毕赤酵母的表达获得鸡NPY蛋白,根据GenBank上的鸡NPY基因序列,结合毕赤酵母密码子的偏好性合成编码鸡NPY蛋白的基因,将其插入真核表达载体pPICZαA,构建重组表达质粒pPICZαA-NPY,并将重组质粒电转入毕赤酵母GS115,获得重组毕赤酵母菌GS115/pPICZαA-NPY,用终浓度为1%的甲醇诱导表达阳性转化菌,用Tricine-SDS-PAGE和Western Blot检测表达蛋白。结果成功构建表达载体pPICZαA-NPY,转化后的重组酵母菌成功分泌鸡NPY蛋白,获得分子量约为35 kDa的鸡NPY蛋白。     

香蕉枯萎病菌2个生理小种PL基因真核表达载体的构建与表达

【目的】构建香蕉枯萎病菌1号小种（FOC1）和4号小种（FOC4）果胶裂解酶（Pectate lyases, PL）基因的真核表达载体,并进行诱导表达,为进一步研究PL在病原菌致病过程中的作用奠定基础。【方法】将质粒pMD18-pl-foc1、pMD18-pl-foc4和真核表达穿梭载体pPICZαA进行EcoRⅠ和XbaⅠ双酶切反应,回收目的片段连接,转化至DH5α进行筛选扩繁,对菌落进行PCR鉴定后抽提质粒进行PCR和EcoRⅠ、XbaⅠ双酶切鉴定。将阳性载体线性化后电击转化毕赤酵母 SMD1168感受态细胞,用甲醇进行诱导表达,对表达产物进行SDS-PAGE分析。【结果】成功构建了FOC1和FOC4 PL基因的真核表达载体pPICZαA-pl-foc1和pPICZαA-pl-foc4,经甲醇诱导表达后分别获得了重组的PL蛋白,其分子质量约为23.4 ku。【结论】FOC1和FOC4 2个香蕉枯萎病菌小种的PL基因在酵母中得到了成功表达。     

牛乳铁蛋白多肽的合成及抗菌活性试验

用化学合成法合成了以酵母偏爱密码子编码的抗菌肽LfcinB基因片段.合成片段与酵母表达载体DPICZα A重组,构建胞外分泌表达载体pPICZα A-LfcinB,通过限制性内切酶Sac Ⅰ酶切线性化,电击法转化毕赤酵母X-33宿主菌,Zeocin抗性筛选,经PCR检测LfcinB基因与毕赤酵母染色体稳定整合.阳性克隆经甲醇诱导表达LfcinB,诱导表达6 d,每24 h取上清1 mL,进行抑菌试验.结果表明,抗菌肽牛乳铁多肽基因已整合剑酵母细胞基因组中并获得表达,经0.5%甲醇在30℃诱导48 h可产生较高抗菌活性的抗菌肽,表达产物具有较强杀菌作用.     

桦褐孔菌纤维素酶基因真核表达载体构建

根据已知的内切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶基因ORF全长序列,分别设计1对带有粘性末端酶切位点EcoRI和NotI的特异性引物,PCR克隆得到桦褐孔菌内切葡聚糖酶(endo-l,4-β-D-glucanase,EG)和β-葡萄糖苷酶(beta-glucosidase,BGL)ORF基因全长,将酶切后的目的片段分别与真核表达载体pPICZαA连接,构建出真核表达载体pPICZαA-EG和pPICZαA-BGL,并成功转化到毕赤酵母GS115中,为下一步纤维素酶的表达和功能验证奠定了基础。     

抗菌肽天蚕素B基因及其串联体在毕赤酵母中的表达

通过重叠区扩增基因拼接法(SOE)合成抗菌肽天蚕素B基因,并在其N端引入Kex2酶切位点.亚克隆天蚕素B并将3个亚克隆串联在一起,每个单体前都加上Kex2酶切位点,将天蚕素B以及串联体克隆至表达载体pPICZαA上,用Sac Ⅰ酶切使之线性化,采用电击法转化毕赤酵母SMD1168,转化子用小瓶发酵.经Tricine-SDS-PAGE检测,在α信号因子的引导下,表达产物可以分泌到培养基中,且具有明显抑菌活性.     

抗菌肽天蚕素B基因及其串联体在毕赤酵母中的表达

通过重叠区扩增基因拼接法(SOE)合成抗菌肽天蚕素B基因,并在其N端引入Kex2酶切位点.亚克隆天蚕素B并将3个亚克隆串联在一起,每个单体前都加上Kex2酶切位点,将天蚕素B以及串联体克隆至表达载体pPICZαA上,用Sac Ⅰ酶切使之线性化,采用电击法转化毕赤酵母SMD1168,转化子用小瓶发酵.经Tricine-SDS-PAGE检测,在α信号因子的引导下,表达产物可以分泌到培养基中,且具有明显抑菌活性.     

抗菌肽MagaininⅡ的原核表达与抗菌活性分析

根据MagaininⅡ氨基酸序列,选用大肠杆菌偏爱密码子,化学合成了2个DNA片段,利用重叠区互补PCR法得到MagaininⅡ的基因序列.构建了融合表达载体pET21 b-MagaininⅡ,转化大肠杆菌BL21(DE3)pLysS,IPTG诱导表达,表达产物经SDS-PAGE分析,在5.1 kD处可见目的蛋白条带,...     

猪视黄醇结合蛋白在毕赤酵母中的表达及检测

采用RT-PCR技术从猪的肝脏中扩增到RBP基因,将其与巴斯德毕赤酵母分泌型表达载体pPICZαC重组构建了重组表达载体pPICZαC-RBP,测序正确后将其用SacⅠ内切酶线性化后采用电穿孔法转化巴斯德毕赤酵母菌GS115,经ZeocinTM抗性筛选高拷贝重组菌株后用甲醇诱导表达,Western Blot分析结果表明,诱导表达的培养上清液中表达出具有生物活性的RBP重组蛋白。     

鸡IL-2全基因和去信号肽基因的酵母表达研究

根据已发表的鸡白介素-2（ChIL-2）cDNA编码基因序列设计三条引物,利用RT-PCR技术从经诱导的卢氏鸡胚脾淋巴细胞中扩增出429bp的ChIL-2全长基因cDNA和363bp去除信号肽的ChIL-2基因cDNA。分别克隆到酵母表达载体pPICZαA中,并分别转化巴斯德毕赤酵母X-33中,经甲醇诱导,SDS-PAGE检测,在28kD和24kD处有两条清晰的蛋白带,相同条件下pPICZαA-△SIL-2表达量较高。RNAstructure软件分析表明,pPICZαA-IL-2的序列形成了较为稳定的二级结构,不利于翻译,证明信号肽序列的存在对ChIL-2基因在酵母细胞中的表达有一定的影响。     

抗菌肽FAPs在毕赤酵母中的重组表达研究

将4种抗菌肽Fowlicidin-2、Cecropin B、Cecropin A(1-8)-Melittin(1-18)和Thanatin串联,并在每种抗菌肽N-末端加上Kex2蛋白酶裂解位点,根据毕赤酵母密码子偏爱性,化学合成四种抗菌肽(Fusion Antimicrobial Peptides,FAPs)编码基因,连接到pPICZαC载体中,构建分泌型重组表达载体并转化毕赤酵母。经甲醇诱导后,Tricine-SDS-PAGE分析获得与目蛋白大小一致特异表达蛋白条带,每升发酵液上清含量达到32 mg。初步鉴定FAPs对大肠杆菌(E.coli)ATCC25922、金黄色葡萄球菌(S.aureus)ATCC25923、鼠伤寒沙门氏菌(S.syphimurium)C77-31和绿脓杆菌(P.aeruginosa)ATCC27853均有抑菌活性,且对S.aureus ATCC25923活性最强,最小抑菌浓度MIC为8.0μg·mL-1。     

昆虫抗真菌肽基因的分泌型表达及活性鉴定

 【目的】黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)抗真菌肽Drosomycin (Drs)及其同系物Drosomycin-like C (Drs-lC)和斑腹刺螠蝽(Podisus maculiverntris)抗真菌肽Thanatin对丝状真菌具有广谱高效的抑杀作用。实现抗真菌肽基因在酵母中的高效分泌型表达，对探讨利用转基因酵母的发酵液直接进行果蔬、食品和农产品防腐保鲜的生物技术研发有重要意义。【方法】将Drosomycin基因（Drs）及其同系物基因Drs-lC和Thanatin基因分别与酵母分泌型表达载体pPICZαA重组，构建成重组表达质粒pPICZαA-Drs、pPICZαA-Drs-lC和pPICZαA–Thanatin。利用电转化将重组质粒转化毕赤酵母GS115，经表型筛选和PCR鉴定获得的重组毕赤酵母转化子，在甲醇诱导下进行抗真菌肽的分泌表达。【结果】3种抗真菌肽基因的酵母表达产物对6个供试真菌中的5个有明显的抑制作用，Thanatin同时对供试细菌有抗菌活性。【结论】Drs、Drs-lC和Thanatin抗真菌肽基因成功地转化毕赤酵母，并实现其分泌型表达。