聚肌胞浓度和免疫刺激时间对猪外周血单核细胞基因表达的影响

【目的】聚肌胞（Poly I:C）是聚肌苷酸和聚胞苷酸的共聚物,能够模拟病毒感染后所形成的dsRNA,刺激机体产生抗病毒免疫反应和炎症反应。利用Poly I:C作为免疫刺激剂对猪外周血单核细胞（Peripheral blood mononuclear cells,PBMC）的免疫刺激试验中Poly I:C的最佳作用浓度和体外免疫刺激培养时间的研究还未见报道。本研究探讨不同的Poly I:C免疫剂量和免疫刺激时间对猪PBMC各细胞因子和受体基因表达的影响,确定Poly I:C进行免疫试验的最佳作用浓度和体外免疫刺激培养时间,为利用Poly I:C进行RNA病毒感染的免疫应答调控机理研究提供试验依据。【方法】以长白仔猪为研究对象,利用分离的PBMC和1﹕5稀释的EDTA-抗凝血,设置Poly I:C浓度梯度（0、10、20和40 μg·mL^-1）和不同的体外免疫刺激培养时间（4、8、12和24 h）,通过荧光定量PCR方法测定Poly I:C免疫刺激下机体激活或者诱导表达的主要细胞因子（IL6,IL8,TNFα,IL10,IRF3,IFNα和IFNγ）和模式识别受体（TLR3和TLR4）的相对表达量,分析利用Poly I:C对猪全血和PBMC进行免疫刺激试验的最佳作用浓度和时间。【结果】猪PBMC中细胞因子和受体基因的表达量受Poly I:C浓度和免疫刺激时间的影响。各基因具有特征性的表达量变化曲线,达到最高表达变化倍数的浓度和体外培养时间各不相同。对于两个干扰素基因IFNα和IFNγ,最高表达量出现在Poly I:C免疫刺激培养4 h,而后随着培养时间的延长表达量逐渐降低,而其他5个细胞因子（IL6,IL8,TNFα,IL10和IRF3）和2个模式识别受体（TLR3和TLR4）基因随着Poly I:C浓度的增加和免疫刺激时间的延长变化倍数逐渐增加,在Poly I:C浓度为20-40 μg·mL^-1,免疫刺激时间为12-24 h达到最高表达量。但是,对于最高表达量出现在浓度20 μg·mL^-1和培养时间12 h的基因,其在浓度为40 μg·mL^-1和培养时间24 h表达变化量只有小幅下降。另外本研究还对比检测了1﹕5稀释血在Poly I:C免疫刺激下主要细胞因子和受体的表达变化,结果表明全血中各细胞因子和受体的整体表达变化倍数比PBMC低很多,特别是对于IL6和IL8这两个PBMC中表达变化很大的基因,全血中表达变化量不仅很小,而且变化趋势相反。相对于PBMC,稀释全血完整地保存了机体的原始状态,但是利用全血进行免疫试验的主要缺点是抗凝剂保留在全血中。研究中EDTAK2抗凝剂能与血液中的钙离子结合成为螯合物,从而阻止血液凝固,但是钙离子是细胞的重要信号分子,钙离子与EDTA的结合对后续的细胞功能可能产生一定的影响。另外,全血中的某些化合物与血浆蛋白的等成分可能参与免疫细胞对Poly I:C免疫刺激的调节,减少了对Poly I:C免疫刺激的应答。【结论】（1）综合分析所检测的细胞因子和受体的变化趋势,利用Poly I:C进行猪PBMC免疫刺激试验的最佳浓度和体外培养时间分别为20 μg·mL^-1和24 h。（2）1﹕5稀释的EDTA-抗凝血对Poly I:C免疫反应反应小,与PBMC对Poly I:C免疫应答有不同的应答反应趋势。     

中国主要落叶果树果实硒含量及其膳食暴露评估

【目的】针对苹果、梨、桃、葡萄、枣、猕猴桃等6种主要国产落叶果树开展果实硒含量及其膳食暴露评估研究,明确硒含量水平及其对消费者健康的风险水平,为水果生产和消费提供参考。【方法】从主产区（包括安徽、河北、河南、江苏、辽宁、山东、陕西和新疆）共采集760个水果样品,采用氢化物原子荧光光谱法测定样品硒含量。分别以硒耐受上限（UTL）、硒最高用量（UIL）和硒适宜膳食摄入量（AI）为评价标准,对中国成人和哺乳妇女每日从6种水果中摄入硒的量（包括平均摄入量、最高摄入量、中间摄入量和最低摄入量）进行风险评估。【结果】 ⑴ 测定的760个水果样品,平均硒含量为4.3 μg·kg^-1,最高硒含量为38.0 μg·kg^-1,硒含量＜5 μg·kg^-1的样品占78.2%,富硒（硒含量≥10 μg·kg^-1）样品占14.2%;⑵ 样品间硒含量有异,变异系数分别达到80.0%（枣）、110.0%（葡萄）、116.8%（梨）、125.7%（猕猴桃）、126.0%（苹果）、148.2%（桃）和136.5%（总体）;⑶硒平均含量依次为枣（7.3 μg·kg^-1）＞葡萄（6.4 μg·kg^-1）＞桃（5.5 μg·kg^-1）＞猕猴桃（5.3 μg·kg^-1）＞梨（4.7 μg·kg^-1）＞苹果（1.3 μg·kg^-1）;⑷ 陕西的梨和桃以及陕西和新疆的葡萄,其硒含量均明显高于其他省份同类水果;⑸ 中国居民来自6种水果的硒平均摄入量分别为0.032 μg·d^-1（猕猴桃）、0.120 μg·d^-1（苹果）、0.183 μg·d^-1（葡萄）、0.197 μg·d^-1（枣）、0.213 μg·d^-1（桃）、0.222 μg·d^-1（梨）和0.968 μg·d^-1（总体）;⑹ 风险评估结果显示,中国居民从6种水果中摄入硒的量是安全的,风险指数均低于100%,为0.001%-99.702%（成人）和0.001%-31.847%（哺乳妇女）。【结论】中国6种主要落叶水果的硒含量均普遍较低,富硒产品比例均不高。枣硒含量最高,苹果硒含量最低,其他4种水果之间硒含量差异不明显。有的省份之间水果硒含量存在明显差异。哺乳妇女来自6种水果的硒摄入风险均较成人低。中国居民从6种水果中摄入硒的量是安全的,不会影响人体健康。生产富硒水果是增加中国居民硒膳食摄入量的有效途径。     

龙眼乳酸菌发酵工艺条件优化及其挥发性风味物质变化

【目的】建立龙眼乳酸菌发酵的优化工艺条件,明确乳酸菌发酵前后其挥发性风味物质的变化,为龙眼功能性饮料的开发提供指导。【方法】采用梯度浓度驯化法将乳酸菌（保加利亚乳杆菌﹕嗜热链球菌=1﹕1）依次接入到含60%、70%、80%、90%（质量分数）龙眼果浆和10%脱脂乳的混合物中进行驯化,分析驯化过程中龙眼果浆酸度和pH的变化;以总酸为指标,通过Box-Benhnken中心组合试验设计优化乳酸菌发酵龙眼果浆的工艺条件,建立包括发酵时间、发酵温度、脱脂奶粉添加量和接种量的4因素回归模型;采用顶空固相微萃取和气相色谱-质谱联用的方法分析龙眼果浆发酵前后主要挥发性风味物质变化。【结果】（1）经过梯度浓度驯化后,得到了能在高浓度龙眼果浆中发酵的乳酸菌,经过12 h发酵,90%龙眼果浆的酸度由9.5 ºT升至104.4 ºT,pH由7.12降至4.44,其酸度显著高于60%和70%的龙眼果浆（P<0.05）,而pH与60%、70%和80%龙眼果浆无显著差异（P>0.05）。（2）经回归模型并结合验证试验,确定乳酸菌发酵龙眼果浆的最佳工艺条件为：发酵时间12 h、发酵温度45℃、脱脂奶粉添加量5%、接种量3%。在该条件下,龙眼果浆的酸度由发酵前的9.5 ºT升为105.1 ºT,与模型预测值的相对误差为1.2%,可用于实际生产中预测。（3）龙眼果浆经乳酸菌发酵后其挥发性风味物质发生了显著变化。共有53种挥发性物质被检测出,其中萜烯烃类15种、醇类6种、酯类18种、酮类7种、醛类3种、酸类2种以及其他类2种。与发酵前相比,龙眼果浆发酵后新产生了18种挥发性风味物质。发酵后醇类、醛类、酯类、酮类和酸类挥发性风味物质的含量呈增加趋势,而萜烯烃类含量呈降低趋势。乳酸菌发酵龙眼果浆主要挥发性风味物质为乙醇25.68 μg·g^-1、4-（1-甲基乙基）-苯甲醇2.42 μg·g^-1、乙醛1.95 μg·g^-1、苯甲醛1.25 μg·g^-1、乙酸乙酯2.19 μg·g^-1、苯甲酸甲酯1.05 μg·g^-1、水杨酸甲酯1.93 μg·g^-1、3-羟基-2-丁酮1.085 μg·g^-1、反式-罗勒烯97.81 μg·g^-1、别罗勒烯1.923 μg·g^-1、乙酸1.84 μg·g^-1,其中苯甲醛和乙酸乙酯由发酵产生,乙醇、乙醛、别罗勒烯及乙酸经发酵后含量增加。【结论】乳酸菌发酵显著增加龙眼果浆的总酸及挥发性风味物质,通过优化控制发酵条件,可以开发风味独特的龙眼乳酸菌饮料新产品。     

植物青枯菌LAMP检测方法的建立

【目的】由茄科雷尔氏菌（Ralstonia solanacearum,简称青枯菌）引起的青枯病（bacterial wilt of plants）是世界范围内危害最为严重的土传细菌病害之一,严重制约了多种经济作物的生产。建立高效、精准的早期诊断技术,是实现青枯病有效防控的基础。论文旨在建立一种能够特异检测青枯菌的环介导等温扩增方法（loop-mediated isothermal amplification, LAMP）,实现青枯菌的田间快速检测。【方法】通过比对分析青枯菌的lpxC基因序列,并利用在线引物设计软件Primer Explorer Version 4.0得到4条LAMP特异性引物,F3（5′- CCTGTACGTGGTCGGCTAT-3′）、B3（5′-ACCGCAACACGGGATCA-3′）、FIP（5′-TACGCCGTTTCATCGGCCAGGTACACGGCGCACAAGT -3′）、BIP（5′-ATCGTCACGTTCGACAAGGTGGAATGCCGGCTGCAACTG-3′）。通过单因素变化试验对LAMP反应体系中的各参数进行优化,设置反应温度为60、61、62、63、64、65℃,设置镁离子浓度为2、4、6、8、10、12 mmol·L^-1,设置内外引物浓度比为2﹕1、4﹕1、6﹕1、8﹕1、10﹕1、12﹕1,确定最优反应体系。以分离自不同寄主的24个青枯菌株为参试对象,5个非青枯菌株（Ralstonia mannitolilytica、Ralstonia pickettii、Enterobacter sp.、Acidovorax citrulli、Burkhoderia cepacia）为对照,验证LAMP检测方法的特异性。将青枯菌GMI1000菌株的基因组DNA进行10倍梯度系列稀释,以原液和10¹、10²、10³、10⁴、10⁵、10⁶、10⁷倍的稀释液为模板同步进行LAMP和普通PCR检测,比较两者的检测灵敏度。将马铃薯青枯病菌株Po41、姜青枯病菌株Z-Aq-1分别与马铃薯块茎和生姜根茎组织悬浮液混合,以LAMP检测方法对混合物进行检测,并以同样方法对表现典型萎蔫症状的人工接种番茄植株和健康植株以及田间马铃薯罹病块茎样品进行检测。反应结果直接通过观察产生的白色焦磷酸镁沉淀情况进行判定,或通过加入1 μL SYBR GreenⅠ荧光染料进行观察,阳性样品为绿色,阴性样品为橙色。【结果】建立了特异性检测青枯菌的LAMP方法,优化后确立了检测体系中FIP/BIP与F3/B3的浓度比为8﹕1（1.6﹕0.2 μmol·L^-1）,镁离子浓度为6 mmol·L^-1,反应温度为63℃。特异性检测结果显示,仅参试青枯菌反应管中的反应液呈现绿色,表明建立的检测体系具有高度特异性。以青枯菌GMI1000菌株的DNA原液及不同梯度的稀释液为模板进行的LAMP和普通PCR检测结果显示,LAMP的检测灵敏度为1.42 pg,比普通PCR高10倍。能够快速准确地从植物组织悬浮液、罹病番茄植物组织及田间罹病样品中检测到青枯菌。【结论】建立的青枯菌LAMP检测方法,高效特异,操作简单,无需复杂仪器,肉眼可直接观察检测结果,适合基层和现场检测。     

苹果磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶基因（PEPCKs）的克隆与表达分析

【目的】克隆苹果（Malus×domestica Borkh.）多个代谢途径中的关键酶磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶（phosphoenolpyruvate carboxykinase,PEPCK）基因MdPCKs,研究其在不同组织器官及不同胁迫处理条件下的表达特性,为解析该基因在多个代谢途径中的功能奠定基础。【方法】利用同源比对和RT-PCR技术,克隆获得MdPCK1和MdPCK2全长cDNA序列并进行生物信息学分析;克隆MdPCKs的启动子序列,利用PlantCARE软件在线分析启动子上的顺式作用元件;采用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）检测MdPCKs在不同组织中的表达以及在水杨酸（SA）、茉莉酸（JA）、脱落酸（ABA）、模拟干旱（PEG）、高温（40℃）和低温（8℃）处理条件下的表达特性。【结果】获得2个苹果磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶基因（MdPCK1和MdPCK2;GenBank登录号分别为KT454964和KT454965）,其开放阅读框（open reading frame,ORF）分别为2 001 bp和2 028 bp,分别编码666和675个氨基酸残基;基因结构和进化分析表明,MdPCK1和MdPCK2均由12个外显子组成,且序列结构进化高度保守;氨基酸序列和结构分析显示,二者均含有保守的PEPCK ATP domain区域;启动子分析显示,MdPCK1和MdPCK2启动子区域含有多个顺式作用元件,包括光响应元件、昼夜节律相关顺式作用元件、JA响应元件、SA响应元件、ABA响应元件、防御及逆境响应元件、低温响应元件和热激响应元件等;qRT-PCR结果显示,MdPCKs在被检测的组织中均有表达。在‘泰山嘎啦’苹果果实不同发育阶段,MdPCK1和MdPCK2具有相似的表达模式。在多种非生物胁迫处理下,MdPCK1受到100 μmol·L^-1 ABA和100 g·L^-1 PEG胁迫诱导;MdPCK2受到150 μmol·L^-1 SA、100 μmol·L^-1 ABA、100 g·L^-1 PEG和低温胁迫诱导。【结论】MdPCK1和MdPCK2属于植物PEPCK家族,非生物逆境胁迫可诱导MdPCK1和MdPCK2表达。     

液相色谱-串联质谱法测定山药中10种杀菌剂残留

建立了同时测定山药中多菌灵、嘧霉胺等10种杀菌剂的液相色谱-串联质谱的分析方法。样品经乙腈提取、PSA分散固相净化,LC-MS/MS测定,外标法定量。在10.0 μg·kg^-1添加浓度时,回收率为88.6%~105.5%,相对标准偏差为2.7%~8.3%,10种化合物检测限为0.05~0.31 μg·kg^-1,定量限为0.10~0.62 μg·kg^-1。试验结果表明,此方法操作简便、快速、稳定性好、准确度高,适用于山药中杀菌剂类农药残留的快速测定。     

酶法降黏工艺在鲜甘薯直接发酵制备乙醇中的应用

【目的】建立鲜甘薯料液的酶法降黏工艺,并实现鲜甘薯料液不加水直接发酵制备乙醇。【方法】从中国甘薯主产区选择12个种植范围较广的淀粉型甘薯品种作试验材料。分析甘薯主要成分（干物质、淀粉、蛋白质、可溶性糖、果胶、半纤维素、纤维素和木质素）与鲜甘薯料液黏度的相关性并选择对应的降黏酶。研究料水比（1﹕0、2﹕1、3﹕2、5﹕4和1﹕1）、酶处理时间（1、2、3、4和5 h）、酶添加量（纤维素酶：1.0、1.5、2.0、2.5和3.0 GCU·g^-1;果胶酶：1.0、1.5、2.0、2.5和3.0 U·g^-1）和酶处理温度（30℃、40℃、50℃、60℃和70℃）对酶法降黏效果的影响。通过正交试验确定最佳酶处理条件,并分析其在不同品种鲜甘薯直接发酵制备乙醇中的效果。【结果】对于12个供试淀粉型甘薯品种,在所有组分中,除了半纤维素（r=-0.239）和木质素（r=-0.069）外,其他组分均与黏度呈正相关（干物率,r=0.356;淀粉,r=0.211,可溶性糖,r=0.307;蛋白质,r=0.266;果胶,r=0.526;纤维素,r=0.600）。其中,果胶（P＜0.01）和纤维素（P＜0.05）与料液黏度分别呈极显著和显著正相关性。根据极差分析发现,对酶处理效果影响由大到小的酶处理条件分别为酶用量、料水比、酶处理时间和酶处理温度。基于正交试验结果并考虑到工业应用的实际情况,确定最佳酶处理条件为：料水比1﹕0、纤维素酶1.5 GCU·g^-1、果胶酶1.5 U·g^-1、温度50℃、作用3 h。经过酶处理后,鲜甘薯料液黏度明显下降。除皖苏178号（4 930 cp）外,其余品种的料液黏度在经过酶处理后均低于3 000 cp,降黏幅度95.07%-99.31%。乙醇发酵结束后,11个甘薯品种的乙醇含量均高于12%（v/v）,其中有9个品种的发酵效率达到90%以上。【结论】果胶和纤维素是造成甘薯料液黏度高的主要成分。在液化前通过添加纤维素酶和果胶酶可以有效降低鲜甘薯料液黏度,并实现鲜甘薯料液不加水直接发酵制备乙醇。     

生长物质对彩色棉胚珠离体培养纤维发育的影响

【目的】天然彩色棉是理想的绿色、环保、健康纺织原料,建立并优化棕色棉和绿色棉胚珠离体培养体系,研究渗透压调节剂、植物生长调节剂和类黄酮代谢前体物质等生长物质对彩色棉胚珠培养纤维发育的影响,为彩色棉纤维色泽改良提供一定的理论基础。【方法】以棕1-61、RT白絮、绿棉CC28为材料,采用常规栽培管理方法种植,在开花当天标记棉铃,取开花后3 d的棉铃进行离体培养。所有处理均在BT培养基基础上添加10.0 μmol·L^-1的IAA和5.0 μmol·L^-1的GA₃,此外分别采用不同浓度的渗透压调节剂（甘露醇、氯化钠、氯化钾、蔗糖）、植物生长调节剂（茉莉酸甲酯、油菜素内酯）和类黄酮代谢前体物质（苯丙氨酸、阿魏酸）进行处理。除了考察油菜素内酯和茉莉酸甲酯交互作用的试验外,其他均为品种和处理的双因素试验。在离体培养30 d后观察纤维显色状况、测量纤维长度并称取胚珠鲜重、纤维干重和胚珠干重。试验中每个处理的数据均计算平均数和标准误,主要采用最小显著差数法或新复极差法进行多重比较。【结果】离体培养条件下彩色棉纤维在培养后15 d显色;适合彩色棉胚珠生长和纤维发育的最佳处理为5 g·L^-1蔗糖,其中棕1-61纤维长度、胚珠鲜重、纤维干重和胚珠干重比对照分别显著增加28.35%、20.69%、103.70%和75.84%（P＜0.05）,绿棉CC28纤维长度、胚珠鲜重、纤维干重和胚珠干重比对照分别显著增加8.10%、16.07%、63.14%和82.76%（P＜0.05）;0.05 μmol·L^-1MeJA处理时棕1-61纤维长度比对照显著增加22.90%（P＜0.05）,CC28纤维长度对照增加4.39%,差异不显著;0.5 μmol·L^-1BR处理使棕1-61、CC28纤维长度分别比对照显著增加22.46%和11.56%（P＜0.05）;25 μmol·L^-1阿魏酸处理下棕1-61、CC28纤维长度分别比对照显著增加了8.72%和8.81%（P＜0.05);添加适宜浓度的甘露醇（30 g·L^-1）、氯化钠（0.10 mol·L^-1）、氯化钾（0.20 mol·L^-1）、蔗糖（10 g·L^-1）、茉莉酸甲酯（40 μmol·L^-1）或者苯丙氨酸（0.10 mmol·L^-1）有利于棕色棉显色,其中40 μmol·L^-1茉莉酸甲酯效果最好;试验所用的生长物质处理下,绿色棉显色差异不大。【结论】蔗糖为彩色棉胚珠生长和纤维发育提供了糖源和渗透环境;适宜浓度的茉莉酸甲酯、油菜素内酯或阿魏酸有利于棕色棉和绿色棉纤维伸长发育;油菜素内酯和茉莉酸甲酯存在交叉作用,油菜素内酯主要参与纤维伸长过程中,而茉莉酸甲酯可能参与到棕色棉色素代谢过程中;一定浓度的甘露醇、氯化钠、氯化钾、蔗糖、茉莉酸甲酯或苯丙氨酸有利于棕色棉色素合成;渗透压调节剂、植物生长调节剂和类黄酮前体物质对绿色棉纤维显色作用不明显。     

基于数字图像技术的冬油菜氮素营养诊断

【目的】利用田间氮肥梯度试验探讨数字图像技术对冬油菜氮素营养无损评估预测的可行性,明确该技术的最佳数码参数和方程模型,为数字图像技术进行冬油菜氮素无损诊断提供依据。【方法】2013-2014年在湖北省武穴市开展不同施氮处理田间试验,以冬油菜为试验材料,设置不同氮素水平（0、90、180、270和360 kg·hm^-2）,分别于六叶期、十叶期、蕾薹期和开花期,利用数码相机获取冠层数字图像数据,同时采集植株样品分析其生长特征值,研究其相关性并建立氮素营养参数的方程模型。利用2014-2015年独立氮肥水平试验,对上述方程模型拟合精度进行验证并绘制1﹕1线性关系图。【结果】数字图像红光值（R）、红光标准化值（NRI）和绿光与蓝光比值（G/B）与冬油菜氮营养状况常规诊断指标地上部生物量、叶片氮浓度和叶绿素浓度等呈负相关关系,而绿光值（G）、蓝光值（B）、绿光与红光比值（G/R）、蓝光与红光比值（B/R）、绿光标准化值（NGI）和蓝光标准化值（NBI）则与上述指标呈正相关关系,红光标准化值（NRI）与其他数码参数相比能更好地表征冬油菜的氮素营养状况,蕾薹期红光标准化值NRI与氮肥用量、地上部生物量、叶片氮浓度、叶绿素浓度、氮素吸收量和氮营养指数之间的关系可分别用线性方程y(t·hm^-2)=-8.003x+2.706、y(t·hm^-2)=-106.072x+38.200、y(g·kg^-1)=-692.99x+ 261.84、y(mg·g^-1)=-12.750x+5.665、y(kg·hm^-2)=-4087.416x+1414.274和y=-27.198x+9.812来表达,其相关性达到极显著水平。2014-2015年独立试验模型检验结果表明,叶片氮浓度、叶绿素浓度和氮营养指数实测值与预测值的决定系数R²分别为0.917^**、0.746^**和0.953^**;均方根误差RMSE分别为0.821、0.330和0.228;相对误差RE %分别为26.32%、28.57%和28.39%,模型预测精度较好。【结论】数字图像技术可以用于冬油菜氮素营养的评估预测,评估时期为蕾薹期（包括）之前均可,最佳预测参数为红光标准化值NRI,参数的最佳方程模型为直线方程函数。     

不同苦瓜品种皂苷含量组成及其抗氧化活性和α-葡萄糖苷酶的抑制活性

【目的】比较不同品种苦瓜果肉中皂苷总含量、7种单体组成含量及抗氧化性和α-葡萄糖苷酶抑制活性差异,为明确苦瓜中主要皂苷单体组成含量,筛选高皂苷含量及高活性的苦瓜品种提供科学参考。【方法】采用香草醛-高氯酸法测定13个苦瓜品种皂苷总含量,高效液相法测定7种皂苷单体含量、总抗氧化能力指数(ORAC),并评价其抗氧化活性,采用4-硝基酚-2-D吡喃葡萄糖苷法测定α-葡萄糖苷酶抑制率,同时分析组成含量和活性之间的相关性。【结果】13个不同品种苦瓜果肉皂苷总含量呈显著性差异,含量变幅为(0.52—1.20)g/100g DW,平均值为0.79 g/100g DW,变异系数为21.65%。7种皂苷单体含量的平均值依次为:苦瓜苷A(Momorcharaside A)5.32μg·g-1 DW,苦瓜皂苷A(Momordicoside A)25.42μg·g-1 DW,Karaviloside XI 3.96μg·g-1 DW,苦瓜皂苷F2(Momordicoside F2)66.95μg·g-1 DW,苦瓜皂苷K(Momordicoside K)183.70μg·g-1 DW,(23E)-3β,7β,25-trihydroxycucubita-5,23-dien-19-al 40.13μg·g-1 DW,Kuguacin N 3.87μg·g-1 DW。不同品种苦瓜总皂苷ORAC指数变幅为2 747.76—15 584.07μmol Trolox·g-1,平均值为8 879.48μmol Trolox·g-1,变异系数为34.91%;α-葡萄糖苷酶IC50值变幅为1.55—4.96 mg·m L-1。【结论】不同品种苦瓜果肉皂苷总含量、单体组成含量、抗氧化活性和α-葡萄糖苷酶抑制率有显著差异。皂苷是苦瓜抑制α-葡萄糖苷酶活性的主要物质基础,但并非苦瓜抗氧化活性主要贡献物质。(23E)-3β,7β,25-trihydroxycucubita-5,23-dien-19-al是主要活性单体。     

肌注氟苯尼考在鸭疫里氏杆菌感染鸭体内的药动学特征

【目的】研究并比较肌注氟苯尼考在2周龄健康和鸭疫里氏杆菌感染鸭体内的药代动力学特征。【方法】240只鸭随机分为2组,各120只鸭,其中一组用鸭疫里氏杆菌腿部感染,分别以30 mg·kg~(-1)体重单剂量肌内注射氟苯尼考,采血点为给药前和给药后5、10、15、20、30、45 min和1、1.5、2、4、8、10、14 h。采用高效液相色谱法(HPLC)测定血浆氟苯尼考的浓度,采用紫外检测器检测,检测波长为223 nm,流动相为乙腈和水,其体积比为26和74,流速为1 m L·min-1,色谱柱为Agilent C18(4.6 mm×150 mm,5μm),进样量为20μL。药动学分析软件Win Nonlin 5.2.1以非房室模型拟合处理血药浓度-时间数据,计算相关的药动学参数,并用统计学软件SPSS17.0对药动学参数进行t检验统计学分析。【结果】氟苯尼考在健康鸭体内的峰浓度(Cmax)为(22.88±3.11)μg·m L-1,表观分布容积(Vd/F)为(2.39±0.81)L·kg~(-1),体清除率(ClB/F)为(0.64±0.11)L·h-1·kg~(-1),消除半衰期(t1/2β)为(2.57±0.51)h和药时曲线下面积(AUC)为(47.28±7.87)μg·m L-1·h;氟苯尼考在感染鸭体内的峰浓度(Cmax)为(19.77±1.82)μg·m L-1,表观分布容积(Vd/F)为(2.44±0.46)L·kg~(-1),体清除率(ClB/F)为(0.63±0.08)L·h-1·kg~(-1),消除半衰期(t1/2β)为(2.74±0.54)h和药时曲线下面积(AUC)为(48.11±6.62)μg·m L-1·h。统计分析氟苯尼考在健康鸭和感染鸭的药动学参数,结果表明,除了Cmax差异显著(P0.05),其他参数差异均不显著(P0.05)。【结论】两者的主要药动学参数相比较,感染鸭体内的Cmax显著低于(P0.05)健康鸭体内的C_(max),其他参数无显著性差异。氟苯尼考以30 mg·kg~(-1)体重肌内注射在健康和感染鸭体内具有吸收迅速,峰浓度高,体内分布广泛,消除较快的特点。     

咯菌腈对四种牡丹叶片病原真菌的抑制活性

【目的】探究咯菌腈对牡丹黑斑病菌(Alternaria suffruticosae)、黄斑病菌(Phyllosticta commonsii)、腔孢叶斑病菌(Hainesia lythri)和叶霉病菌(Cladosporium paeoniae)菌丝生长、孢子萌发、芽管伸长及产孢的抑制活性,分析咯菌腈在牡丹病害化学防治上的应用前景。【方法】采用菌丝生长速率法测定咯菌腈对菌丝生长的抑制活性,采用涂布平板法测定咯菌腈对孢子萌发、产孢时间及产孢量、芽管伸长及芽管和孢子形态的影响。【结果】咯菌腈对腔孢叶斑病菌菌丝生长的抑制作用最强,EC_(50)为0.01μg·mL~(-1),其次为黑斑病菌和黄斑病菌,分别为0.07和0.35μg·mL~(-1);咯菌腈对4种病菌的孢子萌发均有较强的抑制作用,对腔孢叶斑病菌的抑制作用最强,其EC_(50)为1.26μg·mL~(-1),对其他3种病菌孢子萌发的EC_(50)在3.27—3.45μg·mL~(-1);0.1μg·mL~(-1)咯菌腈对4种病菌分生孢子芽管伸长的抑制率在40%—70%,表明咯菌腈对4种病菌分生孢子芽管伸长均有明显的抑制作用,浓度越大抑制作用越强,各浓度间差异显著,其中对腔孢叶斑病菌芽管伸长抑制的EC_(50)为0.04μg·mL~(-1),抑制作用最强,对其他3种病菌芽管伸长的EC_(50)在0.08—0.22μg·mL~(-1);咯菌腈对黑斑病菌和黄斑病菌分生孢子和芽管的致畸作用强烈,可导致孢子及芽管膨大、过度分枝,而对叶霉病菌和腔孢叶斑病菌致畸作用较弱,芽管及孢子形态基本正常;咯菌腈可推迟黑斑病菌、黄斑病菌及叶霉病菌的产孢时间,对黑斑病菌产孢量的抑制作用最强,EC_(50)为0.05μg·mL~(-1),对叶霉病菌次之,EC_(50)为0.38μg·mL~(-1),但对腔孢叶斑病菌产孢有促进作用。【结论】咯菌腈对牡丹黑斑病菌及腔孢叶斑病菌的菌丝生长、孢子萌发及芽管伸长均有很强的抑制作用,但对腔孢叶斑产孢具有一定的促进作用;对叶霉病菌和黄斑病菌孢子萌发及芽管伸长、黄斑病菌菌丝生长及叶霉病菌产孢的抑制作用强烈;由于咯菌腈内吸活性较弱,无法抑制已侵入牡丹叶片的病原真菌的生长,故建议作为保护剂在病害发生前施用。     

NaCl浓度和pH对甘薯蛋白肽乳化特性的影响

【目的】明确不同NaCl浓度和pH对甘薯蛋白肽乳化特性的影响,为甘薯蛋白肽在食品工业中的应用提供理论依据。【方法】测定不同NaCl浓度（0.2、0.4、0.6、0.8和1.0 mol·L^-1）和不同pH（3、5、7和9）条件下,甘薯蛋白肽乳化液的显微结构、乳化颗粒平均粒径（d_4,3）、乳化活性、乳化稳定性、流变学性质和甘薯蛋白肽的表面疏水活性。【结果】与未添加NaCl的相比,添加浓度为0.2 mol·L^-1的NaCl时,甘薯蛋白肽乳化液的d_4,3由54.19 μm增大至59.70 μm;乳化活性指数由86.29 m²·g^-1显著降低为56.35 m²·g^-1（P＜0.05）;乳化稳定性指数由14.84 min降为13.19 min。然而,随着NaCl浓度的增大,甘薯蛋白肽乳化颗粒均一程度降低,d_4,3进一步由0.2 mol·L^-1时的59.70 μm增加至69.72 μm;而乳化活性由56.35 m²·g^-1逐渐降低至32.32 m²·g^-1,乳化稳定性呈先升高后降低的趋势,在0.4 m²·g^-1时达最大值,为15.55 min;初始表观黏度增大,并有剪切变稀现象发生;表面疏水活性降低。此外,随着pH增加,乳化颗粒均一程度升高,d_4,3由pH 3时的64.45 μm减小至pH 9时的51.21 μm;而乳化活性由pH 3时的3.99 m²·g^-1升高至pH 9时的120.47 m²·g^-1,乳化稳定性呈先降低后升高的变化趋势,pH 3时其最佳值为29.13 min;初始表观黏度降低,并有剪切变稀现象发生;表面疏水活性升高。【结论】甘薯蛋白肽的乳化特性与NaCl浓度和pH密切相关,添加≥0.2 mol·L^-1 NaCl降低了甘薯蛋白肽的乳化活性和稳定性,而增加pH可有效提高甘薯蛋白肽的乳化活性。     

褐藻酸寡糖诱导下大豆营养成分的变化

【目的】探索褐藻酸寡糖诱导大豆抗毒素生成和积累过程中,特别是当大豆抗毒素累积量达到最大时,大豆的异黄酮类化合物、氨基酸、寡糖、脂肪酸等营养成分的变化,为大豆的充分开发和利用提供科学依据。【方法】采用4%（w/v）的褐藻酸寡糖溶液作为诱导剂对大豆进行诱导。分别提取不同培养时间（0-6 d）下大豆中的异黄酮化合物、氨基酸、寡糖、脂肪酸等营养成分;利用高效液相色谱（HPLC）、全自动氨基酸分析仪、气相色谱（GC）等方法检测各培养时间下大豆营养成分的含量。【结果】经褐藻酸寡糖诱导后,大豆中的异黄酮化合物、氨基酸、寡糖、脂肪酸等含量均发生了变化。异黄酮类化合物中,大豆抗毒素的累积量在培养第5天时达到最高,由诱导前的0.01 mg·g^-1升高至1.72 mg·g^-1,第5天时香豆雌酚含量由开始时的15.74 μg·g^-1升高至664.8 μg·g^-1,染料木素含量由开始时的1.58 μg·g^-1升高至24.03 μg·g^-1,大豆苷元则由培养开始时的54.56 μg·g^-1降低至19.02 μg·g^-1。诱导组大豆中的总氨基酸含量由开始时的39.38%升高至43.45%,且苏氨酸、亮氨酸等必需氨基酸含量也有所升高,非诱导组大豆中的氨基酸含量也有一定程度的提高,但含量总体低于诱导组大豆。诱导组大豆中蔗糖含量由培养开始时的53.72 mg·g^-1减少至21.5 mg·g^-1,棉籽糖和水苏糖分别在培养第3天和第4天即被完全消耗;非诱导组大豆中蔗糖含量由培养开始时的53.72 mg·g^-1减少至23.09 mg·g^-1,且仍有少量的棉籽糖和水苏糖被检出。诱导组大豆中的脂肪酸总含量由培养开始时的14.27%降低至14.01%,但其中亚油酸的含量和比例有所增加。【结论】褐藻酸寡糖在诱导大豆获得最高大豆抗毒素含量时,增加了大豆中异黄酮类化合物含量,提高了大豆蛋白质的营养价值,消除了大豆中的胀气因子,并且在一定程度上提高了大豆的油脂品质。     

微黄青霉ZF1及其代谢产物对禾谷镰孢的抑菌活性

【目的】对前期从土壤中筛选获得的1株具有生防效果的微黄青霉（Penicillium minioluteum）ZF1,进一步分析其对禾谷镰孢(Fusarium graminearum)的抑菌效果,以及其培养滤液与化学药剂混配的抑菌能力和对玉米叶片、籽粒的侵染能力,明确该生防菌的开发利用价值,为防治禾谷镰孢引起的玉米茎腐病和穗腐病提供依据。【方法】采用菌丝生长速率法测定微黄青霉ZF1对禾谷镰孢的抑菌能力,微黄青霉ZF1培养滤液对禾谷镰孢的抑菌作用;通过玻璃纸法测定微黄青霉ZF1次生代谢产物对禾谷镰孢菌落生长的影响;比较咯菌腈、微黄青霉ZF1菌株培养滤液及咯菌腈和培养滤液混配3个处理对禾谷镰孢菌丝生长的抑制作用;分别在5叶期和乳熟期检测微黄青霉ZF1对玉米叶片和籽粒的侵染能力。【结果】微黄青霉ZF1能够明显抑制禾谷镰孢生长,抑制作用达到81.33%,抑菌面积为16.21 cm²;去玻璃纸PDA培养基上,ZF1菌株次生代谢产物对禾谷镰孢生长的抑制作用达到55.46%;菌株培养滤液稀释10、20、50和100倍后对禾谷镰孢菌抑制作用分别为81.04%、64.46%、22.67%和1.12%,但微黄青霉培养滤液对禾谷镰孢菌丝形态影响不明显;咯菌腈和微黄青霉菌培养滤液复配后对禾谷镰孢的抑制作用比二者单独使用有所增强,咯菌腈抑制禾谷镰孢菌丝生长的EC₅₀和EC₉₅值分别为0.0162和0.5287 μg·mL^-1;10%微黄青霉菌培养滤液和0.5 μg·mL^-1咯菌腈对禾谷镰孢的抑制率分别为86.45%和95.13%,二者复配后降低了对禾谷镰孢菌丝生长的EC₅₀和EC₉₅值,延长了作用时间,EC₅₀和EC₉₅值分别为0.0023和0.4011 μg·mL^-1,培养4 d后咯菌腈抑菌作用丧失,而0.5 μg·mL^-1咯菌腈与10%微黄青霉菌培养滤液复配后较0.5 μg·mL^-1咯菌腈单独作用时间延长了10 d。接种微黄青霉至玉米叶片和受伤的玉米籽粒,仅在叶片表面和伤口处产生微寄生霉层。【结论】微黄青霉ZF1菌株及其培养滤液对禾谷镰孢均有明显的抑制作用,咯菌腈和培养滤液复配对禾谷镰孢的抑制作用优于单独使用咯菌腈的处理。研究结果可为微黄青霉菌的开发应用提供依据,为禾谷镰孢茎腐病和穗腐病的防治开辟新途径。     

霍氏肠杆菌B4表面活性剂纯化鉴定及其应用

【目的】优化霍氏肠杆菌B4产表面活性剂的液体发酵条件,结合有机试剂萃取、高效液相色谱技术分离纯化所产表面活性剂,并利用质谱分析技术鉴定其结构,进一步研究其促进黄瓜吸收叶面肥的效果,为新型肥料的研制提供理论依据。【方法】利用正交试验优化霍氏肠杆菌B4产表面活性剂的发酵条件,主要包括碳源、氮源、初始pH、发酵温度、接种量、转数和发酵时间,不同处理的评价指标为发酵液的表面张力值,具有最低表面张力的处理为最佳的发酵条件;利用有机试剂萃取后旋转蒸发获得表面活性剂的粗提物;利用高效液相色谱技术,在柱温50℃、进样量为20μL、流速0.5 m L·min~(-1)、检测波长为210 nm条件下分离纯化表面活性剂,并结合傅里叶红外光谱技术分析其所含的不同官能团;在流速10μL·min~(-1)、毛细管电压3.88 k V、锥孔电压为53 V、离子源温度100℃、脱溶温度150℃条件下,利用质心模式进行全扫描,根据已有的质谱数据鉴定所产表面活性剂的结构;通过水培和盆栽试验,验证该表面活性剂提高黄瓜吸收叶面肥的效率。【结果】正交试验结果表明,在添加4%(v/v)甘油、3 g·L~(-1)硝酸钠、初始pH 6.0、6%接种量、35℃、200 r/min、发酵96 h的条件下,发酵液的表面张力下降到44.10 m N·m~(-1),为最优的发酵优化条件。在该优化条件下,生物表面活性剂的粗产物产量高达12.14 g·L~(-1),粗产物可使纯水的表面张力值最低降到34.14 m N·m~(-1)。液相分离结果表明,经有机试剂萃取粗提的生物表面活性剂在1.62—2.33 min处有典型的特征峰,说明该组分为生物表面活性剂粗提物中的主要成分。傅里叶红外光谱分析结果表明,纯化的生物表面活性剂中含有-CH_2、-CO和C-O等官能团,判断其为含碳链的生物表面活性剂。液质联用分析结果表明,m/z 701.54处为[M+Na]+,m/z 723.74处为[M-H+2Na]~+,将该生物表面活性剂鉴定为鼠李糖脂,其结构式为Rha-Rha-C_(10)-C_(12)。黄瓜水培结果表明,与只喷清水(CK)和只喷氨基酸(AA)的处理相比,添加生物表面活性剂的氨基酸叶面肥处理(AAB)的株高分别增加了79.59%和32.90%,鲜重分别增加了43.03%和23.98%。盆栽试验结果表明,与CK和AA处理相比,AAB处理的植株叶绿素含量分别提高了11.72%和10.69%。【结论】利用正交试验获得了霍氏肠杆菌B4产生物表面活性剂最佳液体发酵条件,在该条件下生物表面活性剂产量达到2.07g·L~(-1),并将其主要成分鉴定为鼠李糖脂(Rha-Rha-C_(10)-C_(12)),该物质可显著提高黄瓜对叶面肥的吸收效率,具有很好的应用前景。     

动物尿液中苯乙醇胺A胶体金快速检测方法的建立

【目的】苯乙醇胺A为一种新型违禁添加剂,目前的检测方法繁琐耗时,故建立动物尿液中苯乙醇胺A胶体金免疫层析快速检测方法。【方法】通过苯乙醇胺A与溴代戊醛发生亲核取代反应,制备得到苯乙醇胺A半抗原,将苯乙醇胺A半抗原与载体蛋白偶联得到免疫原和包被原,经TNBS法测定半抗原与载体蛋白偶联比。用免疫原免疫BALB/c小鼠,制备特异性单克隆抗体,采用间接竞争ELISA方法测定单克隆抗体的灵敏度。选取与苯乙醇胺A结构类似的13种同类药物利用间接竞争ELISA方法进行单克隆抗体特异性的测定,计算交叉反应率。并通过胶体金、单克隆抗体-胶体金标记物、结合物释放垫、反应膜、样品吸收垫的制备以及试纸条的组装,建立了动物尿液中苯乙醇胺A胶体金快速检测方法,测定试纸条的检测限、假阳性率、假阴性率以及与ELISA方法的检测猪尿样品结果比较,验证试纸条的准确度,其中ELISA方法的标准品浓度分别为0、0.1、0.3、0.9、2.7、8.1 μg·L^-1,对猪尿样品的最低检测限为0.5 μg·L^-1,回收率为75%-105%。【结果】苯乙醇胺A半抗原制备结果显示从苯乙醇胺A的氨基端引入末端代醛基的连接臂,得到苯乙醇胺A衍生物,即苯乙醇胺A半抗原。TNBS法测定结果显示苯乙醇胺A-BSA和苯乙醇胺A-OVA成功偶联,苯乙醇胺A半抗原-BSA偶联比为11.38,苯乙醇胺A半抗原-OVA偶联比为10.66。间接ELISA检测结果显示MC-73杂交瘤细胞株的上清效价为1﹕2×10³,腹水效价为1﹕5×10⁷,较MC-33和MC-29的效价高,抗苯乙醇胺A单克隆抗体对苯乙醇胺A的IC₅₀为0.365 μg·L^-1,较MC-33和MC-29的IC₅₀低,得到MC-73单克隆抗体腹水灵敏度最高。苯乙醇胺A单克隆抗体与克仑特罗、莱克多巴胺和沙丁胺醇等共13种苯乙醇胺A的同类化合物的交叉反应率均小于1%,试纸条检测限为5 μg·L^-1,假阳性率为0,假阴性率为0。检测实际动物尿液样品时,试纸条与ELISA测定结果没有差异。【结论】成功研制出灵敏、特异、简便、快速的苯乙醇胺A胶体金免疫层析试纸条,可直接检测动物尿液,无需样品前处理,反应只需5 min即可得到检测结果。适合中国基层兽药检测实验室和企业大批量样品集中筛查及现场检测。