基于简化基因组测序技术的番茄雄性不育基因定位

【目的】获得番茄雄性不育基因的候选基因,提高番茄雄性不育基因定位的准确性,为该雄性不育基因的克隆及功能机制研究提供理论基础。【方法】以一个与苗期绿茎基因紧密连锁的花粉败育型材料为母本,以一个苗期紫茎可育系为父本,通过集群分离(BSA)法分别建立30个F2单株的不育和可育DNA池,基于简化基因组测序(SLAF-Seq)技术检测足够量的简化基因组扩增片段,通过关联分析,获得目标雄性不育基因的候选区域,并利用GO数据库对关联区域内的基因进行功能注释。【结果】通过SLAF测序共获得20.27 Mb的序列量;共获得103 250个SLAF标签,标签整体平均深度达160.39倍;完成了2个混合池间SLAF标签标记的多态性分析,共获得多态性标记6 892个;利用2个混合池进行关联分析,共得到8个与目标雄性不育基因相关的候选区域,区域平均大小为0.29Mb,区域内共有27个差异标记,146个候选基因。【结论】利用SLAF测序技术对番茄雄性不育基因进行了初步定位。     

基于SLAF-seq技术的乔木柳SNP位点开发

【研究意义】采用SLAF-seq测序技术开发乔木柳SNP位点对乔木柳育种发展有重大意义。【方法】本研究根据两亲本和杂交的F1代遗传群体经亲本鉴定195株为研究对象,利用SLAF-seq测序技术进行测序。选择同科基因组大小相似的三角叶杨的基因组作为参考基因组,通过电子酶切预测,最终选择Hae III和Hpy166 II两种酶进行酶切试验,长度在314~364 bp之间的酶切片段序列定义为SLAF标签,预测可得SLAF标签126 008个,位于重复序列区的SLAF标签比例为1.60%。为进一步评估酶切方案的有效性与酶切效率,以水稻的测序数据为对照,通过SOAP软件比对水稻基因组(大小为382M)的测序reads与三角叶杨的基因组。【结果】通过研究得到双端比对效率为96.67%,酶切效率为92.06%,SLAF建库正常。采用本次研究中开发得到的SLAF标签277 333个,按照等位基因数和基因序列之间的差异,共获得99 526个多态性SLAF标签,比例达到35.89%。按照遗传学通用等位编码规则,成功编码了58 763个多态性SLAF标签。为构建遗传图谱进一步对SLAF标签进行过滤,最终获得6744个SLAF标签,进一步进行SNP位点的开发,在各连锁群上共开发得到9488个SNP位点。【结论】SLAF-seq技术可以很好地应用于乔木柳SNP位点的开发,可利用所开发的SNP标记,联系群体中不同个体的表型,关联定位与某性状紧密连锁的分子标记,进而可以实现优良基因的精细定位。     

基于SLAF-BSA技术的蝴蝶兰花底色关联SNP分子标记开发与验证

为筛选与蝴蝶兰花黄白底色相关的单核苷酸多态性(Single-nucleotide polymorphism,SNP)位点,以'黄金豹'蝴蝶兰(♀)和'白天使'蝴蝶兰(♂)及其杂交后代为实验材料,选择33个分布在5个不同颜色分布类型组群中的黄色底色杂交后代和仅有的2个纯黄色个体作为黄色底色群体,35个分布在对应5个颜色分布类型组群中的白色底色杂交后代作为白色底色群体,分别提取DNA并等量混合后构建2个不同底色DNA混池,采用特异位点扩增片段测序(SLAF-seq)结合BSA技术,对与花底色密切相关的候选标记进行鉴定。结果表明:共获得164 874个SLAF标签,其中含21 031个多态性SLAF标签,多态率为12.76%。SLAF标记在亲本中的平均序列深度为42×,在子代中的平均序列深度为46×。关联分析表明,在阈值0.745 5时,筛选得到15个与花底色相关的SLAF候选标记,具27个SNP位点。采用SNaPshot测序技术在2个亲本、11个子代和4个不同的种质资源中验证SNP位点,筛选发现,Marker35886和Marker70907的2个SNP位点与相关SLAF序列中的SNP位点一致,对花底色的鉴定准确率分别为66.67%和73.33%,组合准确率达93.33%。本研究筛选到的2个SNP位点可作为有效的分子标记位点在蝴蝶兰育种早期进行辅助选择。     

基于SLAF-seq技术鉴定苹果砧木耐涝候选基因

【背景】苹果（Malus×domestica Borkh）是我国主要栽培果树树种之一,但部分苹果产区由于夏、秋季的大量集中降雨和排水不良等造成果园涝害频繁发生,导致苹果树叶片黄化、脱落,果实品质和产量下降。【目的】鉴定苹果耐涝相关基因,为苹果耐涝分子标记辅助育种和优质高产栽培提供依据。【方法】以耐涝苹果砧木G41和不耐涝苹果砧木新疆野苹果（M. sieverii (Ledeb) Roem.）及其构建的包含495个F₁杂交后代为材料,从F₁杂交群体中挑选出耐涝和不耐涝株系各50株,构建两个极端性状DNA混池,采用简化基因组测序（SLAF-seq）技术,开发SLAF标签和SNP标记,结合苹果基因组信息和遗传关联性分析,对苹果耐涝基因进行定位及候选基因预测,并对候选基因在耐涝差异的株系中进行淹水胁迫下的表达分析。【结果】以‘金冠’苹果为参考基因组,共开发119 072个SLAF标签,其中多态性SLAF有11 133个。通过序列分析和检测SNP位点,共获得6 237 071个SNP,其中高质量SNP有170 617个。通过ED和SNP-index方法关联分析,获得一个与耐涝性状紧密关联的候选区域,位于苹果第10号染色体1.94—3.25 Mb,关联区域大小为1.31 Mb,关联区域内包含120个基因。对该区域内基因进行功能注释,发现一个与呼吸代谢相关的基因—乙醇脱氢酶基因ADH1（MD10G1014500）,在淹水处理后1、2、4和6 d,该基因在耐涝植株中的表达量显著高于不耐涝植株。【结论】将苹果耐涝基因定位于第10号染色体1.94—3.25 Mb处,筛选到可能与苹果耐涝相关的候选基因MD10G1014500,可用于苹果耐涝基因的克隆和功能解析。     

基于SLAF-seq技术的甘薯SNP位点开发

【目的】单核苷酸多态性（SNP）是基因组中最普遍的遗传变异,是构建遗传图谱、完成分子标记辅助育种的一种非常重要的遗传标记。新一代高通量测序平台为SNP位点的检测提供了强有力的技术支持。多倍体作物通常表现为基因组序列大且重复比例高,一直以来多倍体作物的SNP位点挖掘面临巨大的挑战。【方法】共收集300份甘薯种质资源,利用SLAF-seq测序技术进行测序。首先以马铃薯基因组为参照,通过生物信息学分析进行实验方案的系统设计,筛选特异长度的DNA片断,构建SLAF-seq文库。后通过高通量测序的方式获得海量序列,进而通过软件分析比对,获得多态性SLAF标签,最后在多态性SLAF标签上开发大量特异性SNP位点。【结果】对照拟南芥的测序数据与其参考基因组进行比对的结果表明,双端比对效率在本试验中为87.71%,酶切效率为93.22%,说明本试验SLAF建库正常。通过测序共产生498.14 Mb的读长数据,测序后各样品所获得的读长数目在441 595-2 731 920范围内,其中,冀薯4号获得的数据量最大,共计获得2 731 920个读长,对照拟南芥数据量最小,共计获得441 595个读长。测序质量值Q30的范围在88.37%-90.67%,样品3043 Q30测序值仅为87.31%,样品鄂紫1号Q30测序值为91.31%,所有样品Q30值均在80%以上。测序获得GC含量的范围在37.23%-38.09%,样品苏薯9号和浙薯2号存在极端值,样品苏薯9号的GC含量在39.80%,样品浙薯2号GC含量在37.10%,所有样品GC含量均值为37.64%,GC含量普遍不高,说明达到测序要求。本研究共计获得597 094 个SLAF标签,样品的平均测序深度为11.77×,其中多态性SLAF标签260 000个,占SLAF标签总数的43.54%。根据所获得的260 000个多态性SLAF标签来统计SNP位点信息,共计获得795 794个群体SNP位点。【结论】共获得498.14 Mb的读长数据,597 094个高质量的SLAF标签,260 000个多态性SLAF标签,从260 000个多态性SLAF标签上共计开发获得795 794个高质量SNP位点。表明SLAF-seq技术可以很好地应用于甘薯SNP位点的开发,其效率远远高于SSR、AFLP、RAPD等分子标记技术。从全基因组范围获得的SNP位点可以进一步的用来完成后续群体进化分析和特异性SNP标记的开发。     

林麝FSHβ、LHβ基因多态位点与产香性能关联分析

【目的】为加快高产香林麝群体的选育,本文通过分析FSHβ和LHβ基因多态性位点与产香性能的关联性,以期从遗传水平上寻找林麝产香性能标记位点。【方法】研究利用新一代测序技术,采用DNA混池测序方法对100个林麝血液样本进行SNP扫描,重点关注2个候选基因的基因区或上下游2 kb区域;运用质谱分析,对74只林麝的20个候选SNP位点进行定位分析;再结合生产实际,利用产香数据与这些SNP位点进行关联分析。【结果】位于FSHβ的2个SNP和LHβ的1个SNP位点与林麝泌香性能高度相关(P0.05);这3个SNP均位于基因的非编码区,提示这些突变位点可能与顺式调控作用有关。【结论】3个突变位点的发现可作为分子标记运用于林麝的人工选育,并为高产香林麝群体培育选种提供辅助依据。     

调控玉米株高和穗位高候选基因Zmdle1的定位

【目的】株高是玉米株型育种的重要目标性状之一,不仅与玉米籽粒的机械化收获及抗倒伏相关,也与玉米产量密切相关。因此,挖掘玉米株高 QTL/基因并解析其功能具有重要的理论和育种价值,定位一个新的玉米矮秆基因 ZmDLE1,阐明其生物学功能,为加速改良玉米的株型提供重要的理论依据和基因资源。【方法】利用化学诱变剂甲基磺酸乙酯(EMS)诱变甘肃省农业科学院作物研究所自育玉米骨干自交系 LY8405,M₂后代分离获得一个单基因调控隐性遗传的玉米矮秆低穗位突变体,M₃、M₄后代能稳定遗传,命名为 dwarf and low ear mutant1(Zmdle1),通过与 Mo17 杂交构建 F₂分离群体,借助极端性状混池测序分析法(BSA-seq)及目标区段重组交换鉴定的方法,基于 Mo17 参考基因组对目标区段内的基因进行挖掘和功能注释,定位候选基因。【结果】开展了 Zmdle1 表型鉴定,突变体 Zmdle1 苗期表型与对照 LY8405 无显著性差异,成熟期植株株高和穗位高较 LY8405 分别降低 87...     

基于温带和热带玉米群体全基因组FST和XP-EHH的选择信号检测

【目的】玉米起源于热带地区,经过自然和人工选择,广泛的种植于温带地区。开花是玉米生长发育的中心环节,也是热带玉米向温带环境种植的主要适应性性状。鉴定玉米在驯化过程中出现的受选择基因区段,并进一步挖掘开花候选基因,为玉米的群体改良、开花遗传机理解析提供数据支撑。【方法】首先单独分析30份温带玉米自交系和21份热带玉米自交系的单倍型数据,通过过滤高缺失和等位基因频率较低的变异位点,得到高质量的SNP（single nucleotide polymorphism）标记,利用SnpEff软件对温带和热带玉米群体的基因组多态性位点进行了功能预测。其次过滤得到同时存在于温带和热带玉米的高质量SNP标记,对温带和热带玉米的基因型数据进行主成分分析（principle component analysis,PCA）以确定其群体结构,之后利用群体分化指数（fixation index,F_ST）和群体间扩展单倍型纯合度（cross population extended haplotype homozygosity,XP-EHH）法分析温带和热带玉米群体间的选择信号分布情况,选择F_ST和XP-EHH值的top 1%为阈值,筛选得到受选择位点。通过对SNP进行功能注释得到温热带玉米群体受到选择的基因。利用agriGO工具对候选驯化基因进行功能富集分析。利用相关的生物信息学数据库对候选基因进行功能注释,进一步鉴定玉米驯化过程中的开花候选基因。【结果】通过对温热带玉米群体的高测序深度的SNP进行分析,发现热带玉米群体的SNP数目为14 123 408个,温带玉米群体的SNP数目为8 791 673个,鉴定到的SNP主要分布于基因间区。2个群体中均存在的SNP标记数目是204 752个。主成分分析表明温带和热带玉米可以显著的分为两个类群。F_ST选择信号的top 1%是0.3593,共鉴定到557个候选驯化基因,XP-EHH选择信号法的top 1%是3.2681,共鉴定到1 913个候选基因。鉴定到多个候选基因与玉米的开花调控密切相关,包括ZmCCT9、COL1、GRMZM2G387528。如ZmCCT9抑制开花基因ZCN8的表达,导致玉米在长日照环境下出现晚花表型,是一个重要的开花调控基因;COL1与开花促进因子FT蛋白互作,加速玉米开花以适应长日照环境;GRMZM2G387528的功能注释揭示该基因是一个光敏色素互作因子,与光周期基因ZmphyB1互作。【结论】热带玉米群体具有更高的遗传多态性,筛选到一系列参与了热带玉米和温带玉米的分化候选基因,并且重点挖掘了参与其中的玉米开花调控相关基因。     

厚皮甜瓜心部果肉蔗糖含量QTL定位及候选基因分析

【目的】运用QTL分析厚皮甜瓜心部果肉蔗糖含量,挖掘影响该性状的候选基因,为厚皮甜瓜甜味性状的遗传改良奠定理论基础。【方法】以高糖材料VZX(V醉仙)为母本和低糖材料HP(高代自交系)为父本杂交衍生的F₂群体为研究对象,利用高效液相色谱仪测定果实赤道位置心部果肉蔗糖含量,从F₂群体中挑选蔗糖含量极端高和极端低的单株各20个,分别构建高蔗糖池和低蔗糖池,对双亲及混合池均进行全基因组重测序(约20×覆盖深度),定位蔗糖性状的关联区间,并结合生物信息学分析候选基因。【结果】厚皮甜瓜心部果肉蔗糖含量在F₂群体中基本呈正态分布,符合典型的数量性状遗传特征;对双亲及混池进行全基因组重测序,共获得有效数据32.62 G,Q20在95%以上,平均覆盖深度为17.76,比对到参考基因组上的总reads数目比例在98.72%~99.02%,测序数据质量高,参考基因组选择合理有效;在8号染色体定位到1个3.29 Mb的区间,共注释到108个基因;在初定位区间内获得1个参与糖酵解和糖异生生化过程的候选基因EVM0000647,在高糖和低糖亲本间编码区无非同义突变,但启动子区域具有大量差异位点,且表达量具有明显差异。【结论】极端混池测序(BSA)方法,在8号染色体上定位到1个影响厚皮甜瓜心部果肉蔗糖含量的QTL,大小为3.29 Mb,共注释到108个基因,其中候选基因EVM0000647,通过差异表达负调控厚皮甜瓜心部果肉蔗糖的积累。     

基于BSA分析技术对陆地棉抗旱基因的鉴定

【目的】研究抗旱相关的候选基因，为棉花抗旱性鉴定与评价和抗旱基因的挖掘提供理论依据。【方法】以陆地棉石远321和奎85-174为亲本构建重组自交系中选取的20份极端抗旱和旱敏感材料，将筛选的极端材料分别构建极端抗旱池、极端敏旱池，与亲本进行BSA测序分析，以陆地棉基因组为参考，通过BSA测序分析，挖掘抗旱相关的候选基因。【结果】关联到3个相关的候选区域，候选区域的总长度为6.12 Mb,其中共包含86个基因。结合GO注释、KEGG通路和前期筛选出的5个关键指标，共筛选出5个候选基因。【结论】5个基因在叶片中的表达量显著高于根和茎，并且在抗旱性强材料中的表达量均高于抗旱性弱的材料，且总体呈先上升后下降的趋势。     

甜瓜SLAF图谱构建及果实相关性状QTL分析

【目的】通过对甜瓜果实相关性状进行QTL定位及候选基因分析,为甜瓜品质育种及基因挖掘与功能验证提供理论基础。【方法】利用薄皮甜瓜1244为母本、厚皮甜瓜M5为父本配置杂交组合,结合SFLA测序技术开发分子标签,构建高密度遗传图谱,以F_2:3表型数据为基础,采用Mapqtl进行QTL定位分析。【结果】获得了380 446 Mreads（83.12 Gb）数据,测序平均Q30为93.59%,平均GC含量为36.87%;开发了112 844个SLAF标签,3 274 879个SNP;构建了12个连锁群,共计10 596个上图标记,总图距为1 383.88 cM,标记间平均距离为0.13 cM,上图标记完整度平均为99.92%。将控制甜瓜果面沟性状基因（fst）定位在第11条染色体末端Marker 1993423（62.18）—Marker 1998820（63.05）,覆盖基因组0.72 Mb,包含33个候选基因;控制甜瓜果皮花纹基因（fpp）定位在第2条染色体Marker 459584（90.91）—Marker 459446（90.91）,覆盖基因组0.08 Mb,包含5个候选基因,其中MELO3C026292（1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构酶）可能为控制果皮花纹的候选基因;同时检测到甜瓜果皮底色1个QTL位点fpc,位于第7条染色体Marker 1229174（7.14）—Marker 1229973（7.14）,贡献率为9.9%;检测到果型指数1个QTL位点fs9.1,位于第9条染色体Marker 1705671（76.19）—Marker 1705915（79.23）,贡献率为7.6%;在第1、2、6、7、10染色体检测到单果重相关6个QTL位点（sfw1.1、sfw2.1、sfw2.2、sfw6.1、sfw7.1、sfw10.1）,贡献率在3.1%—17.0%,LOD值介于3.0—5.6。【结论】将甜瓜果面沟、果皮花纹基因分别定位在第11和第2条染色体,分别获得33个和5个候选基因;检测到1个果皮底色QTL位点、1个果型指数QTL位点和6个单果重QTL位点。     

甜樱桃DFR基因内含子2和内含子3的多态性

【目的】研究70个甜樱桃品种DFR基因多态性与果皮颜色的相关性。【方法】通过DNA序列分析,以不同果皮颜色的10个甜樱桃品种（Prunus avium L.）为材料,检测DFR基因的多态性。根据多态性出现的位点设计特异引物,通过PCR扩增检测70个甜樱桃品种DFR基因的多态性。【结果】获得甜樱桃DFR基因约1 kb的片段,测序结果用BLAST分析发现,其核苷酸序列与樱桃李（Prunus cerasifera）的核苷酸相似性为80 %,预测的氨基酸序列与已知的甜樱桃（P. avium）DFR氨基酸序列相似性达99 %。该片段由3个外显子和3个内含子组成,2个多态性位点分别在内含子2和内含子3上。在黄色、黄底红晕和红色果皮3个组的70个甜樱桃品种中发现3个单倍型,共5种单倍型组合。通过SAS 9.0软件分析发现,所检测到的DFR基因的等位基因频率在黄底红晕果皮品种组和红色品种果皮组中的分布无显著差异。【结论】本研究在甜樱桃DFR基因座上得到2个差异位点,分别在内含子2和内含子3内,其优势基因频率依次为：0.864和0.679;但未发现DFR基因内含子2和内含子3的多态性与果皮颜色之间存在直接关系。     

基于高密度SNP标记的苹果属15种植物资源的亲缘关系与遗传结构分析

【目的】基于高通量简化基因组测序技术在全基因组开发的SNP标记,对中国原产苹果属植物种内和种间的亲缘关系和群体遗传结构解析,为苹果属植物的起源演化以及系统分类提供理论依据。【方法】对427份15种中国原产苹果属植物种质资源进行高通量简化基因组测序（SLAF-seq）,基于获得的SLAF标签,利用BWA软件将其通过比对定位到参考基因组上并获得多态性SLAF标签;利用GATK和SAMtools两种方法在多态性SLAF中开发多态性单核苷酸（SNP）,筛选两种方法共同得到的SNP作为开发的SNP标记数据集。根据完整度>0.94、次要等位基因频率（MAF）>0.05过滤筛选获得多态性的SNP。基于筛选多态性SNP,使用MEGA7的NJ（neighbor-joining）算法,构建苹果属不同种的系统进化树。利用Admixture软件进行群体遗传结构分析,假设样品的分群数（K）为1—15进行聚类,根据交叉验证错误率确定最佳K值,解析苹果属不同种间和种内的遗传结构。【结果】通过SLAF-seq技术对427份苹果属植物种质进行测序,最终获得586 454个SLAF标签,其中多态性SLAF标签463 612个。经过序列比对分析和筛选得到46 460个SNP位点,基于这些SNP位点构建苹果属植物不同种的系统发生树并分析群体结构。系统发育分析将15种苹果属植物分成4个类群,群体遗传结构在K=5和K=14为两个分群关键点。综合两种分析方法的结果,15种苹果属植物可分为4个基本的类群,分别为山荆子类群,新疆野苹果和少数中国苹果类群,变叶海棠、花叶海棠、陇东海棠、山楂海棠、滇池海棠和沧江海棠类群,4个苹果属植物栽培种中国苹果、八棱海棠、花红和楸子类群。中国苹果的部分种质中有新疆野苹果和山荆子的基因背景,但其中还有一部分种质可以独立代表类群基因库,其基因库中并没有新疆野苹果的参与,而与山荆子、花红、楸子和八棱海棠密切相关。【结论】利用SLAF技术快速发掘覆盖全基因组的46 460个多态性SNP标记可有效地对中国原产苹果属植物种内和种间的亲缘关系及遗传结构进行研究,为苹果属植物种质资源的鉴定评价、遗传多样性、系统分类和起源演化提供参考。15种苹果属植物分为4个基本类群,苹果属植物野生种和栽培种分类群明显,中国苹果与其他栽培种的亲缘关系密切。     

马铃薯红色薯肉调控基因的精细定位与候选基因分析

【目的】薯肉颜色是马铃薯重要的农艺性状,它直接影响马铃薯的营养和商品价值,一直是马铃薯遗传研究和育种改良的重要目标。本研究通过对二倍体红色薯肉分离群体的混池分析、基因精细定位和候选基因表达分析,确定调控红色薯肉的候选基因,为下一步基因功能、遗传调控研究及彩色马铃薯的分子育种奠定基础。【方法】本研究通过向二倍体红色薯肉亲本导入自交不亲和抑制基因Sli获得BC₁S₁群体,从300个单株中挑选18株红色薯肉和21株黄色薯肉个体提取基因组DNA,分别测序进行混池分析。通过集团分离分析法（bulked segregation analysis,BSA）对基因进行初步定位;在定位区间内开发分子标记,对796份BC₁S₁植株进行基因型分析,筛选交换单株,并结合表型对基因进行精细定位;借助参考基因组注释信息和qRT-PCR表达量分析确定候选基因。【结果】本研究通过构建薯肉颜色分离的二倍体BC₁S₁群体,利用BSA-seq分析把调控薯肉花青素合成的主效位点定位在第10号染色体48.70—52.20 Mb。最终,利用分子标记将该基因定位于51.47—51.85 Mb的377 kb区间内。基于参考基因组注释信息,此区间包括5个基因,其中2个基因注释为MYB类转录因子,结合表达量数据推测这2个基因为候选基因,编号分别为PGSC0003DMG400013966、PGSC0003DMG400013965。【结论】本研究将调控马铃薯薯肉花青素积累的一个主效位点定位于第10号染色体51.47—51.85 Mb之间,推测PGSC0003DMG400013966和PGSC0003DMG400013965为候选基因。     

簇毛麦易位系V9125-2抗条锈基因YrWV的遗传分析和SSR分子标记

[目的]对高抗条锈病的簇毛麦易位系V9125-2进行研究,明确其抗病性遗传特点,并对其抗条锈病基因定位,为选育优质抗源材料提供依据.[方法]采用中国当前流行的7个条锈菌生理小种CYR29、CYR30、CYR31、CYR32、CYR33以及Su11-4、Su11-11对簇毛麦易位系V9125-2和铭贤169的杂交后代进行...     

玉米籽粒淀粉粒密度基因tw1的精细定位

【目的】淀粉粒密度影响籽粒容重,通过对一个玉米籽粒淀粉粒密度突变体Mrd进行鉴定和精细定位,为容重相关基因的克隆和功能验证奠定基础。【方法】以育种选系过程中发现的一个淀粉粒密度突变体Mrd为材料,利用近红外光谱分析仪检测其籽粒内部化学成分的变化,用扫描电镜观察授粉后18-45 d正常籽粒和突变籽粒中淀粉粒形态的差异;于2014-2016年分别在河南郑州和原阳以及海南三亚种植Mrd与B73的杂交组合及F₂和BC₁分离群体,并对其进行遗传分析;使用来自maizeGDB（http://www.maizegdb.org）的覆盖全基因组的1 000对SSR引物,通过集团分离分析法（bulked segregation analysis,BSA）筛选与目的基因紧密连锁的标记,实现目的基因的初步定位;并在该定位区间内开发新的标记,对从38 000 BC₁分离群体中筛选出的交换单株进行基因型分析,实现目的基因的精细定位;通过候选基因序列分析、功能预测和等位性测验确定首选候选基因。【结果】该突变体籽粒较正常籽粒体积变小,比重增加;细胞学和化学组份分析结果表明,与野生型籽粒相比,突变体籽粒中的粗蛋白含量降低,粗淀粉含量没有显著变化,淀粉粒形状不规则且变小、密度增加,可能是导致籽粒容重变大的原因;对授粉后不同天数籽粒内部淀粉粒结构的观察显示,突变体籽粒淀粉粒的密度比正常籽粒密度大,并随发育进程不断增加;对Mrd与B73的F₂及测交后代分离群体的遗传分析结果表明,Mrd籽粒突变是由单隐性基因（命名为tw1）控制的;该基因首先被定位在第6染色体的SSR标记umc1105和bnlg1154之间,物理距离为22 Mb;利用上述2个标记对BC₁群体进行交换单株筛选,并开发标记,将该基因定位于SSR标记B3和A47之间,物理距离为0.2 Mb;在该候选区段内有包含su2在内的3个候选基因,等位性测验结果表明,tw1与su2不是等位基因;候选基因序列分析和功能预测结果表明GRMZM2G042607编码的蛋白具有碳水化合物识别结构域,在种子中对碳水化合物的储藏起沉积作用,是tw1最可能的候选基因。【结论】实现了籽粒淀粉粒密度突变性状基因tw1的精细定位,并确定了候选基因为编码一种β-1,3半乳糖基转移酶的GRMZM2G042607。