甜瓜SLAF图谱构建及果实相关性状QTL分析

【目的】通过对甜瓜果实相关性状进行QTL定位及候选基因分析,为甜瓜品质育种及基因挖掘与功能验证提供理论基础。【方法】利用薄皮甜瓜1244为母本、厚皮甜瓜M5为父本配置杂交组合,结合SFLA测序技术开发分子标签,构建高密度遗传图谱,以F_2:3表型数据为基础,采用Mapqtl进行QTL定位分析。【结果】获得了380 446 Mreads（83.12 Gb）数据,测序平均Q30为93.59%,平均GC含量为36.87%;开发了112 844个SLAF标签,3 274 879个SNP;构建了12个连锁群,共计10 596个上图标记,总图距为1 383.88 cM,标记间平均距离为0.13 cM,上图标记完整度平均为99.92%。将控制甜瓜果面沟性状基因（fst）定位在第11条染色体末端Marker 1993423（62.18）—Marker 1998820（63.05）,覆盖基因组0.72 Mb,包含33个候选基因;控制甜瓜果皮花纹基因（fpp）定位在第2条染色体Marker 459584（90.91）—Marker 459446（90.91）,覆盖基因组0.08 Mb,包含5个候选基因,其中MELO3C026292（1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构酶）可能为控制果皮花纹的候选基因;同时检测到甜瓜果皮底色1个QTL位点fpc,位于第7条染色体Marker 1229174（7.14）—Marker 1229973（7.14）,贡献率为9.9%;检测到果型指数1个QTL位点fs9.1,位于第9条染色体Marker 1705671（76.19）—Marker 1705915（79.23）,贡献率为7.6%;在第1、2、6、7、10染色体检测到单果重相关6个QTL位点（sfw1.1、sfw2.1、sfw2.2、sfw6.1、sfw7.1、sfw10.1）,贡献率在3.1%—17.0%,LOD值介于3.0—5.6。【结论】将甜瓜果面沟、果皮花纹基因分别定位在第11和第2条染色体,分别获得33个和5个候选基因;检测到1个果皮底色QTL位点、1个果型指数QTL位点和6个单果重QTL位点。     

多环境下玉米保绿相关性状遗传位点的挖掘

【目的】功能性保绿通常被认为是包括玉米在内的主要作物品种的理想性状。挖掘新的控制玉米保绿相关位点和候选基因,为玉米保绿遗传研究提供理论基础。【方法】以150份由许178和K12组配的重组自交系（recombinant inbred lines,RIL）群体为材料,通过Windows QTL Cartographer V2.5的复合区间作图法（composite interval mapping,CIM）对3个保绿相关性状（保绿度（visual stay green,VSG）、吐丝期绿叶数（green leaf number at silking stage,GLNS）和成熟期绿叶数（green leaf number at mature stage,GLNM））进行QTL定位。同时,以139份自然材料组成的关联群体为材料,基于混合线性模型（mixed linear model,MLM）,结合50 790个高质量SNP标记,对这3个性状进行全基因组关联分析（genome-wide association study,GWAS）。【结果】基于CIM,利用单环境下的表型值和最佳线性无偏估计值（best linear unbiased prediction,BLUP）对GLNM、GLNS和VSG进行定位,共检测到37个QTL,分布在除第10染色体以外的其他染色体上,LOD范围为2.58—11.36,表型贡献率为4.34%—22.40%。GLNM、GLNS和VSG性状分别检测到14、12和11个位点。其中,4个遗传稳定的QTL（qGLNS2-1、qVSG1-1、qVSG1-2和qVSG7-1）,在3个及以上不同单环境中同时被检测到。利用MLM对保绿相关性状进行全基因组关联分析,共检测到44个超过阈值线的显著SNP,根据SNP标记在B73参考基因组的物理位置,发现共有15个位点落在连锁分析定位到的QTL区间内。【结论】通过QTL定位和全基因组关联分析共同检测到4个遗传稳定的共定位遗传区段（对应的B73参考基因组V4版物理位置区间为第1染色体6.2—8.2 Mb、第2染色体209.1—221.4 Mb、第6染色体96.8—102.1 Mb、第7染色体4.9—11.4 Mb）,并挖掘到4个与光合作用和抗逆相关的候选基因（Zm00001d006119、Zm00001d018975、Zm00001d006535和Zm00001d036763）。     

基于简化基因组测序技术的番茄雄性不育基因定位

【目的】获得番茄雄性不育基因的候选基因,提高番茄雄性不育基因定位的准确性,为该雄性不育基因的克隆及功能机制研究提供理论基础。【方法】以一个与苗期绿茎基因紧密连锁的花粉败育型材料为母本,以一个苗期紫茎可育系为父本,通过集群分离(BSA)法分别建立30个F2单株的不育和可育DNA池,基于简化基因组测序(SLAF-Seq)技术检测足够量的简化基因组扩增片段,通过关联分析,获得目标雄性不育基因的候选区域,并利用GO数据库对关联区域内的基因进行功能注释。【结果】通过SLAF测序共获得20.27 Mb的序列量;共获得103 250个SLAF标签,标签整体平均深度达160.39倍;完成了2个混合池间SLAF标签标记的多态性分析,共获得多态性标记6 892个;利用2个混合池进行关联分析,共得到8个与目标雄性不育基因相关的候选区域,区域平均大小为0.29Mb,区域内共有27个差异标记,146个候选基因。【结论】利用SLAF测序技术对番茄雄性不育基因进行了初步定位。     

春小麦籽粒主要品质性状的全基因组关联分析

【目的】挖掘小麦籽粒品质性状显著相关的SNP位点及候选基因,并揭示其遗传机理,为相关基因克隆和分子标记辅助选择提供理论依据。【方法】通过检测298份国内外春小麦品种（系）5个环境下蛋白质含量、湿面筋含量、沉降值、淀粉含量、籽粒硬度、出粉率和容重等7个籽粒品质性状的表型,并结合小麦55K SNP芯片,采用Q+K关联混合模型进行全基因组关联分析（genome-wide association study,GWAS）。【结果】外引品种（系）、地方品种（系）和育成品种（系）的7个品质性状在不同环境下的变异系数分别为1.3%—13.4%、1.1%—18.6%和1.0%—13.9%。其中,外引品种（系）的蛋白质含量、湿面筋含量和沉降值的变异系数均为最高;新疆自育品种的淀粉含量、籽粒硬度和出粉率的变异系数最大,而新疆地方品种的蛋白质含量、湿面筋含量、沉降值、淀粉含量、籽粒硬度和出粉率6个品质性状的变异系数均介于外引品种（系）和新疆自育品种（系）之间。群体结构分析表明,298份小麦品种（系）可分为3个亚群。其中,亚群1包含128份（43.0%）试验材料,主要是来自新疆的地方品种（系）;亚群2包含24份（8.1%）试验材料,主要包括外引品种（系）和新疆地方品种;亚群3包含146份（48.9%）试验材料,主要是外引品种（系）。连锁不平衡分析表明A、B和D基因组及全基因组的LD衰减距离分别为10、10、6和8 Mb,依据全基因组的LD衰减距离,将在物理图谱上前后8 Mb区间内的位点认定为一个候选位点。通过GWAS共检测到85个与7个小麦籽粒品质性状显著关联的稳定位点（P<0.001）贡献率为3.7%—10.9%。在1B、1D、2D、3A、3D、4A、4B、5A、6A、6D、7A和7D染色体上均检测到稳定且同时与多个性状关联的位点。其中,7A染色体上的AX-109452823—AX-110545157同时与蛋白质含量、淀粉含量、湿面筋含量、沉降值、出粉率和籽粒硬度相关,且同时在4个环境中均被检测到。对稳定的位点进行候选基因发掘,筛选到10个可能与小麦籽粒品质相关的候选基因。其中TraesCS4A01G299800（阳离子氨基酸转运蛋白）、TraesCS7A01G059500（色氨酸脱羧酶）、TraesCS7A01G331200和TraesCS7D01G418700（木葡聚糖内转葡糖基酶/水解酶）对调控小麦籽粒氨基酸含量有重要作用。【结论】检测到85个稳定的且与小麦籽粒品质性状关联的位点,并筛选出10个与小麦籽粒品质性状相关的候选基因。     

西瓜果肉柠檬黄色的遗传分析和基因定位

【目的】对西瓜白色和柠檬黄色果肉的色素成分、色素含量、遗传规律进行研究,通过BSA-seq进行基因定位,并预测与柠檬黄色果肉相关的候选基因,为深入研究西瓜柠檬黄色果肉的遗传与分子机制奠定理论基础。【方法】本研究选用‘冰糖脆’（Ⅰ P₁,白色果肉）和‘喜华’（Ⅰ P₂,柠檬黄色果肉）,‘萨省奶油瓜’（Ⅱ P₁,白色果肉）和‘新金兰选’（Ⅱ P₂,柠檬黄色果肉）4份纯合自交系材料为亲本分别配置杂交组合,构建了两个六世代群体。利用高效液相色谱法（HPLC）对4个亲本材料4个不同发育时期的类胡萝卜素组分和含量进行测定。利用集群分离分析法（bulked segreant analysis,BSA）实现对两个BSA-seq群体（BSA-seq Ⅰ和BSA-seq Ⅱ）的初定位,然后根据西瓜参考基因组‘97103’V2注释信息挖掘候选基因,并通过实时荧光定量PCR（qRT-PCR）对候选基因进行验证。【结果】在西瓜果实发育过程中,紫黄质和叶黄素在双亲中差异性积累,其中紫黄质具有更高的含量,且在柠檬黄色果肉中的含量显著高于白色果肉。成熟期西瓜白色果肉中紫黄质含量为（10.96±4）μg·g^-1DW,柠檬黄果肉中紫黄质含量为（22.84±2）μg·g^-1 DW;成熟期西瓜白色果肉中叶黄素含量为（2.23 ±1）μg·g ^-1 DW,柠檬黄果肉中叶黄素含量为（3.97±1）μg·g^-1 DW。在构建的两组六世代分离群体中,Ⅰ F₁、Ⅱ F₁、Ⅰ BC₁P₁、Ⅱ BC₁P₁群体西瓜果肉颜色均为非柠檬黄色,F₂群体中西瓜果肉非柠檬黄色与柠檬黄色的分离比符合3∶1的孟德尔分离比例,Ⅰ BC₁P₂、Ⅱ BC₁P₂回交群体果肉非柠檬黄色和柠檬黄色分离比符合1∶1,表明西瓜果肉柠檬黄色对白色为隐性性状。通过对BSA-seq Ⅰ和BSA-seq Ⅱ数据进行SNP和InDel关联分析,将控制西瓜果肉柠檬黄色的主效位点定位在6号染色体24.00—24.61 Mb的区域内,该区域内共有70个基因。结合西瓜参考基因组注释信息及qRT-PCR表达量分析,最终得到5个与西瓜果肉柠檬黄色有关的基因,其中Cla97C06G121680、Cla97C06G121700和Cla97C06G121890均与叶绿体的形成和叶绿体结构大小有关,这3个基因通过干预有色体的形成影响西瓜果肉颜色;Cla97C06G121910是一种响应乙烯合成的AP2转录因子,与果实成熟密切相关,通过影响果实成熟造成果肉中类胡萝卜素的积累;Cla97C06G122090具有跨膜转运作用,在类胡萝卜素的跨膜运输中起作用。【结论】西瓜白色和柠檬黄色果肉中主要色素为紫黄质和叶黄素,且柠檬黄色果肉中的色素积累量显著高于白色果肉。西瓜果肉柠檬黄色对白色为隐性性状。BSA-seq分析将调控西瓜果肉柠檬黄色形成的一个主效位点定位于6号染色体24.00—24.61 Mb区间内,推测Cla97C06G121680、Cla97C06G121700、Cla97C06G121890、Cla97C06G122090、Cla97C06G121910是与西瓜果肉柠檬黄色形成相关的候选基因。     

利用高密度SNP对猪血糖和糖基化血清蛋白性状的全基因组关联分析

【目的】测定苏太猪和白色杜洛克×二花脸F₂资源家系240 d血糖（glucose,GLU）和糖基化血清蛋白（glycosylated serum proteins,GSP）浓度,采用全基因组关联分析定位影响GLU和GSP的染色体位点,为最终鉴别影响该性状的因果基因奠定基础,同时为人类低血糖症和糖尿病的遗传学研究提供参考。【方法】分别将435头苏太猪和760头白色杜洛克×二花脸F2资源家系F₂个体在相同条件下饲养至240日龄进行统一屠宰,收集血液后分离血清,利用全自动生化分析仪测定GLU和GSP浓度。采集猪只耳组织提取DNA并测定DNA浓度。将质检合格的DNA样品利用Illumina porcine 60K SNP芯片判定基因型。运用PLINK软件对SNP判型结果进行质控,将合格的SNP标记用于后续的关联性分析,利用广义混合线性模型及R语言GenABEL软件包进行全基因组关联分析,定位影响苏太猪和白色杜洛克×二花脸F₂资源家系240 d血清GLU和GSP含量的染色体位点。根据全基因组关联分析结果从Ensembl或NCBI网站上分析可能的位置候选基因。【结果】全基因组关联分析共检测到5个与血清GLU和GSP达染色体显著水平相关的SNP位点。其中白色杜洛克×二花脸F₂资源群体在10号染色体（SSC10）24.67Mb处定位到与血清GSP含量显著相关的SNP（ALGA0057739,P=1.58×10^-5）,解释表型变异为3.72%。苏太猪群体共检测到2个与血清GSP显著相关的SNP（ALGA0108699和DRGA0017552,P=1.45×10^-5）,解释表型变异均为3.72%。使用猪参考基因组序列（10.2版本）,无法定位到具体的染色体位置。通过人、猪比较基因组分析,这两个SNP都位于SSC8,距STPG2基因3’端约180.0-193.0 kb。将两个群体进行Meta分析,未发现新的与GSP显著相关的SNP;在1号染色体250.32Mb处（DRGA0002016,P=2.48×10^-5）和14号染色体43.97Mb处（ASGA0062984,P=1.29×10^-5）,定位到与血清GLU显著相关的SNP。通过搜寻显著相关SNP所在染色体区域内的注释基因,发现ASPM、TRPM3和KCTD10 等基因是影响血清GSP和GLU的重要候选基因。【结论】检测到5个显著影响猪血清GLU和GSP的SNP位点。这些SNP位点所处染色体区域内的ASPM、TRPM3、STPG2和KCTD10基因是影响血清GSP和GLU的重要候选基因。     

小麦籽粒超氧化物歧化酶（SOD）活性全基因组关联分析

【目的】小麦籽粒超氧化物歧化酶活性对小麦面粉色泽和营养品质具有重要影响,挖掘与小麦籽粒超氧化物歧化酶（superoxide dismutase,SOD）活性显著关联位点及候选基因,为揭示小麦籽粒SOD活性的遗传机理和小麦面粉色泽的遗传改良奠定基础。【方法】采用氮蓝四唑（nitro-blue tetrazolium,NBT）光化还原法对3个环境下种植的212份普通小麦品种（系）进行SOD活性检测,结合90K SNP芯片的16 705个高质量SNP标记对小麦籽粒SOD活性进行全基因组关联分析（genome-wide association study,GWAS）,并对稳定遗传的显著关联位点进行候选基因的挖掘。【结果】不同环境下,各小麦品种（系）间的SOD活性表现出丰富的表型变异,变异系数为4.34%—5.23%,相关系数介于0.60—0.90（P<0.001）。多态性信息含量（polymorphic information content,PIC）为0.24—0.29。全基因组连锁不平衡（linkage disequilibrium,LD）衰减距离为7 Mb。群体结构分析表明,供试材料可分为3个亚群。GWAS分析结果显示,共检测到29个与SOD活性显著关联位点（P≤0.001）,分布在1A、1B、2A、2B、2D、3B、3D、4B、4D、5A、5B、5D、6A、6B、6D和7B染色体上,单个位点可解释5.47%—32.43%的表型变异,其中14个位点在2个及以上环境下均被检测到。9个显著关联位点在3个环境下被同时检测到,分布于1B、2B、4B、5A、5B、6B和6D染色体,贡献率为6.21%—16.62%。对稳定遗传的显著关联位点进行候选基因的挖掘,共挖掘TraesCS2B01G567600、TraesCS3D01G069900、TraesCS3D01G070200、TraesCS5B01G525700、TraesCS5B01G373700、TraesCS6A01G021400和TraesCS6D01G431500等7个SOD基因和TraesCS5A01G263500、TraesCS6B01G707800等2个与SOD活性相关的候选基因,候选基因的功能主要与抑制细胞活性氧积累及参与抗氧化剂再生过程有关。【结论】检测到与小麦籽粒SOD活性显著关联的29个SNP位点,共筛选出7个SOD基因和2个与SOD活性有关的候选基因。     

厚皮甜瓜心部果肉蔗糖含量QTL定位及候选基因分析

【目的】运用QTL分析厚皮甜瓜心部果肉蔗糖含量,挖掘影响该性状的候选基因,为厚皮甜瓜甜味性状的遗传改良奠定理论基础。【方法】以高糖材料VZX(V醉仙)为母本和低糖材料HP(高代自交系)为父本杂交衍生的F₂群体为研究对象,利用高效液相色谱仪测定果实赤道位置心部果肉蔗糖含量,从F₂群体中挑选蔗糖含量极端高和极端低的单株各20个,分别构建高蔗糖池和低蔗糖池,对双亲及混合池均进行全基因组重测序(约20×覆盖深度),定位蔗糖性状的关联区间,并结合生物信息学分析候选基因。【结果】厚皮甜瓜心部果肉蔗糖含量在F₂群体中基本呈正态分布,符合典型的数量性状遗传特征;对双亲及混池进行全基因组重测序,共获得有效数据32.62 G,Q20在95%以上,平均覆盖深度为17.76,比对到参考基因组上的总reads数目比例在98.72%~99.02%,测序数据质量高,参考基因组选择合理有效;在8号染色体定位到1个3.29 Mb的区间,共注释到108个基因;在初定位区间内获得1个参与糖酵解和糖异生生化过程的候选基因EVM0000647,在高糖和低糖亲本间编码区无非同义突变,但启动子区域具有大量差异位点,且表达量具有明显差异。【结论】极端混池测序(BSA)方法,在8号染色体上定位到1个影响厚皮甜瓜心部果肉蔗糖含量的QTL,大小为3.29 Mb,共注释到108个基因,其中候选基因EVM0000647,通过差异表达负调控厚皮甜瓜心部果肉蔗糖的积累。     

鲜食葡萄果实单萜合成关键基因的eQTL分析

【目的】通过对鲜食葡萄果实单萜合成关键基因进行eQTL定位及候选基因挖掘,深入了解单萜合成调控机制,为优良玫瑰香味葡萄新品种培育及种质改良奠定基础。【方法】以‘摩尔多瓦’ב瑞都香玉’F₁代群体及亲本为供试材料,分别在转色期和成熟期采集葡萄果实样品;利用实时荧光定量qPCR技术对7个单萜合成途径基因（VvDXS1、VvDXS3、VvDXR、VvHDR、VvLiner、VvTerp和VvGermD）的表达量进行检测获得表达性状表型数据;基于区间作图法,采用MapQTL6.0软件,对单萜基因表达性状进行eQTL定位分析;将eQTL连锁标记定位到基因组区域,通过Ensembl Plants和NCBI数据库进行基因注释;利用葡萄全基因组芯片技术检测不同发育时期亲本果实样品中候选基因的表达谱。【结果】7个单萜合成基因表达量在F₁代群体中呈现连续分布数量遗传特征;各个单萜基因表达之间具有显著的相关性;在转色期,7个表达性状一共定位到13个eQTL,主要位于1号、6号、14号、16号、17号、10号和12号等染色体上,表型解释率介于12.2%—23.5%。其中位于14号染色体的eQTL（qDXS1-v14、qHDR-v14-1和qTerp-v14）覆盖相同的遗传区间57.582—76.979 cM,qLiner-v10、qTerp-v10和qGermD-v10共定位到10号染色体相同的遗传区间;在成熟期,共检测到16个eQTL,主要位于1号、6号、12号、8号、13号和19号等染色体。qDXS1-m6-2、qDXR-m6-2、qLiner-m6和qGermD-m6共定位到6号染色体139.212—143.161 cM遗传区间;针对成熟期与转色期各个基因的表达量比值变化进行定位分析,共检测到18个eQTL,分别位于1号、3号、7号、10号、12号、15号和19号等染色体。定位于12号染色体的qDXS1-r12-1、qDXR-r12-1、qHDR-r12、qLiner-r12和qGermD-r12覆盖相同的遗传区间6.330—6.967 cM。对多个基因表达性状共定位的eQTL区域进行基因注释,共筛选到90个转录因子基因,表达谱及相关性分析最终确定11候选基因。其中4个候选基因（VIT_06s0009g01380、VIT_14s0006g02290、VIT_12s0028g01170和VIT_15s0046g00290）与激素信号通路调控相关,一个候选基因（VIT_12s0028g01110）编码光敏色素作用因子与光响应相关,还有一些编码Myb类、WRKY类转录因子或者未知功能蛋白基因。【结论】在两个不同的生长发育期共检测到37个与单萜合成基因表达性状连锁的eQTL,主要定位于6号、10号、12号和14号染色体。基于基因注释和表达谱分析结果,确定了包含VIT_06s0009g01380和VIT_14s0006g02290在内的11个可能的候选基因,这些候选基因与多个单萜基因表达高度相关。     

84个苹果栽培品种对斑点落叶病的抗性评价和全基因组关联分析

【目的】斑点落叶病是中国苹果产区发生的主要病害之一,严重影响苹果的产量和品质。本研究旨在发掘具有高抗病性的苹果栽培品种和探寻调控斑点落叶病抗性的关键基因,为苹果品种改良提供科学依据。【方法】利用苹果斑点落叶病菌（Alternaria alternata f. sp. mali）对84份苹果栽培品种进行离体叶片接种鉴定,从病斑面积和病斑面积增长率两方面进行聚类分析,评价苹果栽培品种对斑点落叶病的抗性。用接种后叶片的病斑面积作为表型性状,以全基因组深度重测序获得的1 243 071个高质量SNP位点为遗传标记,采用EMMAX方法进行全基因组关联分析。【结果】84份苹果栽培品种接种后统计病斑面积发现,不同的苹果栽培品种在对斑点落叶病的抗病性方面表现出显著的多样性,其中感病和中抗的品种占绝大多数,而高抗和高感的品种占比较少;苹果斑点落叶病抗病性具有正态分布特征,呈现数量性状遗传特征。全基因组关联性状分析最终获得6个SNP位点呈现显著水平P≤0.0000001（-LgP≥7）,深入分析将其关联到7个关键候选基因,包括整合素连接蛋白激酶、FMN连锁氧化还原酶、B-box型锌指蛋白、GATA型转录因子等,并验证了整合素连接蛋白激酶在苹果抗病中的作用。【结论】经过两年数据的综合分析,最终从84个苹果栽培品种里,鉴定到稳定抗性品种7份,稳定易感品种2份。通过全基因组关联性状分析鉴定到与苹果斑点落叶病抗病性显著相关的6个SNP位点,关联到7个关键候选基因,并验证了其中一个基因的功能。     

柱状苹果Co基因的筛选与候选基因分析

【目的】柱状苹果是一种特殊的矮生突变类型,其节间短、短枝多、侧生分枝少、主干粗壮直立,是苹果实行矮化密植栽培的重要资源。本研究在前期Co精细定位的基础上,对定位区间的基因进行筛选,为阐明柱状苹果形成的分子机制和选育柱状苹果新品种奠定基础。【方法】以柱状苹果‘舞佳’和‘润太一号’,普通型苹果‘富士’和‘华硕’的芽、茎尖和叶片为试材,根据最新的苹果基因组以及与柱状相关的转录组信息,对Co精细定位区间27.66—29.05 Mb的基因进行注释分类,选择目标基因,查找其CDS序列,使用RT-PCR技术检测引物特异性,利用实时荧光定量PCR分析预测基因在不同组织器官中的表达特征,筛选出差异基因并将其作为候选基因。【结果】在苹果第10号染色体27.66—29.05 Mb区域内包含67个基因,其中12个为非编码RNA（ncRNA）,其余为编码蛋白质的基因。根据RNA-seq分析,柱状和普通型苹果基因相对表达差异倍数在1倍以上的有25个基因,其中13个基因在柱状苹果中上调表达,12个基因在柱状苹果中下调表达。在预测的14个基因中,发现4个基因MD10G1184100、MD10G1185400、MD10G1185600和MD10G1190500在柱状和普通型苹果的主枝茎尖或侧枝茎尖中相对表达存在显著差异。其中,MD10G1184100和MD10G1185600在两个柱状苹果主枝茎尖中的相对表达量均显著高于两个普通型苹果。MD10G1185400和MD10G1190500在两个柱状苹果侧枝茎尖的表达量显著高于两个普通型苹果,而MD10G1184100在两个柱状苹果中的表达量显著低于普通型苹果。进一步对这4个候选基因进行不同组织或器官的基因表达特征进行分析,发现基因MD10G1184100在柱状苹果根部的表达显著高于其他部位,MD10G1185400和MD10G1185600在柱状苹果的侧枝茎尖中显著高表达,而MD10G1190500在柱状苹果的顶芽中显著高表达。【结论】在柱状和普通型苹果茎尖中筛选到4个表达显著差异的基因,可作为Co候选基因,为该基因的克隆和功能验证及苹果树树型定向遗传改良奠定了基础。     

盐生植物盐爪爪液泡膜钠氢反向运输载体基因(KfNHX1)遗传转化拟南芥的耐盐性鉴定

【目的】 研究盐爪爪液泡膜Na⁺/H⁺反向运输载体KfNHX1 (AY825250) 基因的耐盐功能,为耐盐育种提供候选基因。【方法】 采用农杆菌介导花序浸染的方法,将KfNHX1转入拟南芥中,结合基因组PCR和RT-PCR方法鉴定符合3∶1分离比的转基因株系;利用在盐胁迫下的萌发率、根长和表型分析,结合原子吸收分光光度计法测定叶片的Na⁺、K⁺含量,推断其耐盐性。【结果】 对抗生素筛选符合3∶1的转基因纯合株系进行基因组PCR和RT-PCR分析,证实KfNHX1基因在拟南芥基因组中整合和表达。盐胁迫下转基因株系的拟南芥种子的萌发率和根长明显高于野生型。200 mM NaCl胁迫处理15 d的拟南芥成苗,相较野生型叶片萎黄和死亡,转基因植株的生长表型较好,且积累了较高的Na⁺和K⁺。外源ABA的处理下,转基因植株的发芽率和生长表型也好于野生型。【结论】 盐爪爪(Kalidium foliatum)是一种藜科(Chenopodiaceae)盐生灌木,对盐的耐受性很强。液泡膜Na⁺/H⁺反向运输体(NHX)是在离子稳态中起重要作用的膜蛋白,通过调节胞间离子的跨膜转运来维持细胞内离子和pH平衡。盐生植物盐爪爪KfNHX1能够提高转基因拟南芥的耐盐性,具有提高植物耐盐性的潜力。     

5个生姜品种对淹水胁迫的生理响应及耐涝性评价

【目的】探究淹水胁迫对生姜苗期形态变化及生理指标的影响，筛选耐涝种质资源，为生姜耐涝机理研究及抗涝品种选育提供参考。【方法】以生姜主产区的5个主栽品种山东大姜、罗平小黄姜、竹根姜、贵州小黄姜、凤头姜为试验材料，设置正常水分处理（CK）和淹水处理（TR），测定不同处理条件下的生长指标、生理指标及叶绿素荧光参数，利用隶属函数法对5个品种苗期的耐涝性进行综合评价。【结果】与CK相比，淹水胁迫下各生姜品种的株高、茎粗和根系活力均下降；生姜叶片的MDA和H₂O₂含量均显著上升（P<0.05，下同）， SOD和POD活性在竹根姜中呈下降趋势，在其他4个品种中均呈上升趋势， CAT活性在山东大姜中呈上升趋势，在其他4个品种中均呈下降趋势， PAL活性在竹根姜和凤头姜中呈下降趋势，在其他3个品种中均呈上升趋势。淹水后5个品种的PSII最大光化学效率 （F_v/F_m）和光化学淬灭系数（qP）显著降低，非光化学淬灭系数（NPQ）显著升高。综合评价结果表明， 5个品种生姜的耐涝性排序依次为山东大姜>贵州小黄姜>罗平小黄姜>凤头姜>竹根姜。相关分析结果显示，株高与综合评价值 （D值）呈极显著正相关（P<0.01，下同），茎粗与D值呈显著正相关，叶片MDA含量与D值呈极显著负相关。【结论】生姜通过维持较高的根系活力，提高自身抗氧化能力来抵御氧化损伤。5个品种中山东大姜耐涝性最强，竹根姜耐涝性最差。株高、茎粗和叶片MDA含量可作为生姜耐涝品种筛选的主要参考指标。     

陆地棉COR基因在低温胁迫下的表达分析及功能鉴定

【目的】分析低温胁迫条件下陆地棉中COR家族成员的表达特性,研究参与低温胁迫信号途径的COR基因。【方法】通过Real-time PCR分析低温胁迫条件下,陆地棉COR基因家族成员的表达情况,利用VIGS技术鉴定响应低温胁迫的COR基因功能。【结果】对8个COR基因家族成员在低温条件下的表达分析显示,基因序列号为Gh_D12G0215的COR基因受低温诱导表达水平不断上调,并在处理48 h后表达量较对照上调了近9倍;与之相反,基因序列号为Gh_D06G0147的COR基因在低温诱导3 h左右表达水平出现短暂的上调,但随后其表达受到显著抑制。其余COR基因家族成员的表达受低温胁迫表达水平发生改变,但是随着胁迫时间的增加,转录水平与对照无明显差异。利用VIGS技术在棉花中沉默候选COR基因Gh_D12G0215,并将基因沉默后的棉苗与对照共同进行低温胁迫处理,在相同的处理条件下,Gh_D12G0215基因沉默后的植株与对照相比,对低温胁迫更为敏感,基因序列号为Gh_D12G0215的COR基因可能参与棉花耐低温的调控。【结论】在低温胁迫条件下,陆地棉中部分COR基因的表达受低温胁迫诱导,在陆地棉受到低温胁迫时发挥功能。     

基于二代测序的甘蓝型油菜白花基因候选区间定位及连锁标记验证

【目的】近几年随着观光农业的兴起,花色的选育和改良已成为甘蓝型油菜种质资源鉴定和材料创制的重要研究方向。以甘蓝型油菜黄白花分离F₂群体为研究对象,通过二代测序技术,对白花性状基因候选区间定位,开发与白花性状连锁的分子标记,为定位白花候选基因和选育白花新材料提供新思路。【方法】以甘蓝型油菜DH纯系黄花Y05和甘蓝型油菜纯系白花W01杂交,观察F₁和F₂群体的花色分离,分析白花性状遗传模式。在F₂群体中选取30株纯白花和30株纯黄花构建DNA叶片子代池和RNA花瓣子代池,对亲本和DNA叶片子代池进行30×重测序,对RNA花瓣子代池进行5×测序。以法国甘蓝型油菜Darmor-bzh、中双11、Darmor、Tapidor为参考序列,重测序QTL-seq分析流程计算2个DNA子代池的SNP-index和delta（SNP-index）。利用R包画出SNP-index和delta（SNP-index）滑窗分析图,鉴定候选区间。转录组MMAPPR分析流程以法国甘蓝型油菜Darmor-bzh为参考序列,计算SNP频率,ED ⁴（Loess fit）检测峰值和鉴定候选区间。利用MISA进行重复序列鉴定,使用Prime3在候选区间进行SSR引物设计,在F₂群体中采用聚丙烯酰胺凝胶电泳方法对SSR引物进行筛选。【结果】甘蓝型油菜黄花与白花杂交F₂群体中,白花和黄花性状分离比符合3﹕1,暗示白花性状受1对显性主效基因控制。全基因组重测序区间定位结果显示,白花性状基因候选区间在Darmor-bzh C03染色体52—55 Mb。同时以甘蓝型油菜中双11、Darmor、Tapidor分别为参考序列,均鉴定出白花基因候选区间在C03染色体上的一致性和稳定性。转录组测序定位白花性状基因位于Darmor-bzh C03染色体54—55 Mb。转录组测序和重测序定位染色体结果高度一致。在此区间内MISA和Primer3结合设计SSR引物,聚丙烯酰胺凝胶电泳筛选到6个与白花性状紧密连锁共分离的SSR标记。6个SSR标记区间范围在760 kb（52.81—53.57 Mb）。此候选区间与甘蓝、白菜共线性分析,对应白菜A02染色体56.76—57.40 Mb区间,对应甘蓝C03染色体10.99—11.28 Mb区间。【结论】甘蓝型油菜白花性状由1对显性主效基因控制。白花性状基因候选区间在法国甘蓝型油菜Darmor-bzh C03染色体52—55 Mb区间内。此区间760 kb范围内筛选出6个与白花性状基因紧密连锁共分离的SSR标记。     

5个桃砧木品种对淹水胁迫的生理响应及耐涝性评价

【目的】探究不同品种桃树砧木对淹水胁迫的生理响应及耐涝性，为桃耐涝砧木品种选育及抗涝机理提供理论依据。【方法】以毛桃、抗砧1号、浙砧1号、筑波6号、南京白沙5个桃砧木当年生实生苗为供试材料，设正常水分（对照，CK）和淹水处理，测定叶片的光合特性、抗氧化酶活性、光合色素及渗透调节物质含量等指标，综合评价砧木耐涝性。【结果】淹水处理下，各砧木叶片的净光合作用（Pn）和蒸腾速率（Tr）均显著低于CK（P<0.05，下同）；抗砧1号、筑波6号和毛桃叶片的气孔导度（Gs）较CK显著降低；浙砧1号的胞间二氧化碳浓度（Ci）较CK显著下降，其他品种不同程度上升。筑波6号、抗砧1号、南京白沙和毛桃的叶绿素a（Chl a）和类胡萝卜素（Car）含量较CK显著下降。浙砧1号的超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、脯氨酶（Pro）和可溶性蛋白（SP）含量较CK显著提高，丙二酶（MDA）含量显著低于CK；毛桃的过氧化物酶（POD）、CAT及Pro活性显著提高，而SOD活性和（SP）含量显著下降。各种砧木的POD、CAT和Pro的耐涝系数均大于100.00%，Pn、Tr、Chl a、Chl b和Car的耐涝系数均小于100.00%。利用主成分及隶属函数等多元统计方法对15个指标耐涝系数进行综合分析，浙砧1号综合耐涝评价值D值最大，为0.760，表现出较强的耐涝性，其次为南京白沙、筑波6号和抗砧1号，耐涝性中等，毛桃D值最小，为0.091，耐涝性最弱。【结论】淹水胁迫不同程度抑制了砧木叶片光合作用和光合色素合成，各砧木在胁迫下调节体内渗透物质和抗氧化酶能力不同，耐涝性存在差异。在涝害频发的区域应避免桃园积水并采用耐涝性较好的砧木品种。     

马铃薯红色薯肉调控基因的精细定位与候选基因分析

【目的】薯肉颜色是马铃薯重要的农艺性状,它直接影响马铃薯的营养和商品价值,一直是马铃薯遗传研究和育种改良的重要目标。本研究通过对二倍体红色薯肉分离群体的混池分析、基因精细定位和候选基因表达分析,确定调控红色薯肉的候选基因,为下一步基因功能、遗传调控研究及彩色马铃薯的分子育种奠定基础。【方法】本研究通过向二倍体红色薯肉亲本导入自交不亲和抑制基因Sli获得BC₁S₁群体,从300个单株中挑选18株红色薯肉和21株黄色薯肉个体提取基因组DNA,分别测序进行混池分析。通过集团分离分析法（bulked segregation analysis,BSA）对基因进行初步定位;在定位区间内开发分子标记,对796份BC₁S₁植株进行基因型分析,筛选交换单株,并结合表型对基因进行精细定位;借助参考基因组注释信息和qRT-PCR表达量分析确定候选基因。【结果】本研究通过构建薯肉颜色分离的二倍体BC₁S₁群体,利用BSA-seq分析把调控薯肉花青素合成的主效位点定位在第10号染色体48.70—52.20 Mb。最终,利用分子标记将该基因定位于51.47—51.85 Mb的377 kb区间内。基于参考基因组注释信息,此区间包括5个基因,其中2个基因注释为MYB类转录因子,结合表达量数据推测这2个基因为候选基因,编号分别为PGSC0003DMG400013966、PGSC0003DMG400013965。【结论】本研究将调控马铃薯薯肉花青素积累的一个主效位点定位于第10号染色体51.47—51.85 Mb之间,推测PGSC0003DMG400013966和PGSC0003DMG400013965为候选基因。     

辣椒CaHsfA2上游转录因子的筛选及耐热功能分析

【背景】辣椒作为一种在世界范围内普遍栽培的蔬菜,具有喜温不耐热的特性。随着近些年极端高温天气出现日渐频繁,热胁迫已经成为影响辣椒生产的主要环境因素之一,明确辣椒的耐热机制进而培育耐热品种对辣椒生产具有重要的意义。【目的】热激转录因子HsfA2在植物耐热性中发挥重要作用,筛选辣椒CaHsfA2上游的转录因子,并分析后者在辣椒耐热性形成中的作用,为进一步阐明辣椒耐热分子机制提供理论依据。【方法】以CaHsfA2起始密码子上游的955 bp启动子序列为诱饵,利用酵母单杂交（Y1H）技术,筛选CaHsfA2的上游转录因子,并通过Y1H点对点杂交、双荧光素酶报告系统（Dual-Luciferase）与萤火素酶互补技术（LCA）进一步验证二者之间的互作关系。利用qRT-PCR技术分析热胁迫下CaHsfA2上游转录因子在辣椒耐热品系‘R9’中的动态表达模式;利用基因瞬时表达技术分析上游转录因子的亚细胞定位;利用病毒诱导的基因沉默技术（VIGS）分析CaHsfA2上游转录因子的耐热功能。【结果】筛选获得了CaHsfA2上游转录因子CaBES1,验证了二者的互作关系,通过分析双荧光素酶报告系统的结果及CaBES1沉默辣椒植株中CaHsfA2的表达量发现,转录因子CaBES1对CaHsfA2具有转录抑制作用。亚细胞定位结果表明,CaBES1在细胞膜和细胞核上均有表达,热胁迫处理后细胞核内的荧光信号增强,符合其发挥生物学功能时由细胞质向细胞核转移的特性;动态表达模式分析表明,热胁迫下,CaBES1表达水平呈现先降低后升高的变化趋势,这也说明CaBES1可以响应热信号,为下一步对其耐热功能研究提供了支撑。辣椒CaBES1被沉默后,通过对比分析沉默植株和对照植株的表型、相对电导率、叶绿素含量等指标发现,CaBES1的沉默表达提高了CaHsfA2表达量并增强了辣椒的耐热性。【结论】CaBES1通过负调控CaHsfA2表达而抑制辣椒的耐热性。     

不同苹果砧木实生苗对盐碱复合胁迫的生理响应

【目的】综合评价不同苹果砧木的耐盐碱性,筛选适合新疆南疆盐碱土壤栽培的苹果砧木。【方法】以湖北海棠、小金海棠、八棱海棠、平邑甜茶、野苹果、白海棠、山定子7个4年生苹果砧木为材料,将NaCl、Na₂SO₄、NaHCO₃、Na₂CO₃按1∶9∶9∶1的比例混合,采用盆栽浇灌1/2 Hoagland营养液,模拟浓度为0、15、30、45、60 mmol/L的盐碱复合胁迫,测定7个苹果砧木在盐碱复合胁迫下叶片的叶绿素含量、相对电导率、脯氨酸含量等5项生理指标,利用隶属函数法综合评价各砧木的耐盐性。【结果】随着胁迫强度的增大,各砧木叶片叶绿素含量不断减小,相对电导率和脯氨酸含量总体呈上升趋势,可溶性总糖含量总体呈先上升后下降,可溶性蛋白含量呈先上升后下降和“升高—降低—升高”2种变化趋势。【结论】7种供试苹果砧木的耐盐碱能力由强到弱依次为八棱海棠>野苹果>平邑甜茶>小金海棠>山定子>白海棠>湖北海棠。